王志珍

（中國科學院生物物理研究所，北京 100101）

鄒承魯先生是近代中國生物化學的奠基人之一，一生致力于蛋白質(zhì)結構與功能關系的研究，在細胞色素與呼吸鏈酶系、人工合成胰島素、酶活性不可逆抑制動力學、酶活性部位的柔性以及蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶等不同領域都做出了重大貢獻。

1964 年我從中國科學技術大學生物物理系畢業(yè)，被分配到中國科學院生物物理研究所。后有幸在鄒先生實驗室工作近20 年，在鄒先生的指導和幫助下，對胰島素A、B鏈相互作用、蛋白質(zhì)折疊以及幫助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶和折疊酶開展了一些研究工作。鄒先生在科學研究和做人做事上的言傳身教是我一生彌足珍貴的收獲。時值鄒先生百年誕辰，希望用這篇短文回顧鄒先生在蛋白質(zhì)折疊領域的創(chuàng)新研究及一些后續(xù)工作，以緬懷這位中國生物化學與生物物理學界德高望重的前輩。

1 人工全合成胰島素中的蛋白質(zhì)折疊問題

蛋白質(zhì)正確的三維結構是其行使生物學功能的前提。如何從線性的多肽鏈形成復雜精巧的三維結構，這就是蛋白質(zhì)折疊問題。美國國立健康研究院（NIH）的Christian Anfinsen 在上世紀五、六十年代，系統(tǒng)研究了牛胰核糖核酸酶A的氨基酸序列與生物學活性構象之間的關系，提出了著名的熱力學假說 “一個天然蛋白質(zhì)在其生理環(huán)境中的三維結構是整個系統(tǒng)的吉布斯自由能最低的結構”，也就是我們常說的“蛋白質(zhì)一級結構決定高級結構”的原理［1］。這一發(fā)現(xiàn)填補了分子生物學的中心法則中遺傳信息從一維多肽鏈傳遞到三維蛋白質(zhì)的空白，開創(chuàng)了近代蛋白質(zhì)折疊研究的時代。Anfinsen也因此獲得了1972年的諾貝爾化學獎。

幾乎同一時期（1958年），包括鄒承魯先生在內(nèi)的中國最優(yōu)秀的生物化學家和有機化學家們，提出了向新中國國慶10 周年獻禮的項目“合成一個蛋白質(zhì)”。胰島素是當時唯一被測定氨基酸序列的蛋白質(zhì)，由分別含有21和30個氨基酸殘基的A、B兩條肽鏈組成，鏈間由兩個二硫鍵連接，A鏈還有一個鏈內(nèi)二硫鍵。當時國際上已經(jīng)有了合成不同長度肽段的經(jīng)驗，但像胰島素這樣含有兩條肽鏈和多個二硫鍵的蛋白質(zhì)人工全合成還沒有先例。這是一個從0到1的創(chuàng)舉！最為現(xiàn)實的合成路線可能是分別合成A鏈和B鏈，然后通過巰基的氧化使兩條鏈正確組合，而這一方案中最為關鍵的問題是合成的A鏈和B鏈能否氧化而形成天然的胰島素分子。當時35歲的鄒先生，帶領杜雨蒼、魯子賢、張友尚、許根俊等幾位大學畢業(yè)不久的年輕研究人員承擔起“胰島素拆合”工作：把天然胰島素分子拆分成A鏈和B鏈，再把分開的A鏈和B鏈重組成具有生物學活性的胰島素分子。1959 年，鄒先生小組就實現(xiàn)了胰島素的成功拆合，重組的胰島素活力恢復到10%。由于當時的政治環(huán)境，國內(nèi)科技期刊普遍?？?，同時德國和美國也在進行胰島素合成的競爭，鄒先生小組的結果沒有得到及時發(fā)表。而1960 年Dixon和Wardlaw［2］在《自然》（Nature）雜志上報道了還原的胰島素A 鏈和B 鏈共同氧化得到1%~2%的胰島素活力。1961年10月，鄒先生小組才在《中國科學》復刊后的第一期上發(fā)表了1959年就得到的結果［3］。無論從時間上還是在質(zhì)量上，中國人進行的胰島素A、B鏈重組都領先于世界。這一成果不但解決了胰島素的合成路線問題，也確保了人工合成的A鏈和B鏈能夠以高產(chǎn)率重組成為活性胰島素分子。

