張 航,楊柏高,徐 茜,馮肖藝,杜衛(wèi)華,郝海生,朱化彬,張培培,趙學(xué)明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193)

奶業(yè)是關(guān)系國計(jì)民生的重要基礎(chǔ)性產(chǎn)業(yè)。近年來,隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,我國牛奶產(chǎn)量及城鄉(xiāng)居民奶類消費(fèi)逐年提升[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),2021年我國牛奶產(chǎn)量達(dá)3 683萬噸,比上年增長(zhǎng)7.1%[2],與此同時(shí),2021年我國人均奶類消費(fèi)達(dá)42.3 kg,較上年增長(zhǎng)10.2%[2],由此可見,牛奶已逐漸成為國民生活中不可替代的食品之一。2018年,國務(wù)院辦公廳發(fā)布《關(guān)于推進(jìn)奶業(yè)振興保障乳制品質(zhì)量安全的意見》,并在文件中明確指出“奶業(yè)是健康中國、強(qiáng)壯民族不可或缺的產(chǎn)業(yè)”。2022年,為進(jìn)一步提升我國奶業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力,保障奶類供給安全,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《“十四五”奶業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力提升行動(dòng)方案》,再次表明了奶業(yè)振興意義之重大。

然而,夏季高溫高濕環(huán)境極易誘發(fā)奶牛熱應(yīng)激,進(jìn)而對(duì)奶業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。研究表明,當(dāng)溫度濕度指數(shù)(temperature-humidity index,THI)≥72時(shí),奶牛自身無法實(shí)現(xiàn)充分散熱,便會(huì)出現(xiàn)熱應(yīng)激,奶牛的生產(chǎn)及繁殖性能隨之受到嚴(yán)重影響[3]。Thornton等[4]的研究指出,如果世界一直處于高碳排放發(fā)展模式(SSP5-8.5),全球變暖將進(jìn)一步加劇奶牛熱應(yīng)激風(fēng)險(xiǎn),到21世紀(jì)末期(2085年),由產(chǎn)奶量減少帶來的經(jīng)濟(jì)損失將高達(dá)91.4億美元,占2005年全球牛奶生產(chǎn)價(jià)值的4.7%。2080年,僅美國奶業(yè)的損失便將高達(dá)22億美元[5]。若以熱帶牲畜單位(tropical livestock units,TLU)計(jì)算,本世紀(jì)末期中國每TLU產(chǎn)奶量相較2005年將減少5.4%,而巴西將減少13.1%[4]。此外,熱應(yīng)激還導(dǎo)致奶牛繁殖力大幅下降。與冬季相比,奶牛在夏季的受孕率要低20%～30%[6]。統(tǒng)計(jì)資料顯示,2000—2017年連續(xù)18年,以色列夏季奶牛受孕率約為27.7%,顯著低于冬季的42.6%[7]。Gernand等[8]的研究還指出,當(dāng)THI=80時(shí),奶牛受孕率由約35%(THI<65)顯著降低至約16%。不僅如此,隨著氣候變暖問題不斷惡化,熱應(yīng)激對(duì)奶牛的危害還將進(jìn)一步增加[9]。據(jù)推測(cè),到2050年及2070年,我國THI指數(shù)還將出現(xiàn)大幅上漲[10],由此可見,熱應(yīng)激對(duì)我國奶業(yè)發(fā)展的威脅不容小覷。

本文主要就熱應(yīng)激對(duì)奶牛內(nèi)分泌、卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的作用機(jī)制以及通過物理降溫、激素調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、優(yōu)化卵母細(xì)胞培養(yǎng)體系、基因編輯等緩解奶牛熱應(yīng)激影響的解決措施進(jìn)行闡述,以期為緩解奶牛熱應(yīng)激導(dǎo)致繁殖性能下降的產(chǎn)業(yè)問題提供思考。

1 熱應(yīng)激影響奶牛胚胎發(fā)育的機(jī)制

1.1 熱應(yīng)激對(duì)內(nèi)分泌的影響

熱應(yīng)激能夠直接對(duì)奶牛的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成影響,進(jìn)而干擾奶牛排卵及妊娠等正常繁殖行為,影響奶牛繁殖性能。

