陳 鑫,秦 彤

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

mRNA疫苗是指通過體外轉(zhuǎn)錄(invitrotranscription,IVT)技術(shù)合成病原的mRNA,經(jīng)遞送系統(tǒng)遞送至靶細(xì)胞,并在細(xì)胞核糖體內(nèi)被翻譯為目的抗原,進(jìn)而啟動機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的新型核酸疫苗。mRNA疫苗是繼第一代減毒/滅活疫苗和第二代亞單位疫苗基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第三代疫苗,具有針對病原體變異反應(yīng)速度快、生產(chǎn)工藝簡單、易規(guī)?；瘮U(kuò)大等特點(diǎn)。

mRNA疫苗的研究最早可追溯到1990年,Wolff等[1]發(fā)現(xiàn)在被注射含有特定基因的質(zhì)粒DNA或mRNA的小鼠肌肉組織局部會產(chǎn)生該基因編碼的蛋白產(chǎn)物。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn),這種被核酸免疫的動物體內(nèi)會產(chǎn)生針對該核酸編碼抗原的特異性免疫反應(yīng)[2]。但由于mRNA不穩(wěn)定、在組織內(nèi)易被降解、細(xì)胞吸收率較低等缺陷,其研發(fā)進(jìn)展緩慢。21世紀(jì)后,隨著mRNA合成、修飾和遞送技術(shù)的發(fā)展,上述缺陷逐漸得到克服,mRNA疫苗的研發(fā)也重新得到重視。2005年,Weissman和Karik通過試驗(yàn)證明,使用修飾的核苷(假尿苷)代替尿苷可以降低體外轉(zhuǎn)錄mRNA的免疫原性[3],提高mRNA在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定性,并使mRNA具有更高的翻譯水平[4],這為后期研發(fā)mRNA疫苗奠定了基礎(chǔ)。隨著全球新冠肺炎疫情的暴發(fā),mRNA疫苗再次被推上歷史舞臺。2020年底,BioNTech/輝瑞和Moderna的兩款mRNA疫苗BNT162b2、mRNA-1273相繼獲批上市,在全球廣泛應(yīng)用,并取得了良好的免疫保護(hù)效果[2]。本文將從mRNA疫苗的類型和結(jié)構(gòu)、遞送系統(tǒng)、作用機(jī)制以及臨床應(yīng)用等方面對mRNA疫苗進(jìn)行全面綜述,并對這個新興疫苗平臺在獸醫(yī)領(lǐng)域的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

1 mRNA疫苗的類型和結(jié)構(gòu)

mRNA疫苗可以分為兩種類型:非復(fù)制mRNA疫苗和自擴(kuò)增RNA疫苗。雖然兩者具有共同的結(jié)構(gòu),但自擴(kuò)增RNA疫苗在編碼區(qū)域包含用于mRNA復(fù)制的額外序列,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)mRNA擴(kuò)增,可以在同等mRNA用量的情況下表達(dá)更多抗原[5]。mRNA疫苗由mRNA和遞送系統(tǒng)兩個部分組成,其中,mRNA的功能是為抗原合成提供遺傳信息,遞送系統(tǒng)是將mRNA轉(zhuǎn)入胞內(nèi),使mRNA免受核酸酶及機(jī)體免疫系統(tǒng)的干擾。一個合格的mRNA疫苗在mRNA和遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)上均格外考究。

1.1 非復(fù)制mRNA疫苗結(jié)構(gòu)組成

信使RNA(message RNA),又稱為mRNA,是以線性DNA為模板通過轉(zhuǎn)錄方式獲得的核糖核苷酸,作為模板參與蛋白質(zhì)的合成過程。用于翻譯的mRNA由5′帽子結(jié)構(gòu)(5′ cap)、5′非翻譯區(qū)(5′untranslated region,5′UTR)、翻譯區(qū)(coding sequence, CDS)、3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region,3′UTR)以及poly(A)尾組成。體外轉(zhuǎn)錄的RNA需要通過加帽、加尾,以模擬天然mRNA結(jié)構(gòu)和功能。有些研究人員會對序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,同時引入Kozak序列,以增強(qiáng)mRNA翻譯水平。

圖1 mRNA疫苗結(jié)構(gòu)[6]Fig.1 The structure of mRNA vaccine[6]

