王欣麗 甄娜 楊海龍

(衡水市人民醫(yī)院,河北 衡水 053000)

腦小血管病發(fā)病隱匿,輕者可表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙,重者可發(fā)展為腔隙性腦梗死、腦出血、腦卒中〔1,2〕,其發(fā)病機(jī)制與各種原因引起的內(nèi)皮或血-腦屏障功能受損有關(guān)〔3～5〕。微小核糖核酸(miRNA)是一種廣泛參與人類(lèi)多種疾病的內(nèi)源性穩(wěn)定單鏈非編碼小分子〔6〕,而miRNA-589-5p是新發(fā)現(xiàn)的參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的miRNA,關(guān)于其對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)功能的研究較少。本研究旨在探究miRNA-589-5p對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的HBMEC損傷的調(diào)控機(jī)制及其與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)3、核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2/血紅素加氧酶(HO)-1信號(hào)通路之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 HBMEC購(gòu)自中國(guó)上?？茖W(xué)研究院細(xì)胞庫(kù);改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司;Lipofectamin3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))公司;真核表達(dá)載體pcDNA3.1均購(gòu)自Promega公司;RNA抽提試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司;乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司;封閉專(zhuān)用脫脂奶粉購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;空白對(duì)照的miRNA序列(miRNA-con)、miRNA-589-5p模擬物的miRNA序列(miRNA-589-5p mimics)、沉默空白對(duì)照序列(si-con)、沉默HDAC3序列(si-HDAC3)、陰性對(duì)照組的miRNA抑制劑序列(anti-miRNA-con)、miRNA-589-5p抑制劑的miRNA序列(anti-miRNA-589-5p)及引物的設(shè)計(jì)合成均委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。鼠抗HDAC3單抗、兔抗裂解的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3 單抗、兔抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)多抗、兔抗Bcl-2多抗、兔抗NRF2多抗、兔抗HO-1多抗、HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司;Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;Bio-Rad ZE5型智能流式分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2HBMEC的培養(yǎng) 10%胎牛血清+1%雙抗混合的DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),2 d更換1次新鮮培養(yǎng)液。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將正常培養(yǎng)的HBMEC分為對(duì)照組(不做任何處理的HBMEC細(xì)胞)、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+miRNA-con組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p組、氧糖剝奪+si-con組、氧糖剝奪+si-HDAC3組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組、miRNA-con組、miRNA-589-5p組、anti-miRNA-con組、anti-miRNA-589-5p組。氧糖剝奪組細(xì)胞的處理〔7〕:將10%胎牛血清+1%雙抗混合的DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的HBMEC更換為無(wú)糖DMEM,94%N2、1%O2、5%CO2的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。使用5倍DNA或質(zhì)粒質(zhì)量的Lipofectamin3000脂質(zhì)體與DNA或質(zhì)?；旌?將miRNA-con、miRNA-mimics、si-con、si-HDAC3、miRNA-589-5p+pcDNA、miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3依次轉(zhuǎn)染至HBMEC,轉(zhuǎn)染12 h,更換培養(yǎng)基進(jìn)行氧糖剝奪處理。使用RT-PCR或Western印跡實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染的效果。

1.4RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miRNA-589-5p、HDAC3表達(dá) 用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA,做模板。用RT-PCR試劑盒,取2 μl cDNA與上游引物、下游引物、水及SYBR Premix Ex TaqTM在Mx3005P RT-PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,記錄循環(huán)數(shù)(Ct)值。以U6、GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-589-5p、HDAC3相對(duì)表達(dá)量。ΔCt目的基因=Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct對(duì)照組目的基因,ΔCt內(nèi)參=Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參-Ct對(duì)照組內(nèi)參,-ΔΔCt=-(ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參)。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃,2 min;95 ℃,30 min;58 ℃,30 s;72 ℃,30 s;72 ℃,4 min,45個(gè)循環(huán)。miRNA-589-5p上游引物5′-CGAGGTCAGCGTGATTTCATGG-3′,下游5′-TGTGTCCAAGTCCCAGCCAGAG-3′;U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCA-CGAATTTGCGT-3′;HDAC3上游引物5′-GGAGCTGGACACCCTATGAA-3′,下游5′-TATTGGTGGGGCTGACTCTC-3′;GAPDH上游引物5′-GACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3′,下游5′-GTGGCAGTGATGGCATGGA-3′。