當(dāng)發(fā)生急性熱應(yīng)激時(shí),奶牛體內(nèi)應(yīng)激激素(如皮質(zhì)醇)水平升高,從而對(duì)下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)造成影響,使促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)和促性腺激素(gonadotropins,Gn)分泌減少并抑制卵巢活動(dòng),如:促黃體生成素(luteotropic hormone,LH)的分泌受熱應(yīng)激影響而被抑制[11]。排卵前LH分泌出現(xiàn)延遲,增加了排卵失敗和卵巢囊腫的風(fēng)險(xiǎn)。低水平的LH還可能影響黃體的形成,這被認(rèn)為是降低胚胎存活率的重要原因之一[11]。

當(dāng)發(fā)生慢性熱應(yīng)激時(shí),奶牛孕酮(progesterone,P4)水平出現(xiàn)大幅下降,嚴(yán)重影響奶牛繁殖機(jī)能。慢性熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致奶牛卵泡發(fā)育異常,阻礙黃體形成并引起黃體功能受損,進(jìn)而影響P4分泌[12]。P4由卵巢黃體分泌,主要影響胚胎的發(fā)育生長(zhǎng)及干擾素Tau的生成,進(jìn)而影響胚胎著床[13]。Nanas等[14]認(rèn)為,高水平的P4是保障早期胚胎正常發(fā)育的最關(guān)鍵因素之一,P4水平下降將導(dǎo)致胚胎死亡率大大增加。此外,慢性熱應(yīng)激還會(huì)引起奶牛分泌皮質(zhì)醇濃度減少,血液中葡萄糖水平降低,進(jìn)而使機(jī)體抵御熱應(yīng)激的能力減弱,導(dǎo)致妊娠率降低[15]。

1.2 熱應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞的影響

熱應(yīng)激對(duì)卵母細(xì)胞的影響主要體現(xiàn)在奶牛排卵以及卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟過程中,進(jìn)而損害卵母細(xì)胞發(fā)育成胚胎的能力。Stamperna等[16]的研究表明,熱應(yīng)激導(dǎo)致荷斯坦奶牛卵母細(xì)胞發(fā)育成囊胚的比例由30.3%降低至21.5%,利木贊牛由25.8%降低至14.2%。

奶牛的正常排卵依賴于精密的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng),而熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致奶牛體內(nèi)激素水平改變,進(jìn)而損害奶牛正常排卵。由于熱應(yīng)激引起奶牛內(nèi)分泌紊亂,引發(fā)奶牛卵泡發(fā)育異常,優(yōu)勢(shì)卵泡的大小及優(yōu)勢(shì)度降低,甚至生長(zhǎng)出額外的大卵泡,導(dǎo)致熱應(yīng)激奶牛產(chǎn)下雙胞胎的可能性升高,卵母細(xì)胞的發(fā)育質(zhì)量也會(huì)受到卵泡異常的影響而出現(xiàn)下降[17]。即便到了溫度相對(duì)較低的夏季末、秋季甚至初冬季節(jié),奶牛卵泡液中雌二醇含量依舊維持在較低水平,這將導(dǎo)致LH分泌受到抑制,奶牛發(fā)情及排卵異常,進(jìn)而引起持續(xù)性卵泡及囊腫形成,而這也表明熱應(yīng)激對(duì)奶牛卵巢卵泡的影響存在長(zhǎng)時(shí)間的負(fù)面作用[11]。