1.1.1 5′帽子結(jié)構(gòu) 在真核生物中,成熟mRNA分子的5′端,有一種特殊結(jié)構(gòu):m7G5′ppp5′Np,通常被稱為甲基鳥苷帽子或5′帽子,用于調(diào)節(jié)前體mRNA的剪接,提升mRNA核輸出,對于mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯具有重要作用[7]。此外,先天免疫系統(tǒng)也會通過5′帽子識別自身與非自身mRNA,因此,5′帽子可以幫助IVT mRNA逃脫免疫系統(tǒng)識別,使其免受外切核酸酶切割[8]。

5′帽子有3種類型,分別是cap0、cap1和cap2。鳥苷G以5′-5′焦磷酸鍵與初級轉(zhuǎn)錄本的5′端核苷酸相連,當(dāng)其第7位碳原子被甲基化后,形成m7G5′ppp5′Np,即cap0。當(dāng)轉(zhuǎn)錄本第一個核苷酸的2′-O位也發(fā)生甲基化時,形成m7GPPPN1m,此時形成的為cap1,這是多數(shù)5′帽子的存在形式。當(dāng)轉(zhuǎn)錄本第一和第二個核苷酸的2′-O位均發(fā)生甲基化時,會形成m7GPPPN1mN2m結(jié)構(gòu),即cap2。哺乳動物細(xì)胞內(nèi)5′帽子的主要形式是cap1和cap2,兩者在cap0的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了體外轉(zhuǎn)錄mRNA的翻譯效率。

5′帽子通過m7G的疏水性陽離子的相互作用和翻譯起始期間三磷酸橋的負(fù)電荷結(jié)合真核生物翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E),eIF4E能夠與支架蛋白(eIF4G)相互作用形成復(fù)合物,eIF4G還能夠與poly(A)結(jié)合蛋白(poly-adenosine binding protein,PABP)以及eIF3相互作用使mRNA環(huán)化,進(jìn)而啟動mRNA翻譯[9-11]。

目前,加帽主要是使用牛痘病毒加帽酶或通過化學(xué)共轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行[12]。酶法加帽的過程相對復(fù)雜,但產(chǎn)量較高,加帽率近100%,多用于大規(guī)模生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室研究;與酶法加帽相比,化學(xué)共轉(zhuǎn)錄方法最大程度上減少了反應(yīng)步驟和酶的用量,過程簡單,但產(chǎn)量和加帽率較低,不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)使用。在使用標(biāo)準(zhǔn)帽類似物進(jìn)行化學(xué)共轉(zhuǎn)錄加帽時,會同時產(chǎn)生m7GpppGN和Gpppm7GN兩種結(jié)構(gòu)。為此,設(shè)計(jì)了抗反向帽類似物(ARCA,3′-O-Me-m7G5′ppp5′G),其內(nèi)包含一個 5′-5′三磷酸橋,可以有效解決方向錯誤的問題[13]。下一代共轉(zhuǎn)錄加帽技術(shù)CleanCap在ARCA的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升了產(chǎn)量,加帽率升至94%[14]。但目前沒有研究證明何種加帽方式更具優(yōu)勢。

圖2 5′帽子結(jié)構(gòu)[15]Fig.2 The structure of 5′ cap[15]

1.1.2 非翻譯區(qū) 在天然mRNA分子編碼區(qū)的5′端和3′端,有兩個不被翻譯成多肽的區(qū)域,稱為非翻譯區(qū)(untranslated regions, UTRs)。UTRs上存在多個調(diào)控元件來控制mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率,除此之外,UTRs還與mRNA二級結(jié)構(gòu)以及核糖體對mRNA的識別有關(guān)[16]。許多促進(jìn)mRNA翻譯的UTRs序列已經(jīng)被從天然存在的序列中鑒定出來,如源自α-珠蛋白和β-珠蛋白的UTRs序列,目前已被廣泛用于構(gòu)建IVT mRNA[17]。