1.5Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中HDAC3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2、NRF2和HO-1蛋白表達(dá) 將細(xì)胞放在冰上用RIPA裂解液處理30 min,提取總蛋白。檢測(cè)蛋白濃度,100 ℃沸水浴10 min變性,用上清做蛋白電泳樣本。取50 μg上清至于上層分離膠梳子孔,低壓溫流電泳至分離膠低端,換成高壓繼續(xù)電泳直至蛋白到達(dá)濃縮膠底端。使用轉(zhuǎn)膜儀將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,整個(gè)裝置維持在0 ℃。結(jié)束后,封閉液(含2.5%脫脂奶粉)37 ℃,2 h封閉膜。電泳液充分洗膜,滴加稀釋的一抗(鼠抗HDAC3單抗,1∶1 000;兔抗Cleaved Caspase-3 單抗,1∶2 000;兔抗Bax、Bcl-2、NRF2、HO-1多抗,1∶1 000),37 ℃,搖床孵育3 h,充分洗膜。滴加稀釋的二抗溶液〔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,1∶500〕,37 ℃孵育2 h。洗膜后滴加ECL發(fā)光液,顯影定影曝光。使用Image J軟件分析蛋白的灰度值,目的蛋白灰度與內(nèi)參蛋白(GAPDH)灰度之比表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清LDH 將細(xì)胞4 ℃低溫12 000 r/min離心10 min,取上清。按照LDH試劑盒要求操作,檢測(cè)細(xì)胞上清中LDH的相對(duì)表達(dá)情況。

1.7Annexin Ⅴ-FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞先用PBS洗滌5次,再用結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞,待用。取500 μl的懸浮細(xì)胞,加入10 μl的Annexin Ⅴ-FITC避光孵育15 min,再加入10 μl的PI避光孵育20 min,結(jié)束后,將細(xì)胞用300目篩過(guò)濾,立即置流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞的凋亡情況。細(xì)胞總凋亡率(%)=早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)〔8〕。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站Starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)miRNA-589-5p的靶基因發(fā)現(xiàn),HDAC3是miRNA-589-5p的一個(gè)靶基因。根據(jù)預(yù)測(cè)到的結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)合成含有結(jié)合位點(diǎn)的片段(HDAC3-WT)和不含結(jié)合位點(diǎn)的片段(HDAC3-MUT),插入熒光載體,構(gòu)建熒光報(bào)告基因。將熒光報(bào)告基因與miRNA-con、miRNA-589-5p共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作,檢測(cè)分析細(xì)胞的熒光活性。用海參熒光素酶的活性與熒火蟲(chóng)熒光素酶的活性的比值表示細(xì)胞的熒光活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-589-5p和HDAC3在HBMEC細(xì)胞中的表達(dá) 與對(duì)照組相比,氧糖剝奪組細(xì)胞中miRNA-589-5p表達(dá)水平顯著降低,HDAC3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.001)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 HBMEC細(xì)胞中HDAC3的蛋白表達(dá)

表1 檢測(cè)HBMEC細(xì)胞中miRNA-589-5p、HDAC3的mRNA和HDAC3蛋白的表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)miRNA-589-5p對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞損傷、凋亡的影響 與對(duì)照組相比,氧糖剝奪組細(xì)胞中miRNA-589-5p表達(dá)、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低,LDH、Cleaved Caspas-3、Bax蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與氧糖剝奪+miRNA-con組相比,氧糖剝奪+miRNA-589-5p組細(xì)胞上述指標(biāo)均反向變化?？梢?jiàn),過(guò)表達(dá)miRNA-589-5p減輕氧糖剝奪誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡。見(jiàn)圖2、圖3、表2。

1～4:對(duì)照組、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+miRNA-con組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p組

圖3 各組HBMEC細(xì)胞凋亡

表2 過(guò)表達(dá)miRNA-589-5p的HBMEC細(xì)胞中LDH表達(dá)及Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)和凋亡率的影響

2.3miRNA-589-5p靶向HDAC3 通過(guò)靶基因在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到HDAC3的3′UTR存在與miRNA-589-5p互補(bǔ)的8個(gè)核苷酸序列(圖4)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,miRNA-589-5p組HDAC3-WT細(xì)胞的熒光活性顯著低于miRNA-con組(P<0.05)。見(jiàn)表3。與miRNA-con組(0.41±0.08)相比,miRNA-589-5p組細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)顯著降低(0.24±0.05,P<0.05),與anti-miRNA-con組(0.44±0.05)相比,anti-miRNA-589-5p組細(xì)胞HDAC3蛋白表達(dá)顯著升高(0.68±0.07,P<0.05)。見(jiàn)圖5,可見(jiàn)miRNA-589-5p靶向負(fù)調(diào)控HDAC3。

圖4 miRNA-589-5p 與HDAC3互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4:miRNA-con組、miRNA-589-5p組、anti-miRNA-con組、anti-miRNA-589-5p組

2.4沉默HDAC3對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞損傷、凋亡的影響 與對(duì)照組相比,氧糖剝奪組細(xì)胞中HDAC3、LDH、Cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高,Bax-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與氧糖剝奪+si-con組相比,氧糖剝奪+si-HDAC3組細(xì)胞的上述指標(biāo)發(fā)生顯著的反向調(diào)控。見(jiàn)圖6、圖7、表4。

1～4:對(duì)照組、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+si-con組、氧糖剝奪+si-HDAC3組

圖7 沉默HDAC3對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞凋亡的影響

表4 沉默HDAC3對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞中LDH表達(dá)及Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)和凋亡率的影響