當(dāng)卵母細(xì)胞發(fā)育過程中遭受熱應(yīng)激時(shí),卵母細(xì)胞染色質(zhì)凝聚出現(xiàn)異常,早期胚胎染色質(zhì)重塑同樣受到嚴(yán)重影響。研究表明,夏季奶牛卵母細(xì)胞染色質(zhì)致密程度大大降低,其發(fā)育至胚胎的能力隨之減弱。與此同時(shí),牛卵丘細(xì)胞中DNA碎片化程度增加,凋亡比例大幅提高,進(jìn)而影響卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟,并進(jìn)一步損害卵母細(xì)胞染色質(zhì)凝聚[18]。Camargo等[19]指出,當(dāng)卵母細(xì)胞體外成熟過程中遭受熱應(yīng)激時(shí),四細(xì)胞期胚胎中H3K9me3和HP1出現(xiàn)異常積聚,進(jìn)而影響胚胎染色質(zhì)重塑,并導(dǎo)致胚胎基因組激活及基因表達(dá)異常,胚胎發(fā)育嚴(yán)重受損。

熱應(yīng)激還會(huì)增加卵母細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷的風(fēng)險(xiǎn)。谷胱甘肽是一種高效的抗氧化劑,能有效清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷,而熱應(yīng)激引起卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平降低,導(dǎo)致卵母細(xì)胞更易遭受氧化應(yīng)激影響[20]。牛卵母細(xì)胞膜脂肪酸含量豐富,膜脂肪酸的含量及組成成分對(duì)牛卵母細(xì)胞后期發(fā)育至關(guān)重要。而在夏季高溫條件下,牛卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中飽和脂肪酸的比例升高,且高于單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸,這主要是由于溫度升高引起牛卵母細(xì)胞ROS水平增加,加劇卵母細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷[21]。

此外,熱應(yīng)激引起牛卵母細(xì)胞微管蛋白和微絲受損。微管蛋白和微絲作為細(xì)胞骨架參與細(xì)胞核和細(xì)胞器的運(yùn)輸,而細(xì)胞骨架改變將引起卵母細(xì)胞成熟異常,卵母細(xì)胞的成熟時(shí)間或?qū)⒁虼颂崆?進(jìn)而增加受精失敗及胚胎發(fā)育異常的風(fēng)險(xiǎn)[22]。同時(shí),線粒體的運(yùn)輸也要依賴細(xì)胞骨架,夏季奶牛卵母細(xì)胞細(xì)胞骨架損傷導(dǎo)致線粒體分布異常概率增加,這也被認(rèn)為是影響卵母細(xì)胞發(fā)育的重要原因[22]。

1.3 熱應(yīng)激對(duì)胚胎的影響

熱應(yīng)激能引起母體體內(nèi)溫度升高并導(dǎo)致母體生理狀態(tài)改變,進(jìn)而影響奶牛胚胎發(fā)育,導(dǎo)致奶牛受孕率降低。Cordeiro等[23]的研究指出,當(dāng)THI由73.1升高至75.7時(shí),胚胎移植奶牛受孕率由56.3%降低至33.3%。Abdel等[24]指出,當(dāng)THI≥73時(shí),性控胚胎移植奶牛受孕率由52.50%降低至35.71%。

早期胚胎對(duì)高溫十分敏感。在受精當(dāng)天至胚胎發(fā)育到2細(xì)胞期之間,若奶牛處于熱應(yīng)激環(huán)境中,則隨后胚胎囊胚率便會(huì)出現(xiàn)明顯下降[22]。Stamperna等[25]的研究表明,熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致牛早期胚胎基因表達(dá)紊亂。他們的研究指出,GSTP1、BAX1、PTGS2、DNMT3、TLR4、PLAC8、AKR1B1、HSF1和HSPA1A的表達(dá)存在協(xié)同性,對(duì)胚胎的正常發(fā)育至關(guān)重要,而熱應(yīng)激導(dǎo)致這些基因表達(dá)的協(xié)調(diào)性喪失。與此同時(shí),熱應(yīng)激還導(dǎo)致胚胎中氧化應(yīng)激相關(guān)基因(如:COX1、AKR7A2、CBR1、GGH、GSTA4等)表達(dá)增加,胚胎發(fā)育質(zhì)量相關(guān)基因(如:AQP3、ATP1A1等)表達(dá)減少,進(jìn)一步反映熱應(yīng)激對(duì)胚胎發(fā)育造成損傷[26]。