5′UTR主要參與啟動翻譯過程,作為蛋白質(zhì)翻譯的預(yù)起始復(fù)合物的起始結(jié)合位點(diǎn),在控制蛋白質(zhì)翻譯效率方面起著重要作用[10]。eIF4A與5′UTR的結(jié)合可以協(xié)助在蛋白質(zhì)翻譯發(fā)生之前解開mRNA的二級結(jié)構(gòu)[10],這對于eIF1A與mRNA 的結(jié)合十分重要[18]。目前在進(jìn)行mRNA疫苗設(shè)計(jì)時,通常會在5′UTR下游引入Kozak(GCCACC)序列,提高核糖體識別翻譯起始位點(diǎn)的準(zhǔn)確性,提升蛋白的表達(dá)效率。

3′UTR中包含mRNA降解信號,優(yōu)化3′UTR序列,可以有效提高mRNA的穩(wěn)定性,延長半衰期,進(jìn)而提升蛋白的表達(dá)效率。如mRNA的3′UTR中富含A、U的序列參與了mRNA降解過程中poly(A)尾的去除,因此,改變3′UTR 中的A、U含量可以延長mRNA半衰期,提高穩(wěn)定性[19]。

1.1.3 編碼區(qū) 編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)是用以編碼目的蛋白的基因序列,在進(jìn)行mRNA疫苗設(shè)計(jì)時,CDS序列的設(shè)計(jì)對mRNA的翻譯效率和免疫原性具有重要影響[20]。CDS的設(shè)計(jì)需要考慮以下幾個因素:首先,不同宿主細(xì)胞的密碼子偏好性不同,針對mRNA疫苗的目標(biāo)物種進(jìn)行密碼子優(yōu)化,使用常見密碼子替代稀有密碼子,可以顯著增強(qiáng)mRNA在細(xì)胞內(nèi)的翻譯水平[21],但有些蛋白質(zhì)的部分密碼子需要低翻譯效率才能保證蛋白的正確折疊,因此需要對靶抗原進(jìn)行抗原表位預(yù)測和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測;其次,研究表明,適當(dāng)提高序列中鳥嘌呤和胞嘧啶(G和C)含量可以增加mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率,提高體外穩(wěn)態(tài)mRNA含量和體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平[21-22];再次,在設(shè)計(jì)mRNA序列時,增加其二級結(jié)構(gòu)的含量,可以有效減少mRNA的降解。最近,一種專門為最大堿基堆疊區(qū)域設(shè)計(jì)最佳mRNA序列的算法也被證明可以顯著提高mRNA穩(wěn)定性[23]。

1.1.4 poly(A)尾 在真核生物mRNA的3′端,有一個聚腺苷酸化區(qū)域,被稱為poly(A)尾,其作用是與PABP[poly(A)-binding protein]結(jié)合,后者隨后募集eIF4G并增加對mRNA 5′帽子的親和力以形成環(huán)狀mRNA[24]。除少數(shù)個例(例如組蛋白)外,所有編碼mRNA的細(xì)胞蛋白都具有poly(A)尾,其對于增強(qiáng) mRNA穩(wěn)定性、提高翻譯效率至關(guān)重要。在哺乳動物細(xì)胞中,天然mRNA分子的poly(A)尾部長度約為250 nt[25]。通常,翻譯效率與poly(A) 尾中的腺苷數(shù)量成正比[26]。對于mRNA藥物而言,需要至少含有20 nt poly(A)才能有效翻譯[27]。曾有研究表明,120 nt的poly(A)尾能夠提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[28],但進(jìn)行mRNA疫苗設(shè)計(jì)時添加poly(A)尾的具體長度目前尚無定論。

1.1.5 修飾核苷酸 研究表明,IVT RNA通過刺激Toll樣受體(TLR),特別是TLR3、TLR7和TLR8來激活先天免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞。然而,將修飾核苷如假尿苷(Ψ)、5-甲基胞苷(m5C)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基尿嘧啶(m5U)或2-硫代胺(S2U)用于體外轉(zhuǎn)錄時,大多數(shù)TLR不再被激活[4,29]。Karik等[4]率先開發(fā)了用于產(chǎn)生IVT mRNA的修飾核苷酸,并聲稱將IVT mRNA中的尿苷替換為假尿苷不僅會降低針對mRNA的先天免疫反應(yīng),也能增強(qiáng)蛋白質(zhì)翻譯水平。然而,修飾核苷對TLR非依賴性免疫反應(yīng)的影響尚不清楚。

