楊學芳 蘇萬福 吳 菲

（1.濟川藥業(yè)集團有限公司，江蘇 泰州 225441；2.揚子江藥業(yè)集團有限公司，江蘇 泰州 225321）

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang 的干燥果實，味甘、性涼，歸肺、大腸經，具有清熱潤肺、利咽開音、滑腸通便的功效［1］，作為衛(wèi)生部首批公布的藥食同源的中藥材之一，其素有“良藥佳果”之稱。羅漢果本身含有三萜苷類、黃酮類、多糖類、油脂類等多種化學成分，研究結果［2，3］表明，其具有潤肺止咳、潤腸通便、降糖調脂、保肝、抗氧化等多種藥理作用。臨床上多用于治療支氣管炎、肺炎、哮喘、高血壓病等疾病，此外還可防治冠心病、血管硬化、肥胖癥等。

羅漢果配方顆粒是以羅漢果飲片為原料，經現(xiàn)代制藥技術提取、濃縮、干燥、制粒而成的供臨床配方用的顆粒劑。與傳統(tǒng)湯劑相比，配方顆粒不但可以滿足醫(yī)生辨證論治、隨證加減的需求，還省去了每次煎煮的繁瑣步驟，并且方便保存和攜帶；對患者而言，因服用量少，故依從性也有較大改善［4，5］。雖然配方顆粒在臨床應用上有很多優(yōu)點，但其質量控制方面還處于不斷完善的過程［6］。目前已有報道的羅漢果配方顆粒的質量研究為薄層鑒別及單一含量的質量控制［7］，而從藥物整體進行的特征圖譜研究未見報道。本文采用高效液相色譜-電噴霧檢測（HPLC-CAD）法建立了基于標準湯劑［5，8］的羅漢果配方顆粒特征圖譜的檢測方法［9，10］，能夠對羅漢果配方顆粒的質量進行更為全面的控制和整體評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Thermo U3000高效液相色譜儀，四元泵，配置CAD 檢測器，Chromeleon 7.2 SR5 色譜工作站（賽默飛世爾科技有限公司）；SY8200-T 超聲波清洗機（上海聲源超聲波儀器設備有限公司）；XSE205DU 電子天平（METTLER TOLEDO）。

1.2 試藥羅漢果對照藥材（批號121020-201306）和羅漢果皂苷Ⅴ對照品（批號111754-201703）均購于中國食品藥品檢定研究院；羅漢果標準湯劑（自制，批號190322、190324、190326、20200820、20200821、20200822、20200823、20200824、20200825、200401、200402、200403、200404、200405、200406，前9 批飲片產地為廣西，后6批飲片產地為廣東）；羅漢果配方顆粒（自 制，批 號 1906013、2003013、2003023、2003033）。甲醇（默克股份兩合有限公司，批號I1082407013，每瓶4 L）、乙腈（默克股份兩合有限公司，批號JA089730，每瓶4 L）均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照藥材及對照品參照物溶液取羅漢果對照藥材1.0 g，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率720 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，作為對照藥材參照物溶液。另精密稱取羅漢果皂苷Ⅴ對照品10 mg，置100 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為對照品參照物溶液。

2.1.2 供試品溶液取本品適量，研細，取約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理（功率720 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗采用Agilent Po?roshell 120 HILIC-Z（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱；乙腈-甲醇（9∶1）為流動相A，水為流動相B，線性梯度洗脫（0～3 min，97%A；3～5 min，97%A→90%A；5～10 min，90%A；10～23 min，90%A→65%A；23～25 min，65%A→5%A；25～35 min，5%A；35～38 min，5%A→97%A；38～45 min，97%A）；流速為0.9 mL/min；柱溫為25 ℃；電噴霧檢測器（CAD），霧化溫度為35 ℃。對照品參照物溶液進樣10 μL，對照藥材參照物溶液及供試品溶液進樣5 μL。

2.3 精密度試驗取羅漢果配方顆粒1.0 g（批號1906013），按2.1.2 項方法制備供試品溶液，2.2 項色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6 次，記錄HPLC 色譜圖。以6號峰（羅漢果皂苷Ⅴ）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（RSD），其中相對保留時間RSD 為0.1%～0.2%，相對峰面積RSD 為1.0%～3.9%，表明該儀器精密度良好。