胚胎發(fā)育至4細(xì)胞期時(shí)便開始獲得熱耐受能力,一直到囊胚階段,胚胎的耐熱能力會(huì)不斷增強(qiáng),此時(shí)熱應(yīng)激對(duì)胚胎發(fā)育的影響相對(duì)有限[21]。研究表明,當(dāng)胚胎分裂至8～16細(xì)胞期時(shí),胚胎基因組激活,轉(zhuǎn)錄活性增加,此時(shí)熱應(yīng)激相關(guān)蛋白及內(nèi)源性抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄激活,胚胎耐熱性大幅增加[25]。在此階段,胚胎即便遭遇熱應(yīng)激,依舊具有繼續(xù)發(fā)育的能力。不過,熱應(yīng)激一定程度上還是會(huì)對(duì)該階段胚胎造成損傷,但在胚胎體外培養(yǎng)過程中使用抗氧化劑處理可以有效緩解這一情況[14]。

除了溫度升高直接影響胚胎發(fā)育外,熱應(yīng)激還會(huì)改變奶牛體內(nèi)激素濃度,引起輸卵管及子宮環(huán)境變化,進(jìn)而影響胚胎發(fā)育[27]。妊娠后期時(shí),熱應(yīng)激能引起奶牛母體體溫升高,進(jìn)而誘發(fā)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR),導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)或胎兒過小[28]。此外,由于熱應(yīng)激引起奶牛采食量減少,奶牛營養(yǎng)不足,供給胚胎的營養(yǎng)也會(huì)減少。奶牛機(jī)體散熱增加導(dǎo)致流經(jīng)子宮血液減少,進(jìn)而引起胚胎發(fā)育所需的養(yǎng)分、氧氣及水分相對(duì)不足,胚胎發(fā)育受阻。熱應(yīng)激引起的奶牛內(nèi)分泌紊亂也增加了胎兒流產(chǎn)的可能[29]。

2 改善熱應(yīng)激奶牛胚胎發(fā)育的措施

2.1 改進(jìn)奶牛飼養(yǎng)管理

2.1.1 物理降溫 物理降溫是緩解奶牛熱應(yīng)激的主要策略。傳統(tǒng)降溫方式包括直接法和間接法。其中,直接法通過強(qiáng)制蒸發(fā)動(dòng)物體表水分以達(dá)到降溫目的,而間接法則通過遮蔭、灑水等方式降低環(huán)境溫度,從而間接幫助奶牛散熱[30]。以色列夏季溫度高、濕度達(dá)50%～90%,因此當(dāng)?shù)啬膛ｐB(yǎng)殖常采用直接法幫助奶牛降溫,即:用水噴灑奶牛30秒,通風(fēng)4.5 min,每次循環(huán)進(jìn)行30～45 min,每日5～7次,用此方法,奶牛體溫降至39 ℃以下,受孕率從17%顯著提高至57%,熱應(yīng)激現(xiàn)象得到有效緩解[31]。此外,添加遮蔭設(shè)備,減少陽光直射,也是幫助奶牛降溫的有效手段。有研究指出,太陽能電池板既能提供遮蔭,還能生產(chǎn)電能,其遮蔭效果也大大優(yōu)于傳統(tǒng)遮陽布,在緩解奶牛熱應(yīng)激的同時(shí)提高了農(nóng)民收入,促進(jìn)了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[32]。研究表明,奶牛在太陽能電池板遮蔭條件下,體表溫度降低6 ℃[33],而為每頭奶牛提供3 m2的遮蔭便能有效阻隔光照[32]。隨著太陽能電池板價(jià)格的不斷降低,這種新型的遮陽方式或?qū)⒕哂袕V闊的前景[32]。

