郭艷麗,李可強,白少川,王 濤,王德賀,王 麒,李蘭會*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,保定 071000;2.河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院,秦皇島 066004;3.河北省畜牧獸醫(yī)研究所,保定 071001)

禽白血病病毒E亞型(ALV-E)屬于內(nèi)源性白血病病毒。ALV-E是第一個被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒,與外源性禽白血病病毒A、B、C、D等亞群具有相似結(jié)構(gòu),由外源白血病病毒入侵宿主逆轉(zhuǎn)錄整合在雞基因組中。雞基因組中至今已發(fā)現(xiàn)400余種ALVEs,其不僅影響家禽生產(chǎn),更是種雞白血病病毒凈化的嚴重阻礙,另外還造成人用雞胚生物制品的潛在危害。ALV-E不僅自身表達,還能與其他病毒重組生成如ALV-J等新病毒亞型,造成肉雞淋巴白血病、蛋雞傳染性腫瘤等嚴重病變[1]。有實踐證明,馬立克病毒或其疫苗能誘導(dǎo)處于沉默狀態(tài)的ALVE-1、ALVE-21活化表達,誘發(fā)淋巴瘤[2]。本文對ALVE的結(jié)構(gòu)與整合分布進行綜述,并分析其對宿主功能的影響,為深入探究ALV-E的表達調(diào)控機制以及家禽白血病凈化提供參考依據(jù)。

1 ALV-E的基因組結(jié)構(gòu)

ALV-E屬于長末端重復(fù)(LTR)逆轉(zhuǎn)座子,具有典型的基因組結(jié)構(gòu)特征:5′LTR-gag-pol-env-3′LTR,長度約7.5 kb。LTR長270 bp左右,是ALV-E在宿主細胞表達的調(diào)控中心,含有啟動子、增強子、聚腺苷酸化位點等調(diào)控元件[3-4]。5′LTR發(fā)揮啟動ALV-E基因組轉(zhuǎn)錄功能,而3′LTR在外源禽白血病病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄整合到宿主基因組后形成(圖1),發(fā)揮聚腺苷酸化信號功能而終止轉(zhuǎn)錄。LTR由U3、R和U5共3個不同區(qū)域組成,U3和U5分別是基因組兩末端的復(fù)制,R是RNA末端的短重復(fù)。U3-R邊界區(qū)為轉(zhuǎn)錄起始位點,U5區(qū)包含剪接供體(SD)位點。LTR的兩末端存在雙核苷酸反向重復(fù)(5′TG和3′CA),在其整合位點上、下游產(chǎn)生4～6 bp的靶位點重復(fù)序列(TSD)[3]。有研究發(fā)現(xiàn),5′LTR的啟動子活性是3′LTR的50倍,王麒等[5]發(fā)現(xiàn)ev21的5′LTR啟動子活性是3′LTR的8倍以上,Cullen等[6]指出活化的5′LTR存在時,3′LTR不能有效啟動轉(zhuǎn)錄。盡管3′LTR在病毒自身轉(zhuǎn)錄中無啟動子活性,但原病毒順式整合在myc基因上游,myc的轉(zhuǎn)錄被3′LTR啟動而失去細胞自身的調(diào)控[7]。

圖1 ALV-E在宿主基因組整合示意圖Fig.1 Schematic diagram of ALV-E integration in host genome

gag、pol和env是ALVE的3個結(jié)構(gòu)基因。gag編碼病毒結(jié)構(gòu)的核心組分-衣殼(p27,CA)、基質(zhì)(p19,MA)和核衣殼(p12,NC)蛋白,pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT,其表達是逆轉(zhuǎn)錄病毒活性的標記)和整合酶(IN),env編碼病毒附著和滲透的功能表面糖蛋白(SU)和跨膜糖蛋白(TM)[8]。Polypurine tract(PPT)是鄰3′LTR的U3域的一段多嘌呤RNA序列,在逆轉(zhuǎn)錄和DNA正鏈合成中發(fā)揮引物結(jié)合位點作用,之后引物脫離生成完整的原病毒雙鏈DNA,正鏈合成發(fā)動是逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

p27序列完整的ALV-E表達p27蛋白,種禽的白血病凈化基于p27抗原檢測,所以ALVE的表達造成白血病凈化的假陽性。ALVE-1、ALVE-3、ALVE-21和ALVE-TYR都具備完整的p27基因,除ALVE-1不表達外,其他3個在商品雞中都有表達[9],尤其是ALVE-21具備完整的病毒基因組序列,有表達完整病毒的風險[10-11]。盡管這些ALV-E的env序列完整性更高,但其表達可能受miR-155完整靶標結(jié)合位點的抑制。