2.4 重復性試驗取羅漢果配方顆粒1.0 g（批號1906013），按2.1.2項方法制備6份供試品溶液，2.2項色譜條件分別進樣，記錄HPLC色譜圖，以6號峰（羅漢果皂苷Ⅴ）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，其中相對保留時間RSD 為0.1%～0.3%，相對峰面積RSD為1.2%～3.0%，表明該方法重復性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗取羅漢果配方顆粒1.0 g（批號1906013），按2.1.2 項方法制備供試品溶液，按2.2 項色譜條件分別于制備后的0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h進樣，記錄HPLC色譜圖，以6號峰（羅漢果皂苷Ⅴ）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD，其中相對保留時間RSD 為0.3%～1.0%，相對峰面積RSD 為1.6%～4.7%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.6 特征圖譜建立及共有峰的標定分別取羅漢果皂苷Ⅴ、羅漢果對照藥材、15 批標準湯劑及4 批羅漢果配方顆粒，按2.1.1、2.1.2 項方法制備對照品、對照藥材及供試品溶液，按2.2 項色譜條件進行測定，以6 號峰（羅漢果皂苷Ⅴ）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積，結果見表1、表2。

表1 15批羅漢果標準湯劑及4批顆粒各共有峰的相對保留時間

表2 15批羅漢果標準湯劑及4批顆粒各共有峰的相對峰面積

將15 批羅漢果標準湯劑及4 批配方顆粒的HPLC 圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版，以1906013 批為參照圖譜，通過多點校正及Mark 峰匹配進行分析，結果顯示，羅漢果配方顆粒特征圖譜有6 個共有峰，見圖1、圖2，其中峰6 為羅漢果皂苷Ⅴ。各批次間相似度均大于0.90，相似度良好。15 批標準湯劑、4批配方顆粒與對照指紋圖譜的相似度為0.996～1.000，見表3。

圖1 15批羅漢果標準湯劑及4批配方顆粒特征圖譜

圖2 羅漢果配方顆粒特征圖譜-對照圖譜

表3 15批羅漢果標準湯劑及4批顆粒相似度結果匯總

3 討論

3.1 特征峰的確認研究過程中，供試品色譜中呈現(xiàn)6個特征峰，選擇保留時間適中且為檢測指標成分的羅漢果皂苷Ⅴ作為S 峰。計算1～5 號峰與S 峰的相對保留時間，結合15 批湯劑及4 批配方顆粒成品6 個特征峰的相對保留時間范圍，其相對保留時間應在規(guī)定值的±10%范圍之內，規(guī)定值為：0.256（峰1）、0.328（峰2）、0.357（峰3）、0.483（峰4）、0.585（峰5）。

3.2 色譜柱的選擇羅漢果中含有皂苷、黃酮、多糖等多種成分［2，11，12］，且極性偏大，采用常規(guī)反相C18柱的分離模式，色譜峰較為集中，分離度不好，故建議采用親水相互作用色譜HILIC 模式進行分離［13］。本研究中選用Agilent Poroshell 120 HILIC-Z （100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱，為HILIC 兩性模式，各色譜峰保留時間適宜，分離度較好。

3.2 檢測器的選擇研究過程中，嘗試使用紫外檢測器，結果顯示各峰響應較低。后續(xù)更改為CAD 檢測器，基線平穩(wěn)、靈敏度高、峰形較好。CAD 是一種新型通用型檢測器，其響應不受化合物紫外吸收基團的影響，僅與分析物顆粒的質量有關，廣泛應用于各類小分子、大分子化合物，且對大多數(shù)化合物的響應一致，具有檢測限低、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好等優(yōu)點［14，15］，但由于其本身的設計為電噴霧式檢測器，故流動相中不可加入揮發(fā)性差的試劑，建議首選乙腈、甲醇、水等溶劑。

綜上所述，采用HPLC-CAD 法建立的特征圖譜檢測方法，可以用于羅漢果配方顆粒的質量控制，為羅漢果配方顆粒的全面質量研究和標準制定提供了技術支撐。