吳明鋒,韓曉艷,郭建磊,張士忠

缺血缺氧性腦損傷是新生兒較為常見(jiàn)的疾病,其臨床病死率高達(dá)75 %,也是目前新生兒死亡、小兒腦癱及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的主要原因,嚴(yán)重威脅新生兒生命健康[1]。研究[2]認(rèn)為,大腦缺血缺氧影響神經(jīng)突結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元極性,神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血缺氧性腦損傷的主要原因。因此,探究影響神經(jīng)系統(tǒng)損傷的分子機(jī)制并采取相應(yīng)的干預(yù)措施尤為重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類非編碼RNA,且lncRNA可靶向miRNA調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá),lncRNA/miRNA/靶基因這一調(diào)控途徑在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)控作用[3-4]。CRNDE是一種lncRNA,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示,CRNDE在低氧狀態(tài)下通過(guò)miR-181a/LYRM1軸調(diào)節(jié)心臟祖細(xì)胞的增殖和遷移,可為心肌梗死的治療提供分子靶點(diǎn)[5];CRNDE在膿毒癥大鼠肝組織和肝細(xì)胞中表達(dá)降低,上調(diào)其表達(dá)通過(guò)靶向抑制miR-126-5p并促進(jìn)BCL2的表達(dá)減輕膿毒癥大鼠肝損傷[6]。但目前,CRNDE對(duì)缺血缺氧性腦損傷的影響和作用機(jī)制還未明確。StarBase生物在線軟件預(yù)測(cè)顯示,CRNDE可能靶向調(diào)控miR-212-5p。有研究[7]顯示,miR-212-5p在腦皮質(zhì)損傷大鼠中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可靶向抑制Ptgs2來(lái)抑制肥大細(xì)胞死亡,改善腦皮質(zhì)損傷大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。本研究通過(guò)體外原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元,建立氧糖剝奪(OGD)誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型,旨在觀察CRNDE能否靶向miR-212-5p影響OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷,以期為缺血缺氧性腦損傷的治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 雄性SD大鼠,清潔級(jí),7日齡,體質(zhì)量10.30 ～13.16 g,河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SYXK(豫)2019-0003;胎牛血清(FBS),浙江天杭生物科技股份有限公司;DMEM培養(yǎng)基和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8),北京索萊寶科技有限公司;LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑,美國(guó)Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒,深圳晶美生物工程有限公司;PCR引物、CRNDE小干擾RNA(si-CRNDE)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)、CRNDE野生型質(zhì)粒(WT-CRNDE)和突變型質(zhì)粒(MUT-CRNDE)、miR-212-5p 模擬物(mimics)及對(duì)照序列(miR-NC)、miR-212-5p抑制劑(anti-miR-212-5p)及陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC),上海生工生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒,南京建成生物工程研究所;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)多克隆抗體,美國(guó)Santa Cruz公司;雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒,美國(guó)Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 參照文獻(xiàn)[2]方法分離培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元。SD大鼠脫頸椎處死取腦組織,分離大腦皮層,手術(shù)剪剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊,0.25%胰蛋白酶37 ℃消化25 min,終止消化,過(guò)200目濾網(wǎng),1 000 r/min離心5 min,棄上清液。加含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液,接種于0.01%多聚賴氨酸浸泡過(guò)夜的6孔培養(yǎng)板中,置于37 ℃、5% CO2、濕度97%培養(yǎng)箱(常規(guī)培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后,加含10% FBS、2% B27和1% L-谷氨酰胺的神經(jīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)。以后每3 d半量換液1次,培養(yǎng)至第7代時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。將神經(jīng)元以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中,采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-CRNDE、miR-NC、miR-212-5p mimics、共轉(zhuǎn)染si-CRNDE與anti-miR-NC、si-CRNDE與anti-miR-212-5p。轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h,然后更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞備用。

1.2.2 OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型建立 參照文獻(xiàn)[1]方法建立OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型。將神經(jīng)元接種于培養(yǎng)板中,培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)基,換為無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基,并置于37 ℃、5% CO2、95% N2、濕度97%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