2.1.2 激素緩解內(nèi)分泌紊亂 激素治療是調(diào)節(jié)奶牛內(nèi)分泌的重要途徑,能有效緩解熱應(yīng)激引起的奶牛內(nèi)分泌紊亂。熱應(yīng)激通過破壞奶牛激素水平,引發(fā)卵泡發(fā)育異常并損害卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育,造成奶牛繁殖力大幅下降[30]。通過反復(fù)注射GnRH和前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)能夠誘導(dǎo)卵泡生成,去除受損卵泡,進(jìn)而減少熱應(yīng)激對(duì)卵泡功能的負(fù)面影響[34]。此外,高溫會(huì)抑制黃體功能,導(dǎo)致P4分泌減少,進(jìn)而影響胚胎著床甚至造成胚胎死亡[35],而補(bǔ)充P4則被認(rèn)為是有效的應(yīng)對(duì)策略[30]。研究表明,聯(lián)用GnRH-PGF2α和P4能進(jìn)一步提高熱應(yīng)激奶牛的繁殖力[34]。

然而,無論是物理降溫還是激素治療,都只能有限地挽救熱應(yīng)激奶牛的繁殖力[34]。因此,開發(fā)更多抗熱應(yīng)激方式與這兩種方法聯(lián)合使用,或?qū)⑦M(jìn)一步促進(jìn)熱應(yīng)激條件下奶牛胚胎發(fā)育。

2.2 添加IGF1改進(jìn)體外胚胎生產(chǎn)體系

胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factors 1,IGF1)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖[36-37]、抗凋亡等作用[38],能有效保護(hù)細(xì)胞免受各類應(yīng)激傷害。研究表明,添加IGF1可以促進(jìn)體外胚胎發(fā)育并提高胚胎在發(fā)育過程中對(duì)熱應(yīng)激的抵抗力[39],是改善體外生產(chǎn)胚胎耐熱性的有效手段。

2.2.1 IGF1提高卵母細(xì)胞抗熱應(yīng)激能力 IGF1能從多方面緩解熱應(yīng)激對(duì)繁殖帶來的負(fù)面影響,包括促進(jìn)熱應(yīng)激條件下卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育及提高熱應(yīng)激胚胎移植后的妊娠率等。Ascari等[40]的研究顯示,添加IGF1能夠提高熱應(yīng)激卵母細(xì)胞線粒體膜電位,減少囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞凋亡。他們指出,高溫等應(yīng)激條件會(huì)刺激卵母細(xì)胞線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放,引起線粒體膜電位及線粒體活性降低,進(jìn)而導(dǎo)致囊胚質(zhì)量下降,而IGF1有效改善了這一情況。Rodrigues等[41]認(rèn)為,熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞線粒體異常,引起線粒體途徑的細(xì)胞凋亡,而IGF1能通過PI3K/Akt途徑改善線粒體功能,提高線粒體膜電位,進(jìn)而提高熱應(yīng)激條件下牛卵母細(xì)胞存活率。

此外,Rodrigues等[41]的研究還表明熱應(yīng)激主要損傷卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì),引起細(xì)胞骨架損傷,干擾細(xì)胞發(fā)育。當(dāng)卵母細(xì)胞處于熱應(yīng)激條件下時(shí),胞內(nèi)鈣離子濃度升高,促進(jìn)凝溶膠蛋白活化。該蛋白活化后能結(jié)合G-肌動(dòng)蛋白單體及微絲,引起微絲斷裂或解體,紡錘體形態(tài)異常,進(jìn)而干擾卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。他們認(rèn)為,添加IGF1能激活p70S6激酶,從而增加微絲穩(wěn)定性,減小熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞骨架造成的損傷。

Lima等[42]還指出,IGF1對(duì)熱應(yīng)激卵母細(xì)胞發(fā)育能力的改善效果很大程度上依賴于IGF1的濃度。當(dāng)IGF1添加濃度過高時(shí),反而會(huì)抑制IGF1R蛋白的表達(dá),對(duì)卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育造成負(fù)面影響。而添加生理濃度的IGF1(12.5 ng·mL-1)能更有效地抵御熱應(yīng)激帶來的負(fù)面影響。