2 ALV-E的宿主整合

2.1 ALV-E的宿主整合普遍性及其檢測方法

ALV-E在雞基因組中的整合位點稱為ev基因座,隨著生物測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用,上千個ev基因座被發(fā)現(xiàn),構(gòu)成約3%的雞基因組序列[3]。除ALV-E完全凈化品系外,所有雞都攜帶有完整或缺陷的ev,每只雞平均整合5種ev,并遵循孟德爾遺傳規(guī)律垂直傳播[12-16]。家禽的高強度選擇降低了ev的整合率,Mason等[17]發(fā)現(xiàn)商品蛋雞的整合率低于肉雞和地方雞;褐殼蛋雞一般整合6～11個,肉雞有13～30個;90.3%的ev整合數(shù)量變異來源于品系內(nèi),白來航雞的ALV-E整合數(shù)量最少,最多6個,其中ALVE-1、ALVE-3、ALVE-9和ALVE-15的整合頻率最高[17-18]。

商品蛋雞ALV-E的低整合揭示其與生產(chǎn)性能的負相關(guān)關(guān)系,選育過程中剔除了有害整合。因此,建立ev的快速完全檢測方法,降低ALV-E在雞基因組中的整合頻率,對于提高家禽生產(chǎn)和管理水平是非常必要的。傳統(tǒng)的檢測方法為限制性內(nèi)切酶切割雞基因組,再用Rous-associated virus type 2(RAV-2)探針雜交的RFLPs檢測,但ALV-E的多拷貝性使RFLP應(yīng)用受到限制,而且不能滿足批量樣品的快速檢測需求。PCR檢測方法雖然簡單,但面對大規(guī)模的商業(yè)檢測仍顯不足,并且存在識別不完全性的缺點。基因組數(shù)據(jù)的爆炸性增長使熒光標記快速PCR技術(shù)得到規(guī)模應(yīng)用,obsERVer作為識別WGS數(shù)據(jù)中新型ERV整合的高通量生物信息管道,其應(yīng)用使ALV-E的凈化成為可能[17]。Mason等[17,19]利用obsERVer分析8個品系蛋雞的全基因組數(shù)據(jù),鑒定出20個ALVEs;在57個WGS數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)322個ALVEs整合位點;407個地方雞WGS中發(fā)現(xiàn)850個新的ALV-E整合位點,使ALV-E的數(shù)量增加到1 300個以上。

2.2 ALV-E宿主整合區(qū)域偏向及位點效應(yīng)

外源病毒傾向于整合在宿主染色體開放區(qū)域,尤其編碼基因附近,但只有26.7%的ALV-E整合于基因內(nèi),遠低于51.8%的隨機整合概率[15];并且基因內(nèi)整合傾向于內(nèi)含子,1.5%的外顯子整合比率低于4.9%的隨機概率;而在編碼基因上、下游10 kb區(qū)域有顯著富集,8倍于隨機整合概率(32.9%vs. 4.1%)[17,20]。另外,整合位點區(qū)域堿基構(gòu)成存在AT偏倚(59.0%),而雞基因組序列的AT比率為57.1%,但ALVEs的TSD具有49.9%的GC構(gòu)成,遠高于42.9%的基因組平均水平[21]。這些都表明了ALV-E整合的宿主基因組區(qū)域偏向性,人工或自然選擇剔除了其在雞基因內(nèi)的有害整合。