1.2 自擴(kuò)增RNA疫苗

自擴(kuò)增RNA(self-assembled RNA, saRNA)疫苗除包含上述結(jié)構(gòu)外,還引入了來自RNA病毒的促進(jìn)RNA復(fù)制的其他結(jié)構(gòu):非結(jié)構(gòu)蛋白基因nsP1、nsP2、nsP3和nsP4。nsP1～4分別編碼負(fù)責(zé)mRNA加帽的蛋白、NTP酶/解旋酶/蛋白酶、macrodomain蛋白和RNA聚合酶[30]。自擴(kuò)增RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)后,會通過核糖體中的內(nèi)源性翻譯機(jī)制,表達(dá)nsP1～4前體多聚蛋白,這些非結(jié)構(gòu)蛋白重新組裝成RNA依賴性RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物,以IVT RNA為底物分子供翻譯為抗原的mRNA[31]。因此,一個saRNA可以產(chǎn)生多個mRNA,進(jìn)而提高抗原表達(dá)量。自擴(kuò)增RNA疫苗單劑所需RNA的量更低,可以進(jìn)一步降低疫苗成本[32]。但自擴(kuò)增RNA疫苗也存在著一定局限性,比如其龐大而復(fù)雜的saRNA序列,通常nsP1～4序列的長度約為7 000 nt,這使saRNA疫苗的全長超過9 000 nt[5],過大的體積會限制RNA進(jìn)入細(xì)胞的效率。目前,saRNA疫苗已經(jīng)表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景,Arcturus、CureVac公司設(shè)計(jì)的SARS-CoV-2 saRNA疫苗已進(jìn)入臨床前研究階段,Imperial College London公司設(shè)計(jì)的SARS-CoV-2 saRNA疫苗率先進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。

2 遞送系統(tǒng)

IVT mRNA相對分子質(zhì)量為104～106u,表面帶有負(fù)電荷,因此難以通過胞吞等方式進(jìn)入細(xì)胞[33]。外源性mRNA進(jìn)入機(jī)體時,易被機(jī)體先天免疫系統(tǒng)捕獲,也易被核酸酶降解[34]。合適的遞送系統(tǒng)對mRNA進(jìn)入細(xì)胞、抗原表達(dá)水平、免疫持續(xù)時間以及保護(hù)性免疫反應(yīng)效力具有重要作用。目前,常用的遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)納米顆粒(LNP)、脂質(zhì)體、脂質(zhì)復(fù)合物、高分子材料、膠束、多肽、魚精蛋白、電穿孔等[33,35-37],其中LNP因其表現(xiàn)出的更高的轉(zhuǎn)染效率已成為當(dāng)下最常用的遞送系統(tǒng)之一[38-40]。

LNP具有磷脂單分子層結(jié)構(gòu),帶正電荷的LNP與帶負(fù)電荷的mRNA通過靜電作用,將mRNA包裹在LNP內(nèi)[33,41]。LNP含有多種成分,以Moderna公司Spikevax疫苗為例,該疫苗中LNP的組成成分包括陽離子脂質(zhì)(SM-102)、輔助脂質(zhì)磷脂二甲酰磷脂膽堿(DSPC)、膽固醇(cholesterol)和聚乙二醇化脂質(zhì)(PEG2000-DMG)[42],這四種成分按50∶38.5∶1.5∶10的比例混合,形成LNP復(fù)合物。這四種成分的功能各不相同,陽離子脂質(zhì)可以根據(jù)不同內(nèi)環(huán)境的pH,通過電荷相互作用調(diào)節(jié)LNP的自組裝和mRNA的釋放[43];輔助脂質(zhì)通常是飽和磷脂,可以提高整體相變溫度和穩(wěn)定性[44];膽固醇具有很強(qiáng)的膜融合能力,可以促進(jìn)細(xì)胞對mRNA的攝入[45];聚乙二醇化磷脂位于LNP表面,可以提高LNP親水性,避免其被免疫系統(tǒng)快速清除,防止顆粒聚集,調(diào)節(jié)顆粒大小,并提高穩(wěn)定性[46]。

目前脂質(zhì)納米顆粒的制備方法主要有薄膜水化法、擠出法、均質(zhì)法和反相蒸發(fā)等傳統(tǒng)方法[47]。與這些方法相比,采用微流控混合技術(shù)來制備LNP,相對簡便快速,條件溫和,粒徑均勻,轉(zhuǎn)染效率高,容易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)放大[48]。