2.5過(guò)表達(dá)HDAC3部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miRNA-589-5p對(duì)HBMEC細(xì)胞的保護(hù)作用 與氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組相比,氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組細(xì)胞miRNA-589-5p表達(dá)顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、HDAC3、LDH、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖8、表5。

1,2:氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組

表5 沉默HDAC3部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miRNA-589-5p對(duì)HBMEC細(xì)胞LDH表達(dá)及Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)和凋亡率的影響

2.6miRNA-589-5p和HDAC3表達(dá)對(duì)HBMEC細(xì)胞NRF2/HO-1信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組相比,氧糖剝奪組細(xì)胞NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05);與氧糖剝奪+miRNA-con組相比,氧糖剝奪+miRNA-589-5p組細(xì)胞NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05);與氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組相比,氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組細(xì)胞NRF2核蛋白/PCNA、HO-1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖9、表6。

1～6:對(duì)照組、氧糖剝奪組、氧糖剝奪+miRNA-con組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA組、氧糖剝奪+miRNA-589-5p+pcDNA-HDAC3組

表6 沉默HDAC3部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miRNA-589-5p對(duì)HBMEC細(xì)胞NRF2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

miRNA-589-5p在人類(lèi)癌癥中的功能研究比較豐富,其在肝癌、前列腺癌、喉癌、腎癌等實(shí)體瘤中均扮演抑癌基因的角色〔9〕。但是miRNA-589-5p在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用研究甚少。Yu等〔10〕發(fā)現(xiàn),miRNA-589-5p在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá),作為環(huán)狀RNA UBAP2的下游吸附因子和EGR1的上游靶基因調(diào)控高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激、增殖和遷移。Yu等〔11〕通過(guò)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞構(gòu)建腦血管細(xì)胞損傷模型發(fā)現(xiàn),miRNA-589-5p的表達(dá)明顯上調(diào),抑制miRNA-589-5p能夠抵抗ox-LDL對(duì)HBMEC細(xì)胞的損傷作用。miRNA-589-5p在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能尚處于研究初期,其具體的功能仍有待繼續(xù)探究。本研究與Yu等〔11〕研究結(jié)果相悖,與Yu等〔10〕研究結(jié)果相吻合。進(jìn)一步研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miRNA-589-5p能夠靶向負(fù)調(diào)控HDAC3的表達(dá),猜測(cè)這可能與miRNA-589-5p抵抗氧糖剝奪誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞損傷有關(guān)系。

有研究報(bào)道,抑制HDAC3能夠通過(guò)提高PPARγ的活性明顯改善氧糖剝奪-復(fù)氧誘導(dǎo)的HBMEC細(xì)胞的跨內(nèi)皮通透性增加〔12,13〕。Lin等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),HDAC2在發(fā)生卒中后表達(dá)上調(diào),而環(huán)境富集(EE)有益于腦卒中的恢復(fù),并抑制HDAC2的上調(diào),過(guò)表達(dá)HDAC2則可部分逆轉(zhuǎn)EE的恢復(fù)卒中功能,敲除HDAC2增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素和神經(jīng)可塑性,說(shuō)明HDAC2對(duì)于EE的功能恢復(fù)至關(guān)重要,精準(zhǔn)靶向HDAC2可能成為中風(fēng)恢復(fù)的新療法。Liao等〔15〕報(bào)道,小膠質(zhì)細(xì)胞中HDAC3的缺失可以減輕缺血再灌注(I/R)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和腦損傷,究其原因?yàn)镠DAC3/p65/cGAS/STING信號(hào)通路參與I/R誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的發(fā)展,為缺血性腦卒中的治療提供新方向。本研究結(jié)果也顯示,過(guò)表達(dá)HDAC3部分逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miRNA-589-5p對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞的保護(hù)作用。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷離不開(kāi)氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡,而對(duì)氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用的藥物多數(shù)是通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的激活抑制內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡〔16,17〕。Yang等〔18〕研究發(fā)現(xiàn),高糖能夠顯著降低Nrf2和HO-1的表達(dá),降低線粒體膜電位,增加細(xì)胞內(nèi)和線粒體活性氧(ROS)的生成,誘導(dǎo)BMECs的細(xì)胞骨架損傷和凋亡,線粒體ROS清除劑處理顯著上調(diào)HG誘導(dǎo)的BMEC中Nrf2和HO-1的表達(dá),這伴隨著線粒體膜電位的提高和ROS的減少,表明線粒體ROS清除劑通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的BMECs損傷具有保護(hù)作用。本研究說(shuō)明,NRF2/HO-1信號(hào)通路參與miRNA-589-5p的改善氧糖剝奪誘導(dǎo)HBMEC細(xì)胞損傷的過(guò)程。本研究結(jié)果僅在體外得到初步證實(shí),缺乏體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

綜上,miRNA-589-5p改善氧糖剝奪HBMEC的損傷,產(chǎn)生這種作用的機(jī)制可能與靶向HDAC3,激活NRF2/HO-1信號(hào)通路的活性有關(guān),為腦小血管病的治療提供新思路。