2.2.2 IGF1提高胚胎抗熱應(yīng)激能力 添加IGF1能有效改善熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛胚胎的發(fā)育情況,顯著提高夏季奶牛妊娠率及產(chǎn)仔率[43]。Jousan和Hansen[39]的研究發(fā)現(xiàn),添加IGF1能有效減少熱應(yīng)激胚胎凋亡并促進(jìn)熱應(yīng)激胚胎發(fā)育至囊胚階段。添加IGF1還會(huì)減少胚胎中HSp70 mRNA。細(xì)胞在遭受應(yīng)激條件刺激時(shí)會(huì)促進(jìn)HSp70表達(dá)升高以阻止細(xì)胞凋亡,而HSp70 mRNA的減少證明IGF1能有效減少細(xì)胞應(yīng)激帶來的負(fù)面影響[44]。

IGF1能通過調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而提高胚胎的熱應(yīng)激耐受力。Bonilla等[45]指出,添加IGF1會(huì)引起胚胎中涉及凋亡、抗氧化等功能的基因出現(xiàn)差異表達(dá),其中包括IL6ST在內(nèi)的5個(gè)抗凋亡基因上調(diào),DPYSL4等5個(gè)促凋亡基因下調(diào),GSTM2等兩個(gè)抗氧化基因上調(diào),而IGF1提高胚胎的抗熱應(yīng)激能力或許和這些基因的差異表達(dá)有關(guān)。

IGF1還通過PI3K/Akt信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路提高胚胎對(duì)熱應(yīng)激的抵抗力。Jousan等[46]的研究指出,當(dāng)胚胎發(fā)生熱應(yīng)激時(shí),IGF1激活PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡作用。Akt能夠抑制Bad、caspase-9等促凋亡蛋白的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)Bcl-2、Bcl-x等抗凋亡蛋白水平升高,進(jìn)而提高熱應(yīng)激條件下胚胎的存活率。此外,IGF1通過激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)胚胎細(xì)胞增殖,進(jìn)而促進(jìn)熱應(yīng)激條件下胚胎的發(fā)育。

2.2.3 IGF1聯(lián)用其他藥物 IGF1與其他藥物聯(lián)用或許能發(fā)揮更強(qiáng)大的抗熱應(yīng)激效果。熱應(yīng)激會(huì)從多方面損傷卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育能力,包括誘導(dǎo)凋亡、損傷線粒體功能、促進(jìn)氧化應(yīng)激等[47]。而IGF1提高胚胎抗熱應(yīng)激能力主要依賴于PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路對(duì)胚胎凋亡的抑制作用及對(duì)胚胎發(fā)育的促進(jìn)作用[46]。因此,在體外胚胎生產(chǎn)過程中,選擇高效的線粒體保護(hù)藥物或抗氧化劑與IGF1聯(lián)用,或能進(jìn)一步促進(jìn)IGF1對(duì)胚胎抗熱應(yīng)激能力的提升效果。

輔酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)是線粒體呼吸鏈上的關(guān)鍵成分,具有增強(qiáng)線粒體功能、抗氧化等效果。Gendelman和Roth[48]的研究表明,添加CoQ10能顯著提高秋季牛卵母細(xì)胞發(fā)育到囊胚的能力,并改善卵母細(xì)胞線粒體分布。CoQ10通過提高線粒體質(zhì)量、抑制氧化應(yīng)激進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育的能力已在牛[49]、豬[50]、小鼠[51-52]等多個(gè)物種上得到證明。

褪黑素(melatonin,MT)是一種高效的抗氧化劑,能有效減少熱應(yīng)激期間ROS對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育造成的氧化損傷。研究表明,添加褪黑素有效減少了熱應(yīng)激條件下卵母細(xì)胞ROS的產(chǎn)生[53],促進(jìn)線粒體功能相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[54],并提高熱應(yīng)激條件下卵母細(xì)胞發(fā)育成囊胚的能力[55]。還有研究指出,褪黑素能調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育過程中表觀遺傳修飾[56],并促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因(GDF9、MARF1和DNMT1a等)[57]、胚胎抗凋亡基因(BCL2L1等)表達(dá),抑制促凋亡基因(p53、Bax等)表達(dá)[58],進(jìn)而提高卵母細(xì)胞及胚胎的發(fā)育能力。