ALV-E的宿主基因組定位以及結(jié)構(gòu)特征的識別對揭示ALV-E的宿主基因調(diào)控效應(yīng)具有基礎(chǔ)地位,另外,病毒基因組的完整性及其表達水平對宿主調(diào)控作用均有影響。Mason等[17]發(fā)現(xiàn)18個ALVEs(5.6%)整合在雞CR1(chicken repeat1)元件中。葛琳涵等[22]發(fā)現(xiàn)ev21整合位點側(cè)翼區(qū)存在3個突變,其中C>T突變和8個堿基(AGTTAGTT)插入起到正調(diào)控作用,polyA起到了負調(diào)控作用。C>T突變的C等位基因增加了CDC2、CDC25C、CCNA2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,可能發(fā)揮細胞分化抑制作用與ev21的細胞腫瘤致毒性病變有關(guān)[23-24],從而導(dǎo)致宿主癌變致死。T等位基因增加了EN、GR、PR-alpha和AR轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,EN發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用可能與宿主細胞ev21的低轉(zhuǎn)錄表達及其低細胞毒性有關(guān),GR、PR-alpha和AR的轉(zhuǎn)錄結(jié)合與宿主細胞的免疫調(diào)節(jié)、抗應(yīng)激有關(guān)[25-27],保證了ev21與雞宿主的共進化表達。C型的啟動子活性顯著高于T型,推斷在C型側(cè)翼區(qū)啟動ev21高轉(zhuǎn)錄從而細胞癌變致死毒性,導(dǎo)致此類宿主全部致死,而只有ev21整合在側(cè)翼T等位基因下游的個體存活繁衍。

Chang等[10]發(fā)現(xiàn),TYR基因的ALV-E整合與其側(cè)翼polyA連鎖,而沒有ALV-E整合的側(cè)翼區(qū)不存在polyA,但紅原雞存在。這也表明,polyA可能抑制ALV-E的表達,發(fā)揮負調(diào)控作用。Wallace等[28]對人全基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),46個內(nèi)源病毒位點整合與側(cè)翼SNP存在連鎖關(guān)系。基因組數(shù)據(jù)分析揭示,ERVs一般反向整合于功能基因外部,與隨機整合理論矛盾,可能由于正向整合對典型剪切信號存在潛在干擾,揭示宿主自身強的凈化選擇效應(yīng)。

3 ALV-E的轉(zhuǎn)錄啟動活性調(diào)控

雞基因組中大約有500個相對完整的ev位點,如:ev1、ev2、ev7、ev9、ev12、ev18和ev21等,其中ev1、ev7和ev9不具感染性。有些ALV-E具備編碼完整感染病毒的能力,能夠按典型的傳染路徑感染宿主;很多序列完整的ALV-E元件由于超甲基化或者位置效應(yīng)而失活,但大部分由于內(nèi)部短缺只產(chǎn)生感染病毒粒子,或缺乏自我復(fù)制必需的編碼基因(env),或只是“單LTR”,“單LTR”的拷貝數(shù)大約是相對完整結(jié)構(gòu)的60倍[20]。

LTR區(qū)是ALV-E的表達調(diào)控中心,外源禽白血病病毒LTR是小型強啟動子和增強子活性區(qū),可以啟動病毒和鄰近基因的高表達,感染細胞的病毒RNA量可占細胞總RNA的20%[29]。LTR區(qū)的Y-box是ALV-E轉(zhuǎn)錄啟動子活性必需的,CCAAT元件發(fā)揮增強子功能,CArG盒子通過生長因子調(diào)節(jié)LTR活化。ALV-E的LTR區(qū)短于外源禽白血病病毒,缺失U3區(qū)的CCAAT等增強子元件,但包含1個拷貝的Y-box和CArG啟動子元件,還有核心聚合酶II啟動子元件(如TATA盒),而外源病毒有多個拷貝的Y-box、CCAAT元件。ALV-E與外源白血病病毒相比致瘤性弱化,可能與其LTR區(qū)增強子/啟動子元件的缺失有關(guān)。ALVEs間的主要區(qū)別在于LTR的U3區(qū),U3區(qū)包含TATA盒(TATATAA)、多聚A加尾信號(AATAAA)、M-CAT元件(CATTCCA)、CCAAT盒子(ATTGG)等,以及位于U3區(qū)上游的PPT(ACGGAGGGGGA)序列。ev2、ev4、ev5和ev6的U3缺失可能造成其表達缺陷。