在過去幾年里,大量研究表明,使用LNP技術(shù)可以極大地促進(jìn)mRNA的遞送并增強(qiáng)抗原表達(dá)[49]。這些研究闡述了LNP對mRNA疫苗誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)起到重要作用,但其機(jī)制尚不明晰[50-51],未來需要作出更多努力,來闡明LNP遞送mRNA的作用機(jī)制[52]。

3 mRNA疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的機(jī)制

非復(fù)制mRNA疫苗若要引發(fā)針對抗原的適應(yīng)性免疫,必須通過宿主細(xì)胞的翻譯機(jī)制將mRNA翻譯成內(nèi)源性抗原,內(nèi)源性抗原在細(xì)胞內(nèi)被蛋白酶體和溶酶體降解為小分子抗原片段后,分別激活MHC Ⅰ類和Ⅱ類途徑,引起機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫和體液免疫。

mRNA疫苗的免疫效果與接種途徑有關(guān),人們通常選擇用皮內(nèi)、肌肉和皮下注射,注射后mRNA可以轉(zhuǎn)染至注射部位附近的非免疫細(xì)胞和組織駐留免疫細(xì)胞中[53]。在非免疫細(xì)胞中,經(jīng)翻譯得到的抗原最初位于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中,由于合成的抗原蛋白不用于細(xì)胞,因此它們在泛素化后作為內(nèi)源性抗原被蛋白酶體降解[2]。降解后的抗原片段與MHC Ⅰ類分子形成復(fù)合物,隨后抗原片段被呈遞于細(xì)胞表面,供細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)識別,進(jìn)而激活 CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[54]。對于組織駐留免疫細(xì)胞,主要是針對抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell, APC),如樹突細(xì)胞(dendritic cells, DC)和巨噬細(xì)胞(macrophages)[55]。與非免疫細(xì)胞不同的是,mRNA轉(zhuǎn)染至組織駐留免疫細(xì)胞后,除可以激活MHCⅠ類途徑,還能通過MHCⅡ類途徑處理抗原,進(jìn)而激活CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答[54]。通常,MHC Ⅱ類途徑由外源性抗原激活,但也存在交叉遞呈途徑,部分內(nèi)源性抗原可以通過自噬作用激活MHCⅡ類途徑[56],還有一部分內(nèi)源性抗原會分泌出胞外,重新作為外源性抗原被內(nèi)吞入胞內(nèi),進(jìn)而激活MHC Ⅱ類途徑[5]。該過程是內(nèi)源性抗原被分泌至胞外后,重新進(jìn)入細(xì)胞,并被溶酶體降解為小分子抗原片段,隨后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,與MHCⅡ類分子形成復(fù)合物,再經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面,供CD4+T細(xì)胞識別[57]。CD4+T細(xì)胞受抗原刺激后,通過分泌細(xì)胞因子等方式使B細(xì)胞成熟并分化為漿細(xì)胞,進(jìn)而激活體液免疫應(yīng)答[58-59]。

由此可見,若想使mRNA引起有效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),需要依靠內(nèi)源性抗原同時激活MHCⅠ類和MHCⅡ類途徑,其中能夠激活MHC Ⅱ類途徑是成功激活體液免疫的關(guān)鍵。通常,MHCⅡ類途徑由外源性抗原激活,如果引入分泌型信號肽,通過基因工程改造將抗原引導(dǎo)至胞外[60],便可以將內(nèi)源性抗原轉(zhuǎn)換為外源性抗原,進(jìn)而更有效激活MHCⅡ類途徑[61]。

圖3 mRNA疫苗作用機(jī)制Fig.3 Mechanism of action of mRNA vaccine

4 mRNA疫苗的應(yīng)用

mRNA疫苗因其相較于傳統(tǒng)疫苗更快的研發(fā)速度和良好的保護(hù)效力在新冠肺炎疫情防控中脫穎而出。2021年8月23日,由BioNTech設(shè)計(jì)的mRNA疫苗(商品名為Comirnaty)正式獲批上市,用于預(yù)防16歲及以上人群的新冠病毒感染,臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示,該疫苗預(yù)防新冠的有效率為91%[62]。當(dāng)前,Moderna、NIAID、Canadian Immunization Research Network、BioNTech和CureVac等多家公司研發(fā)的針對新冠的mRNA疫苗已進(jìn)入臨床階段。此外,還有多種針對不同病原的mRNA疫苗(如人副流感病毒、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、艾滋病毒等)也已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段,但目前沒有更多數(shù)據(jù)得到披露[63-64]。