因此,在奶牛體外胚胎生產(chǎn)過程中,添加IGF1的同時(shí)聯(lián)用CoQ10、褪黑素等藥物,或許能更加有效的提高胚胎對(duì)熱應(yīng)激的抵抗能力。

2.3 基因編輯

2.3.1HSPA1L基因HSPA1L是熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的編碼基因之一。研究表明,當(dāng)HSPA1L啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生胞嘧啶缺失突變時(shí),細(xì)胞內(nèi)HSPA1A/L 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及HSP70表達(dá)量升高,進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激的耐受力。因此,利用基因編輯技術(shù)對(duì)牛胚胎HSPA1L基因進(jìn)行修飾或是高效解決奶牛熱應(yīng)激問題的有力手段。

HSP70是大多生物細(xì)胞中含量最高的一類熱休克蛋白,易受高熱、高氧等多種應(yīng)激條件誘導(dǎo)表達(dá)[59],能有效提高細(xì)胞對(duì)各類應(yīng)激的耐受能力[60]。HSP70的作用包括:作為分子伴侶正確折疊、組裝蛋白質(zhì),促進(jìn)變性蛋白降解,抑制細(xì)胞凋亡等[60],能有效幫助細(xì)胞緩解熱應(yīng)激造成的損傷。Stamperna等[61]的研究表明,在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加HSP70能夠促進(jìn)胚胎發(fā)育過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),增強(qiáng)胚胎抗氧化能力,抑制胚胎凋亡發(fā)生,進(jìn)而增強(qiáng)胚胎在發(fā)育過程中對(duì)熱應(yīng)激的耐受力。他們隨后的研究還指出,在牛早期胚胎體外發(fā)育過程中添加HSP70能夠有效緩解高溫對(duì)胚胎發(fā)育的負(fù)面影響,顯著提高熱應(yīng)激條件下的囊胚產(chǎn)量(15.9%→21.4%)[25]。

奶牛中HSPA1L和HSPA1A均為HSP70的編碼基因,二者編碼序列幾乎完全相同,常規(guī)檢測(cè)方法無法區(qū)分二者的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[62]。研究表明,當(dāng)HSPA1L啟動(dòng)子區(qū)第895位堿基處出現(xiàn)胞嘧啶缺失時(shí),荷斯坦奶牛淋巴細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激的耐受力增加,HSPA1A/L 轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著升高,HSP70蛋白表達(dá)水平升高[63]。Ortega等[64]指出,HSPA1L缺失突變能提高奶牛早期胚胎發(fā)育過程中對(duì)熱應(yīng)激的耐受力。胚胎發(fā)育早期對(duì)高溫敏感,二細(xì)胞期胚胎受到熱應(yīng)激刺激時(shí)便通過轉(zhuǎn)錄HSPA1A/L抵抗熱應(yīng)激,而HSPA1L缺失突變能使該轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步提高[64],HSP70蛋白表達(dá)增加[63],進(jìn)而幫助胚胎有效應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激造成的負(fù)面影響。他們的研究結(jié)果表明,在應(yīng)激條件下(高氧、高溫)培養(yǎng)牛胚胎,存活囊胚中HSPA1L缺失突變的頻率更高,這意味著HSPA1L缺失突變能夠增強(qiáng)奶牛胚胎對(duì)熱應(yīng)激的抵抗力,進(jìn)而提高熱應(yīng)激條件下胚胎的存活率[64]。

2.3.2PRLR基因 奶牛毛發(fā)長(zhǎng)度影響奶?？篃釕?yīng)激的能力。在炎熱環(huán)境中,被毛較短的牛能更加地高效散熱,因此這類牛對(duì)熱的耐受性更強(qiáng)[65]。研究表明,當(dāng)催乳素受體基因(PRLR)上出現(xiàn)SLICK突變時(shí),奶牛表現(xiàn)出短被毛的光滑表型,抗熱應(yīng)激的能力大大提高[62]。