1.2.3 細(xì)胞分組處理 未轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元分為Con組和OGD組,其中Con組神經(jīng)元用常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng),OGD組神經(jīng)元按照1.2.2進(jìn)行OGD處理。轉(zhuǎn)染si-NC、si-CRNDE、miR-NC、miR-212-5p mimics、共轉(zhuǎn)染si-CRNDE與anti-miR-NC、si-CRNDE與anti-miR-212-5p的神經(jīng)元均按照1.2.2進(jìn)行OGD處理,并分別記為OGD+si-NC組、OGD+si-CRNDE組、OGD+miR-NC組、OGD+miR-212-5p組、OGD+si-CRNDE+anti-miR-NC組和OGD+si-CRNDE+anti-miR-212-5p組。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)CRNDE和miR-212-5p表達(dá) 神經(jīng)元以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集神經(jīng)元。Trizol試劑提取神經(jīng)元中總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95 ℃5 min,95 ℃10 s,60 ℃30 s,72 ℃30 s,共35個(gè)循環(huán)。引物序列:CRNDE上游5′-AAA TTC ATC CCA AGG CTG GT-3′,下游5′-AAA CCA CTC GAG CAC TTT GA-3′;GAPDH上游5′-CTG ACT TCA ACA GCG ACA CC-3′,下游5′-GTG GTC CAG GGG TCT TAC TC-3′;miR-212-5p上游5′-GTC CAG ATC GTA GGC GC-3′,下游5′-GTC GGC TCT TAG GAG AGC TC-3′;U6上游5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,下游5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。2-△△Ct法計(jì)算CRNDE相對(duì)GAPDH、miR-212-5p相對(duì)U6的表達(dá)量。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)神經(jīng)元存活率 神經(jīng)元以1.0×104個(gè)/孔接種于96孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,加10 μL CCK-8試劑。孵育神經(jīng)元2 h后,酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)吸光度值(A),并計(jì)算神經(jīng)元存活率。存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.2.6 試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清液中LDH水平 神經(jīng)元以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集培養(yǎng)上清液,3 500 r/min離心10 min,保留上清液。參照LDH試劑盒說(shuō)明書,檢測(cè)上清中LDH活性,計(jì)算其漏出率。漏出率(%)=LDH活性實(shí)驗(yàn)組/LDH活性對(duì)照組×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 神經(jīng)元以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集神經(jīng)元。PBS清洗神經(jīng)元2次,參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)神經(jīng)元凋亡。

1.2.8 Western blotting法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 神經(jīng)元以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集神經(jīng)元。RIPA試劑提取神經(jīng)元中總蛋白,并用BCA法對(duì)蛋白定量。然后以每孔30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳,并將分離蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h后,分別置于Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)一抗孵育液中,4 ℃孵育過(guò)夜。再置于山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育液中,37 ℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影,WD-9413C型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)曝光拍照。

1.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將對(duì)數(shù)期的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中,采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CRNDE與miR-NC或miR-212-5p mimics、MUT-CRNDE與miR-NC或miR-212-5p mimics。轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h,然后更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞并裂解。然后參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明,檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CRNDE和miR-212-5p在OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中的表達(dá) 與Con組比較,OGD組CRNDE水平升高(P<0.01),miR-212-5p水平降低(P<0.01)(見(jiàn)表1)。

表1 CRNDE和miR-212-5p在OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中的表達(dá)

2.2 干擾CRNDE表達(dá)對(duì)OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響 與Con組比較,OGD組神經(jīng)元存活率降低(P<0.01),LDH漏出率升高(P<0.05),神經(jīng)元凋亡率升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.01)。與OGD+si-NC組比較,OGD+si-CRNDE組神經(jīng)元存活率升高(P<0.01),LDH漏出率降低(P<0.01),神經(jīng)元凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.01)(見(jiàn)圖1、2及表2)。

表2 干擾CRNDE對(duì)OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響

2.3 過(guò)表達(dá)miR-212-5p對(duì)OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響 與OGD+miR-NC組比較,OGD+miR-212-5p組神經(jīng)元存活率升高(P<0.01),LDH漏出率降低(P<0.01),神經(jīng)元凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.01)(見(jiàn)圖3、4及表3)。

表3 過(guò)表達(dá)miR-212-5p對(duì)OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響

2.4 敲減miR-212-5p逆轉(zhuǎn)干擾CRNDE表達(dá)對(duì)OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響 與OGD+si-CRNDE+anti-miR-NC組比較,OGD+si-CRNDE+anti-miR-212-5p組神經(jīng)元存活率降低(P<0.01),LDH漏出率升高(P<0.01),神經(jīng)元凋亡率升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.01)(見(jiàn)圖5、6及表4)。

表4 敲減miR-212-5p逆轉(zhuǎn)干擾CRNDE對(duì)OGD誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響

2.5 CRNDE靶向負(fù)調(diào)控miR-212-5p表達(dá) CRNDE與miR-212-5p的核苷酸序列見(jiàn)圖7。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CRNDE與miR-212-5p mimics的神經(jīng)元熒光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CRNDE與miR-NC的神經(jīng)元(0.35±0.03 vs 0.98±0.04,t=37.80,P<0.01),而共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CRNDE與miR-212-5p mimics的神經(jīng)元熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CRNDE與miR-NC的神經(jīng)元熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.99±0.05 vs 1.00±0.04,t=0.47,P>0.05)。同時(shí)轉(zhuǎn)染si-CRNDE的神經(jīng)元中miR-212-5p水平高于轉(zhuǎn)染si-NC的神經(jīng)元(2.88±0.24 vs 1.03±0.07,t=22.20,P<0.01)。