LTRs元件不僅調(diào)控ALV-E自身轉(zhuǎn)錄,對鄰近基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯以及穩(wěn)定性等也發(fā)揮重要的調(diào)控作用,甚至參與調(diào)控宿主基因的轉(zhuǎn)錄表達。24 bp的LTR與SLCO1B3共轉(zhuǎn)錄,促使SLCO1B3在雞卵巢和蛋殼腺中的表達增加,形成綠色蛋殼[30-31]。ALVE-15和ALVE-ros005只有LTR區(qū),但ALVE-ros005與蛋殼顏色存在顯著負相關(guān),ALVE-15整合在GRIK2的末端內(nèi)含子內(nèi),使其3′末端外顯子轉(zhuǎn)錄缺失[31]。胡序明等[32]發(fā)現(xiàn),ALVE-1的LTR在SPF雞發(fā)育早期的肺、脾、心等器官組織中高表達,而在35 d的肺和肝表達較高,其他組織中轉(zhuǎn)錄水平較低。

人類和小鼠的LTR包含p53、OCT4、SOX2和NANOG等多達20%轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點[33],發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Montesion等[34]認為,腫瘤病發(fā)中LTR啟動活性受轉(zhuǎn)錄因子的階段性特異表達影響,并且LTR的多態(tài)性影響個體的HERV差異表達。王麒等[5]發(fā)現(xiàn),ev21的5′LTR區(qū)存在3個TATA盒子,具有強啟動子活性,而3′LTR區(qū)有1個TATA盒子,啟動子活性較弱。朱文奇等[35]的體外試驗發(fā)現(xiàn),miR-155顯著抑制內(nèi)源白血病毒ev1的表達,Chung等[36]利用雙向miRNA抑制了豬腎細胞的內(nèi)源病毒表達。牙鲆OF-ERV9的LTR衍生的OF-miRNA-307發(fā)揮超增強子功能與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控基因表達[37]。ev3在雞體內(nèi)有表達,其U3域與ev1和ev2存在1個堿基的差異,但三者的U3啟動子活性卻沒有差異[38],說明LTR上、下游的細胞序列調(diào)控元件可能參與ALV-E的轉(zhuǎn)錄。

另外,ALV-E的表達受表觀遺傳調(diào)控,如高甲基化與其表達沉默、癌變等負相關(guān)。戴開宇[39]研究發(fā)現(xiàn),去甲基化處理后LTR轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。7 524 bp的ev21全基因組序列中發(fā)現(xiàn)6個238～526 bp的CpG島,分散在5′UTR區(qū)和基因結(jié)構(gòu)域,總長占病毒序列的29.9%[40]。而Yu等[41]發(fā)現(xiàn),7.5 kb的ev1中包含813個CpG位點,白血病抗性的72品系中兩個保守域的CpG位點處于高度甲基化狀態(tài),而白血病敏感的63系處于低或中等甲基化狀態(tài),并且72品系的ALV-E組織表達遠低于63系。

ALV-E的沉默程度還受整合位點細胞序列的結(jié)構(gòu)、甲基化程度和染色體結(jié)構(gòu)等調(diào)控影響。有學(xué)者指出,整合位點上游100 bp的細胞DNA序列對ALV-E表達具有抑制作用。Conklin[38]對ALV-E表達水平與LTR區(qū)序列差異關(guān)系分析認為,ALV-E的轉(zhuǎn)錄表達受到側(cè)翼細胞序列的調(diào)控。LTR序列缺失的ev1、ev2、ev3和ev6與完整序列的ev18和ev19在以雞胚成纖維細胞為基質(zhì)的麻疹疫苗中的轉(zhuǎn)錄表達一定程度說明ALV-E序列完整性不影響其轉(zhuǎn)錄[42],更表明了甲基化表觀調(diào)控和順式作用元件調(diào)控的重要性。