針對人畜共患病的mRNA疫苗也已有多種進(jìn)入臨床試驗(yàn)。2015年12月—2017年8月,德國和美國開展了H10N8和H7N9流感病毒mRNA疫苗的Ⅰ期臨床試驗(yàn),評估了流感病毒mRNA疫苗的安全性和免疫原性。結(jié)果表明,疫苗沒有導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng),并能引起強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)[65]。2021年11月23日,CureVac公司完成了對狂犬病病毒mRNA疫苗CV7202的Ⅰ期臨床試驗(yàn),用以評估在成人中的安全性、反應(yīng)原性和免疫原性,受試者分別接種了1、2和5 μg mRNA,結(jié)果表明1和2 μg劑量的耐受性更好,二者均誘導(dǎo)產(chǎn)生了中和抗體,提高了IgG水平,沒有引起相關(guān)的安全問題,與商品化狂犬病疫苗相當(dāng)[66]。表1中匯總了進(jìn)入臨床試驗(yàn)的人畜共患病mRNA疫苗。

表1 進(jìn)入臨床試驗(yàn)的人畜共患病mRNA疫苗(截至2022年12月)Table 1 List of mRNA vaccines against zoonoses in clinical trials(till December 2022)

5 mRNA疫苗在獸醫(yī)領(lǐng)域的挑戰(zhàn)和展望

與減毒活疫苗和滅活疫苗相比,mRNA疫苗以IVT mRNA為主要成分,排除了在傳統(tǒng)疫苗中常見的內(nèi)毒素和其他等感染風(fēng)險(xiǎn)。此外,mRNA疫苗進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)即可表達(dá),無需進(jìn)入細(xì)胞核,不會產(chǎn)生DNA疫苗存在的基因組突變的風(fēng)險(xiǎn),其安全性優(yōu)于DNA疫苗和病毒活載體疫苗。且不同于傳統(tǒng)疫苗動輒數(shù)年甚至數(shù)十年的研發(fā)周期,mRNA疫苗的研發(fā)速度也遠(yuǎn)超于其他疫苗,這種極短的研發(fā)周期對攻克具有高突變率特點(diǎn)的病毒來說,具有重要意義。但是,mRNA疫苗的研發(fā)也存在一些問題。由于知識產(chǎn)權(quán)分散,mRNA疫苗通常是由不同部門的許多參與者共同完成的,這種多頭合作會增加溝通成本,降低mRNA疫苗研發(fā)效率[67]。此外,雖然使用LNP可以提高mRNA遞送效率,但LNP的不穩(wěn)定性要求mRNA疫苗的儲存和運(yùn)輸需滿足苛刻的條件。有研究顯示,基于LNP的mRNA疫苗凍干化處理后可以在室溫下長期儲存,這為mRNA疫苗的儲存和運(yùn)輸提供了一個潛在的解決方案[68]。隨著全球合作的進(jìn)一步深化,mRNA疫苗的專利限制和技術(shù)瓶頸等問題或許有望得到解決。

目前,雖然沒有獸用mRNA疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,但新冠 mRNA疫苗的成功上市依舊點(diǎn)燃了人們對研發(fā)獸用mRNA疫苗的熱情。我國是畜牧業(yè)大國,動物傳染病是制約我國畜牧業(yè)發(fā)展的重要原因,其中人畜共患病也會對人類的健康和生命財(cái)產(chǎn)安全產(chǎn)生重大影響,而接種有效的疫苗是預(yù)防和控制傳染病最有效的公共衛(wèi)生干預(yù)措施之一[69]。當(dāng)前影響畜牧業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展的主要動物傳染病如非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)等,其疫苗保護(hù)效力均不理想,mRNA疫苗已在以上動物傳染病疫苗研發(fā)中展現(xiàn)出了巨大的潛力。在此,作者將以動物冠狀病毒和非洲豬瘟病毒為例展望mRNA疫苗在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用。