催乳素(prolactin,PRL)具有抑制毛發(fā)生長(zhǎng)[66]及毛囊發(fā)育[67]的功能。當(dāng)PRLR上出現(xiàn)SLICK突變時(shí),PRL對(duì)毛發(fā)的抑制作用被放大,進(jìn)而導(dǎo)致牛呈現(xiàn)短毛、光滑表型[68]。哺乳動(dòng)物PRLR主要包括長(zhǎng)型(long form)和短型(short form)[69],而SLICK突變的PRLR長(zhǎng)度介于長(zhǎng)型PRLR和短型PRLR之間[62]。目前已知,PRLR上的SLICK突變有3種,包括SLICK1、SLICK2和SLICK3。其中,SLICK1突變發(fā)現(xiàn)于Senepol牛上,SLICK2突變發(fā)現(xiàn)于Carora和Criollo Limonero牛,而SLICK3突變?cè)贑riollo Limonero牛中被發(fā)現(xiàn)[62]。這3類突變均屬于移碼突變,能使PRLR的轉(zhuǎn)錄提前終止,形成“截短型受體”[62]。有研究指出,SLICK突變導(dǎo)致催乳素信號(hào)傳導(dǎo)過程中參與JAK2/STAT5激活的蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域被截?cái)郲70],其中7個(gè)酪氨酸殘基中有2個(gè)發(fā)生丟失[68],這或許會(huì)影響STAT5的激活[70]。不過,依賴PI3K/MAPK等途徑進(jìn)行信號(hào)傳遞的短型PRLR則不會(huì)受到影響[68]。在此基礎(chǔ)上,牛表現(xiàn)出短毛性狀,體溫調(diào)節(jié)能力也隨之增強(qiáng)[68]。

此外,SLICK1突變?cè)谔岣吲？篃釕?yīng)激能力的同時(shí)未發(fā)現(xiàn)對(duì)牛存在負(fù)面影響。Carmickle等[71]的研究表明,攜帶SLICK1等位基因的荷斯坦奶牛犢牛的出生重、平均日增重及斷奶重與野生型荷斯坦奶牛相似。Sosa等[68]指出,SLICK1等位基因雜合的荷斯坦奶牛直腸及瘤胃溫度低于野生型。SLICK1突變還提高了荷斯坦奶牛體溫調(diào)節(jié)的能力[72],并且不會(huì)對(duì)奶牛的胚胎發(fā)育造成負(fù)面影響[70]。不僅如此,由于短被毛的奶牛散熱能力更強(qiáng),對(duì)高溫的耐受性也更高,因此短被毛奶牛在炎熱環(huán)境中產(chǎn)奶量也高于野生型奶牛。而在寒冷季節(jié),短被毛奶牛的產(chǎn)奶量則與野生型奶牛相似[73]。由此可見,短被毛性狀或許能有效幫助奶牛應(yīng)對(duì)高溫環(huán)境,并提高奶牛產(chǎn)奶量[74]。

3 結(jié) 語

環(huán)境溫度過高是引發(fā)奶牛熱應(yīng)激的直接原因。而熱應(yīng)激通過影響奶牛激素水平及干擾奶牛卵母細(xì)胞、胚胎的正常發(fā)育,進(jìn)而破壞奶牛繁殖性能,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此,在奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中,急需尋找到高效、經(jīng)濟(jì)的應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激的方法。如:通過物理降溫及激素治療等手段,調(diào)節(jié)奶牛體溫及內(nèi)分泌水平;在體外胚胎生產(chǎn)過程中添加IGF1等藥物,緩解胚胎發(fā)育過程中熱應(yīng)激造成的損傷;利用基因編輯技術(shù)修飾奶牛胚胎HSPA1L、PRLR等基因,改善胚胎及奶牛耐熱性。聯(lián)合使用多種抗熱應(yīng)激手段,或?qū)母旧嫌行岣邿釕?yīng)激條件下胚胎的發(fā)育能力,具有廣闊的發(fā)展前景。