4 ALV-E與蛋肉雞生產(chǎn)性能

ALV-E整合對蛋肉雞生產(chǎn)性能的影響是多方面的,相同ALV-E對不同品系可能產(chǎn)生相反影響,或?qū)δ骋黄废涤杏绊懚鴮α硪黄废悼赡軣o影響[39]。Fulton等[43]對ALV-E整合與蛋肉雞生產(chǎn)性能進行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)ALVE-15與兩個品系白來航雞的蛋白高度有相反效應(yīng),ALVE-ros004與白普里茅斯洛克雞和洛島紅雞的蛋白高度也有相反效應(yīng)。ALVE-B5與洛島紅雞的蛋重、白來航雞的蛋殼顏色和白普里茅斯洛克雞的蛋殼斷裂強度相關(guān)。ALVE-B1、ALVE-B5、ALVE-B6和ALVE-B8均整合在產(chǎn)肉性能相關(guān)的數(shù)量性狀位點附近,在肉雞中經(jīng)歷正選擇、基因頻率增加,而降低了蛋雞的生產(chǎn)性能、頻率降低[44]。ALVE-3對某品系來航雞的蛋白高度、馬立克氏病抗性等都有影響,而在其他品系則影響產(chǎn)蛋量、穿刺評分、蛋重、蛋殼顏色等。這些關(guān)聯(lián)的多變性反映了ALV-E復(fù)雜效應(yīng)。另外,ALVE結(jié)構(gòu)的完整性似乎并不與效應(yīng)顯著相關(guān),Fulton等[43]發(fā)現(xiàn)56個與性狀顯著關(guān)聯(lián)的ALV-E中結(jié)構(gòu)不完整的有27個。ALVE-3整合在HCK原癌基因內(nèi)含子區(qū),只表達gag和env糖蛋白,但有11個顯著關(guān)聯(lián)性狀。ALVE-15和ALVE-ros005雖然只有LTR區(qū),但仍有生產(chǎn)性能受其影響,ALVE-15整合在GRIK2基因的最后一個內(nèi)含子,可能提供可變啟動子或破壞基因轉(zhuǎn)錄而改變基因功能。

寧中華等[45]研究發(fā)現(xiàn),白殼蛋雞慢羽系的白血病高發(fā)率可能與ev21的整合存在直接關(guān)系,并影響蛋雞生產(chǎn)性能。另外,白萊航雞慢羽系及其后代均表現(xiàn)出對外源淋巴白血病病毒免疫性能減退、生產(chǎn)性能下降、死亡率升高等,可能都與ev21的整合有關(guān)[43,45-48]。Mason等[17]發(fā)現(xiàn),白萊航雞一般整合有2～4個ALV-E,ALVE-1和ALVE-16整合在產(chǎn)蛋性能數(shù)量性狀位點附近,對開產(chǎn)日齡、產(chǎn)蛋數(shù)和產(chǎn)蛋率均有影響,其在商品蛋雞中的整合率升高,而在肉雞的頻率降低[44]。ALV-E的存在導(dǎo)致產(chǎn)蛋率減少8%～9%,蛋重降低2.2 g,蛋比重減少0.003[43]。Yu等[41]發(fā)現(xiàn),攜帶ev10、ev19、沉默的ev1或表達特定抗原的ev3、ev6、ev21都顯著降低了母雞的產(chǎn)蛋率。

Fulton等[43]認為,ALV-E的存在可能通過3種機制影響雞生產(chǎn)性能:1)ALV-E生成病毒粒子調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)對健康產(chǎn)生不利影響,從而間接影響生產(chǎn)性能(病毒效應(yīng)),在不同品系間效應(yīng)的差異可能與遺傳背景(其他ALV-E是否存在)或者病毒抗性有關(guān);2)ALV-E整合引起的插入突變可能直接導(dǎo)致基因改變或影響基因調(diào)控(基因效應(yīng));3)ALV-E整合在數(shù)量性狀位點區(qū)域內(nèi)或附近,可作為遺傳標記,并在不同品系間由于連鎖不平衡造成效應(yīng)差異。