胰島素A、B 鏈拆合與Anfinsen 的核糖核酸酶復性工作非常相似，也幾乎是同時完成的。后者是將變性狀態(tài)的4個二硫鍵全部還原的核糖核酸酶肽鏈重新氧化折疊恢復活力。核糖核酸酶只有1條肽鏈，其4個二硫鍵的所有組合方式有105種可能性；而胰島素則是由2 條肽鏈組成，2 條肽鏈可能以不同的比例與方式組合，其6個巰基所有的可能組合方式則是無窮多，其復性問題遠遠復雜得多。當時鄒先生小組總結出“天然胰島素的結構是所有AB異構物中最穩(wěn)定的結構之一”的重要結論。但是由于此工作的任務導向性加上“文革”的種種干擾，他們未能有機會去提煉A、B鏈拆合成功所蘊含的蛋白質(zhì)折疊問題。

20世紀70年代末 “科學的春天”到來，鄒承魯先生在中國科學院生物物理研究所重拾胰島素A、B鏈重組的“老題”，新做其機制的研究。我從國外訪學回國加入了鄒先生領導的這一課題，作為co-PI爭取到美國國立健康研究院的國際研究基金。在鄒先生指導下，我們運用各種生物物理和生物化學方法研究胰島素A、B 鏈和各種化學修飾的A、B鏈在不同溶液條件下的相互作用，進一步總結出胰島素分子折疊的觀點：“胰島素A、B 鏈本身已經(jīng)具有一定的結構，含有形成天然胰島素正確結構的全部信息，能在溶液中相互識別和相互作用，從而導致3 個二硫鍵（2 個鏈間二硫鍵和1 個鏈內(nèi)二硫鍵）正確配對，形成結構最穩(wěn)定的天然胰島素分子”［4］，闡明從人工全合成的胰島素A 鏈和B 鏈生成天然胰島素分子的蛋白質(zhì)折疊規(guī)律，揭示了人工合成胰島素中A、B鏈成功重組的理論基礎。

2 蛋白質(zhì)折疊與分子伴侶

1991 年中國啟動了國家基礎性研究重大項目計劃（“攀登計劃”）。鄒承魯先生承擔了首批30個項目中的“新生肽鏈及蛋白質(zhì)折疊的研究”，下設“蛋白質(zhì)折疊與去折疊的一般規(guī)律”（周海夢）、“酶活性部位柔性”（周筠梅）、“新生肽鏈折疊”（靜國忠）、“蛋白質(zhì)結構預測與分子設計”（王志新和潘憲明）、“幫助蛋白質(zhì)折疊的生物大分子——分子伴侶和折疊酶”（王志珍）5 個子課題。這一項目取得了一批具有國際水平的研究成果，同時編寫了《攀登計劃普及叢書》中的“第二遺傳密碼？——新生肽鏈及蛋白質(zhì)折疊的研究”，用通俗語言向社會大眾講述蛋白質(zhì)折疊的科學問題。

當時主流的蛋白質(zhì)折疊研究是用完全變性蛋白質(zhì)的完整肽鏈重新折疊進行的。鄒先生很早就意識到細胞中新生肽鏈的折疊與蛋白質(zhì)在體外試管里的折疊是不一樣的。1988 年，他在《生物化學》（Biochemistry）雜志上發(fā)表文章［5］，提出了新生肽折疊的一個假說：在細胞中，新生肽的卷曲折疊在其合成過程中就已經(jīng)開始了，這些最初形成的結構隨著肽鏈在核糖體上延伸的同時進行調(diào)整，可能與它在最終全長蛋白質(zhì)中的天然構象并不一致，并在合成完成后經(jīng)最終的修正而完成折疊。這就指出了一個非常重要的科學問題：細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)是如何折疊的？

胰島素拆合以及Anfinsen核糖核酸酶復性都是在體外較低的蛋白質(zhì)濃度和較溫和的氧化條件下實現(xiàn)的。細胞內(nèi)新生肽鏈折疊和成熟是在相對高的溫度、相當高的濃度而又十分擁擠的環(huán)境中以極快的速度和極高的保真度高效進行，往往需要分子伴侶和折疊酶兩類作用機制不同的“幫助蛋白”保駕護航。折疊酶能夠催化蛋白質(zhì)折疊過程中二硫鍵形成、脯氨酸順反異構等化學鍵變化；而分子伴侶是在20 世紀80 年代才發(fā)現(xiàn)的“一類具有相似功能的不同蛋白質(zhì)，能幫助促進其他大分子（包括蛋白質(zhì)、核酸）進行非共價的折疊、解折疊、組裝、解組裝，但并不是后者發(fā)揮正常生物學功能時的永久組成部分”，確切地說，分子伴侶是蛋白質(zhì)一種新功能的定義。