5.1 基于動物冠狀病毒RBD區(qū)的mRNA疫苗

冠狀病毒的宿主譜廣泛,除了人類之外,還能夠感染豬、牛等家畜以及寵物犬、貓等多種動物[70]。感染不同物種的冠狀病毒具有遺傳結(jié)構(gòu)相似性,刺突蛋白(S蛋白)是冠狀病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白,也是誘發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫的重要組成成分。S蛋白由S1和S2兩個亞基組成,S1亞基包含一個受體結(jié)合域,即RBD區(qū),負(fù)責(zé)與特定的受體結(jié)合,而S2亞基則介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞膜的融合。各種證據(jù)表明,RBD區(qū)是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要靶點(diǎn),因此,這一區(qū)域也成為疫苗研發(fā)的重點(diǎn)目標(biāo)[31]。新冠肺炎大流行期間,多個公司基于新冠病毒RBD區(qū)域設(shè)計(jì)開發(fā)了多款mRNA疫苗,數(shù)據(jù)顯示,基于RBD區(qū)的候選疫苗,如BNT162b1、mRNA-1273等均具有良好的免疫原性[71]。

人類mRNA疫苗的成功為mRNA疫苗在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用展示了希望。豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎及新發(fā)的豬急性腹瀉綜合征均是由冠狀病毒引發(fā)的嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要胃腸道傳染病[70],常用的滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗雖然對于防控豬冠狀病毒感染起到了一定的效果,但由于冠狀病毒易發(fā)生重組或突變,常規(guī)疫苗在防控方面往往不盡如人意,研發(fā)基于豬冠狀病毒RBD區(qū)的mRNA疫苗或許將為疾病防控提供新思路。在寵物疫病方面,貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)是目前發(fā)生最普遍的一種由冠狀病毒變異株引起的高度致死性傳染病,目前沒有商品化的疫苗上市[72]。隨著對動物冠狀病毒RBD和細(xì)胞表面受體認(rèn)識的進(jìn)一步深入,基于RBD的mRNA疫苗將成為一種對抗新發(fā)和再發(fā)動物冠狀病毒非常有前途的策略。

5.2 T細(xì)胞靶向的非洲豬瘟mRNA疫苗

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,所有品種和年齡的豬均可感染,發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)100%。由于缺乏有效的疫苗,非洲豬瘟已經(jīng)蔓延到許多國家并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國2019年至今非洲豬瘟已造成近700萬頭豬死亡[73]。國內(nèi)外科研人員雖然已經(jīng)開發(fā)出多種刪除了毒力基因的ASFV減毒活疫苗候選疫苗株,但這些減毒疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)嚴(yán)重依賴于原代豬肺泡巨噬細(xì)胞或骨髓細(xì)胞,既耗時又費(fèi)錢[74-76];基于結(jié)構(gòu)蛋白設(shè)計(jì)的重組蛋白疫苗,雖會誘導(dǎo)出相應(yīng)中和抗體,并延遲臨床癥狀,但中和抗體無法提供充分的保護(hù)。研究證明T細(xì)胞在 ASFV 的抗病毒免疫和保護(hù)中發(fā)揮重要作用。近期,科研人員利用iVAX計(jì)算疫苗設(shè)計(jì)平臺,在ASFV編碼的蛋白質(zhì)中鑒定出高度保守的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位[77-78],開發(fā)了一種含有預(yù)測的豬MHCⅠ類和Ⅱ類表位的T細(xì)胞靶向ASF DNA疫苗,并正在評估這種新型疫苗的免疫原性[79-81]?？紤]到DNA疫苗存在整合到宿主基因組的潛在風(fēng)險(xiǎn),基于mRNA的疫苗方法有可能促進(jìn)安全有效ASF疫苗的改進(jìn)。ASFV為大型雙鏈DNA病毒,基因組大小為170～194 kb,含有150～167個開放閱讀框,編碼150～200種蛋白質(zhì),目前仍有一半以上的ASFV編碼蛋白功能尚不清楚。隨著研究的逐漸深入,更多潛在的T細(xì)胞表位將被挖掘,為開發(fā)具有更大表位范圍的T細(xì)胞靶向mRNA疫苗提供了廣闊前景。