5 ALV-E對雞免疫性能的調(diào)控

人們很早發(fā)現(xiàn)ALV-E有助于衍生免疫[46,49],具備復(fù)制能力的ALV-E能影響宿主對外源逆轉(zhuǎn)錄病毒的先天免疫效應(yīng),其產(chǎn)物如核酸、miRNA、piRNA、lnRNA、蛋白等都能參與免疫反應(yīng);其蛋白產(chǎn)物還可以通過干擾外源病毒受體,阻止病毒轉(zhuǎn)運而抑制病毒感染[50]。ALV-E的LTR區(qū)高度保守,存在先天性免疫應(yīng)答激活轉(zhuǎn)錄因子如NF-AT、c-JUN等,其轉(zhuǎn)錄可以激活先天免疫系統(tǒng),并通過雙鏈RNA依賴的TLR3/MDA5信號通路誘導(dǎo)細胞因子如IFN的產(chǎn)生,從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[51]。

ALV-E主要通過3種方式對外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染產(chǎn)生抗性:受體干擾、抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒生殖循環(huán)(脫殼、重組和核定位)及靶標逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA形成雙鏈RNA而降解[52-55]。王歸燕[56]發(fā)現(xiàn),黃羽雞和隱性白羽雞在接種ALV-J后,ev1促進OAS、PKR和IFN-β、IFN-γ的表達,從而抑制外源性病毒的復(fù)制;同時抑制IL-18的表達,從而增強了腫瘤排斥反應(yīng)。來源于ALVE-1的反義長鏈非編碼RNA(lnc-ALVE1-AS1)過度表達使ALV-J的表達顯著降低[57-58]。內(nèi)源性EAV-HP插入SLCO1B3基因5′側(cè)翼區(qū)降低了其在肝的表達,導(dǎo)致脂肪代謝和外源物質(zhì)轉(zhuǎn)運能力降低,并可能參與免疫過程[59]。由ALV-E的gag、pol或env基因編碼的單一蛋白表達也能對宿主免疫產(chǎn)生影響。gag多聚蛋白可誘導(dǎo)機體對ALV感染的耐受性,導(dǎo)致免疫反應(yīng)延遲和淋巴腫瘤的發(fā)病率升高[60]。相反,env包膜糖蛋白的表達通過受體干擾,降低細胞受體的活性,保護雞免受外源性病毒感染,增強抵抗力[46]。Federspiel等[61]發(fā)現(xiàn),ALV-E來源的env蛋白表達雞對Rous-1病毒感染具有高抗性,而無env蛋白表達的品系卻表現(xiàn)高病毒表達、抗體反應(yīng)或病毒血癥。APOBECs作為DNA編輯器調(diào)控內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的穩(wěn)定性及其活性,APOBEC4在NDV感染早期的雞B細胞系、巨噬細胞系的表達顯著升高,可能參與ALV-E活性表達的機體宿主免疫反應(yīng)[62]。

6 小結(jié)與展望

雞一般都攜帶有完整的或缺陷性的ALV-E基因組,其遵循孟德爾遺傳規(guī)律進行垂直傳播,參與免疫調(diào)節(jié),抑制外源病毒感染與腫瘤的發(fā)生。ALV-E整合對蛋肉雞表型的影響是多方面的,主要通過3種機制影響雞生產(chǎn)性能。ALV-E表達干擾禽外源性白血病病毒的凈化,同時對宿主生理功能存在毒害性,因此其活性受到嚴密控制。obsERVer高通量檢測技術(shù)增加了ALV-E整合檢出率和位點的準確性,但ALV-E整合位置及效應(yīng)研究尚不明確。ALV-E基因結(jié)構(gòu)功能研究及obsERVer高通量檢測技術(shù)的應(yīng)用使ALV-E的凈化成為可能。在基因組測序方面,基于ALV-E數(shù)據(jù)的系統(tǒng)研究有助于新整合內(nèi)源病毒的發(fā)現(xiàn),并使ev位點作為信息標記的潛力得以挖掘。