在研究胰島素A、B鏈重組機制的過程中，我們已經(jīng)開始思考細胞內(nèi)幫助胰島素折疊的分子，并成功運用蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）獲得高效的重組。在此基礎上，根據(jù)對分子伴侶新概念的認識，提出了“PDI既是酶又是分子伴侶”的假說，并為此假說提供了一系列的實驗支持［6］。我們用實驗區(qū)分了PDI固有的且相互獨立的異構酶和分子伴侶兩種活力，揭示PDI幫助生理底物蛋白的折疊需要其異構酶和分子伴侶兩種活力協(xié)同作用，缺一不可［7］。原核生物大腸桿菌中的DsbC 相應于真核生物的PDI，我們也鑒定了DsbC 的分子伴侶活力，這是在大腸桿菌周質(zhì)腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)的首個分子伴侶［8］。這些發(fā)現(xiàn)不僅僅是發(fā)現(xiàn)一個蛋白質(zhì)新的活性，更重要的是打破了折疊酶和分子伴侶這兩大類幫助蛋白的界限。PDI也是分子伴侶的概念，已為國內(nèi)外同行廣泛接受，特別是分子伴侶概念的提出者John Ellis 在其綜述文章中肯定了PDI 的分子伴侶特性［9］，他曾一度斷言“PDI不是分子伴侶”。

通過與結構生物學家合作，我們最終解析了人源PDI 氧化態(tài)和還原態(tài)的晶體結構［10］，直接展示了PDI氧化還原調(diào)控的構象變化及其結合底物的不同模式，總結出PDI家族蛋白行使分子伴侶活力所需要的結構特征。我們進一步發(fā)現(xiàn)，在細胞應激條件下PDI發(fā)生磷酸化，實現(xiàn)其異構酶和分子伴侶活力兩種功能間的切換［11］。

30 年來，我們課題組新一代研究人員廣泛運用新知識和新技術，深入研究了PDI及其家族成員幫助蛋白質(zhì)氧化折疊的分子機制和生物學功能，重構以PDI與其上游氧化酶Ero1α為中樞、多種過氧化物酶并行參與的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)了關鍵酶的翻譯后修飾對調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊和氧化還原穩(wěn)態(tài)的全新方式和一系列新的認識。通過細胞和模式生物的研究，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)氧化折疊和氧化還原穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)與衰老、腫瘤、心血管病等發(fā)病機制密切聯(lián)系起來，為這些疾病的干預或治療提供新的策略。2022 年王磊研究員和我應邀在《Trends in Biochemical Sciences》期刊發(fā)表綜述文章，全面總結了酵母、植物、哺乳動物的蛋白質(zhì)氧化折疊機制，深入討論了蛋白質(zhì)氧化折疊在不同生理和病理過程中的作用［12］。

3 推動學界認識中國科學家對蛋白質(zhì)折疊早期研究的巨大貢獻

對蛋白質(zhì)分子結構的認識最早來自于蛋白質(zhì)變性的研究，蛋白質(zhì)變性成為蛋白質(zhì)折疊問題研究的前奏和基礎。20 世紀20 年代中國杰出生物化學家吳憲教授基于其在北平協(xié)和醫(yī)學院生化系開展的蛋白質(zhì)變性實驗的研究工作，提出了世界上第一個“蛋白質(zhì)變性”理論：天然可溶性蛋白質(zhì)的長肽鏈一定是由氨基酸的各種極性基團被分子內(nèi)的某種次級鍵按一定方式連接而形成有規(guī)律的折疊，使蛋白質(zhì)分子具有一種緊密的構型（即今天的“conformation（構象）”概念）。蛋白質(zhì)的這種次級鍵一旦被物理、化學的力破壞，構型就被打開，肽鏈則由有規(guī)律的折疊而變?yōu)闊o序、松散的形式，即發(fā)生了變性。1929 年他在第13 屆國際生理學大會上系統(tǒng)闡述了這一理論，隨后于1931 年以英文發(fā) 表 在《Chinese Journal of Physiology》 雜 志上［13］。然而這一重要發(fā)現(xiàn)在當時并沒有得到廣泛的關注。學界更為人知的反倒是5年后Mirsky和諾獎獲得者Pauling 共同發(fā)表的非常類似的蛋白質(zhì)變性理論的工作［14］。