3 討論

作為一種lncRNA,CRNDE參與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示,CRNDE在肝癌[8]、前列腺癌[9]和宮頸癌[10]等腫瘤中的表達(dá)明顯增加,促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。YANG等[11]研究顯示,CRNDE在硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織和結(jié)腸上皮細(xì)胞系HT-29、LOVO和Caco-2中均表達(dá)升高,干擾其表達(dá)可靶向上調(diào)miR-495并下調(diào)SOCS1抑制了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡,其可能是炎性腸病的新治療靶標(biāo)。SUN等[12]研究顯示,敲減CRNDE可通過(guò)阻斷TLR3 /NF-κB途徑降低敗血癥誘導(dǎo)的急性腎損傷,CRNDE有望成為敗血癥相關(guān)急性腎損傷的臨床治療靶標(biāo)。但目前,CRNDE對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的影響和機(jī)制還未知。

LDH是一種糖酵解酶,主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受損時(shí),細(xì)胞膜通透性增加,LDH立即釋放至細(xì)胞外。因此,細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH活性的高低是反映細(xì)胞受損程度的靈敏性指標(biāo)[13]。本研究顯示,大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)氧糖剝奪處理后,細(xì)胞活性降低,凋亡加劇,LDH漏出率顯著升高,與張璟璇等[14]報(bào)道的結(jié)果一致,表明氧糖剝奪致大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷模型建立成功。本研究顯示,氧糖剝奪促進(jìn)了大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中CRNDE的表達(dá),而干擾CRNDE表達(dá)促進(jìn)了氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元增殖,且抑制了神經(jīng)元凋亡及LDH漏出率,說(shuō)明干擾CRNDE表達(dá)減輕了氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷。細(xì)胞凋亡是一種受多種基因調(diào)控的程序性死亡過(guò)程。Bcl-2和Bax參與調(diào)控細(xì)胞凋亡,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加抑制細(xì)胞凋亡,而促凋亡蛋白表達(dá)增加則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15-16]。本研究顯示,干擾CRNDE表達(dá)抑制了氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中Bax蛋白的表達(dá),而促進(jìn)了Bcl-2蛋白的表達(dá),進(jìn)一步說(shuō)明干擾CRNDE表達(dá)抑制了氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡,減輕了氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷。

miR-212-5p基因定位于人17號(hào)染色體,與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如,miR-212-5p靶向抑制c-Myc表達(dá)降低TGF-β1和Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖及膠原形成,改善心肌梗死小鼠的心臟功能[17]。miR-212-5p可靶向抑制SIRT2減少多巴胺能神經(jīng)元丟失和DAT降低,減輕神經(jīng)損傷,miR-212-5p/SIRT2軸為帕金森病的治療提供了新靶點(diǎn)[18]。本研究顯示,過(guò)表達(dá)miR-212-5p增強(qiáng)了氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元增殖活性,且抑制了神經(jīng)元凋亡,降低了細(xì)胞LDH漏出率,表明過(guò)表達(dá)miR-212-5p減輕了氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷。lncRNA可發(fā)揮miRNA分子海綿作用影響miRNA靶基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用[19]。為了研究CRNDE影響氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的分子機(jī)制,本研究首先利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及檢測(cè)干擾CRNDE對(duì)miR-212-5p表達(dá)的影響,證實(shí)了CRNDE在大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中靶向負(fù)調(diào)控miR-212-5p表達(dá),這與氧糖剝奪促進(jìn)了大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中CRNDE的表達(dá),而降低了miR-212-5p表達(dá)的結(jié)果一致;此外,敲減miR-212-5p逆轉(zhuǎn)了干擾CRNDE對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元增殖、凋亡及LDH漏出率的影響,提示CRNDE通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-212-5p來(lái)影響氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷,但是CRNDE具體調(diào)控的miR-212-5p的靶基因還有待進(jìn)一步探究。

綜上,氧糖剝奪處理的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中CRNDE表達(dá)升高,干擾CRNDE表達(dá)促進(jìn)了氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元增殖,并抑制了神經(jīng)元凋亡及LDH漏出率,減輕了神經(jīng)元損傷,這可能與CRNDE靶向負(fù)調(diào)控miR-212-5p有關(guān),CRNDE/miR-212-5p軸可能為缺血缺氧性腦損傷的治療提供了新的分子靶點(diǎn)。但本研究尚未對(duì)miR-212-5p的靶基因進(jìn)行探究,尚需更深一步探究CRNDE作用的miR-212-5p的靶基因在氧糖剝奪處理的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷中的作用;同時(shí),本研究?jī)H利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了探究,還需進(jìn)一步建立動(dòng)物模型,在體內(nèi)觀察CRNDE/miR-212-5p/靶基因這一信號(hào)通路對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的影響。