鄒承魯先生很早就關注到吳憲教授“蛋白質(zhì)變性”理論的學術貢獻，他認為中國大多數(shù)生物化學工作者也許知道吳憲的名字，但并不熟悉吳憲對世界生物化學作出的重大貢獻，沒有充分認識吳憲在世界生物化學發(fā)展史上所占有的地位，必須大力宣傳中國科學家的科研成就，弘揚他們的科學精神。1993年吳憲教授誕辰100周年，時任中國生物化學與分子生物學學會理事長的鄒先生就在第七屆全國生化大會上，專門組織了“紀念吳憲的蛋白質(zhì)變性理論”的專題討論會。鄒先生邀請了吳憲教授之子、美國康奈爾大學的吳瑞教授介紹吳憲教授一生主要的科學發(fā)現(xiàn)，他本人則詳細介紹了吳憲教授在蛋白質(zhì)變性領域所做的開創(chuàng)性貢獻。

1995 年，蛋白質(zhì)研究的前輩、著名生化學家哈佛大學John Edsall 教授把吳憲教授1931 年發(fā)表在《Chinese Journal of Physiology》雜志上的文章重新全文印發(fā)在《Advances in Protein Chemistry》上，并配發(fā)他親自撰寫的評論“吳憲與第一個蛋白質(zhì)變性理論（1931）”［15］，確定了吳憲是認識到蛋白質(zhì)分子天然狀態(tài)和變性狀態(tài)之間關系的第一人，他的理論是該領域的里程碑，在國際生化界還原歷史的本來面目。我看到Edsall 的這篇文章十分激動，隨即與鄒先生一起寫了一篇評述文章《立足國內(nèi) 走向世界——從吳憲教授六十四年前一篇論文的重新發(fā)表談起》［16］，進一步介紹了中國科學家在蛋白質(zhì)折疊研究中作出的國際公認的巨大貢獻以及對此的思考。鄒先生強調(diào)了吳憲十余年的研究積累都是在中國的實驗室里完成的，在發(fā)表了12 篇論文后才提出一個理論，體現(xiàn)了研究成果嚴謹和扎實。鄒先生特別指出吳憲的工作盡管是用英文發(fā)表，沒有得到應有的關注；這一點他自己也深有體會，胰島素重組的工作同樣是用英文發(fā)表，也沒有及時在國際上得到應有的肯定。鄒先生30 年前呼吁中國的科學必須“沖出亞洲，走向世界”，在今天仍然具有極大的重要性和現(xiàn)實意義?？茖W研究必須堅持開放，把大門開得更大，把科學和人才的國際交流做得更有創(chuàng)新性、更加活躍。

4 展 望

隨著AlphaFold的橫空出世［17］，科學家已經(jīng)能夠依據(jù)一級序列相當準確地計算預測出幾乎所有蛋白質(zhì)的三維結構，甚至有人認為人工智能已經(jīng)解決了蛋白質(zhì)折疊問題。三維結構只是蛋白質(zhì)折疊在熱力學上的終點，姑且不談蛋白質(zhì)折疊是否只有唯一的終點，鄒承魯先生早在1988 年提出新生肽折疊模型時就指出，多肽鏈折疊是一個不斷變化的動態(tài)過程，蛋白質(zhì)折疊更重要的是從不斷延伸的新生肽鏈起點到天然構象終點間的過程，也就是蛋白質(zhì)折疊的動力學問題。這也許是當前AlphaFold 應當努力的方向之一［18］。細胞內(nèi)新生肽鏈成為有活性的功能成熟蛋白質(zhì)過程，則是更為復雜的廣義的蛋白質(zhì)折疊問題。核糖體孔道對正在翻譯的新生肽鏈形成初始結構非常重要。在翻譯進行的同時或翻譯完成后，新生肽鏈往往還需經(jīng)歷如二硫鍵形成、N-糖基化、蛋白酶剪切等各種修飾加工，這些修飾與肽鏈的折疊也密切相關。新生肽鏈還需要被轉(zhuǎn)運到特定亞細胞結構定位包括分泌到胞外，才能發(fā)揮特定的生物功能。這些過程往往要經(jīng)歷跨膜甚至是多次的跨膜，一般來說蛋白質(zhì)需要解折疊才能跨膜，跨膜后的蛋白質(zhì)又需要重折疊。錯誤折疊的蛋白質(zhì)需要被及時清除。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊在各個步驟都涉及與其他生物大分子特別是分子伴侶的相互作用。任何一個環(huán)節(jié)出問題都會引起蛋白質(zhì)折疊的錯誤和病變的風險。未來將發(fā)展更高分辨率、更快速的成像技術，拍攝在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊更加精準精細的動態(tài)電影，從而揭開蛋白質(zhì)折疊的真實面目。