張文 李夢(mèng)茹 王菁 張傳亮 段辰星 宋丹丹 黃茂發(fā) 羅廷榮 梁晶晶 李曉寧

摘要：【目的】構(gòu)建鼠源III型中間絲蛋白Desmin真核/原核表達(dá)載體，明確鼠源Desmin蛋白生物學(xué)功能，為在體外及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)中鑒定Desmin互作蛋白及探索其作用網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)RT-PCR克隆Desmin基因，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Desmin-Flag和真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag，以IPTG對(duì)原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)ProtParam、ProtScale、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在線(xiàn)軟件對(duì)Desmin蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】鼠源Desmin基因長(zhǎng)1410 bp，選用pGEX-4T-1載體和pcDNA3.0載體分別成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Desmin-Flag和真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag。原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Desmin-Flag轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)出70 kD的融合蛋白Desmin-Flag；真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，通過(guò)Western blotting在56 kD處檢測(cè)到Flag標(biāo)簽，即Desmin蛋白能在真核細(xì)胞成功表達(dá)，且主要定位在細(xì)胞質(zhì)。Desmin蛋白由470個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為54 kD，分子式為C2299H3722N688O755S13，理論等電點(diǎn)（pI）為5.21，屬于不穩(wěn)定蛋白；蛋白脂溶系數(shù)為79.94，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.721，推測(cè)為親水性蛋白；無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽；其二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（占67.59%）、無(wú)規(guī)則卷曲（占22.39%）、β-轉(zhuǎn)角（占1.92%）和延伸鏈（占8.10%）構(gòu)成。【結(jié)論】鼠源Desmin蛋白在原核表達(dá)體系中主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)，在真核細(xì)胞中表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈骨架結(jié)構(gòu)分布，其理化性質(zhì)不穩(wěn)定，屬親水性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。Desmin作為一種重要的III型中間絲蛋白，在神經(jīng)肌肉組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及與相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用方面發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：鼠源；Desmin基因；原核表達(dá)；真核表達(dá)；生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S865.13? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0609-09

Abstract：【Objective】To construct an eukaryotic/prokaryotic expression vector for murine type III intermediate filamentary Desmin protein， to clarify the biological functions of murine Desmin protein， and to provide a theoretical basis for identifying Desmin-interacting proteins and exploring their action networks in in vitro and intracellular expression systems. 【Method】The Desmin gene was cloned by RT-PCR， and the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-Desmin-Flag and the eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Desmin-Flag were constructed respectively， and the expression of the prokaryotic expression vector was induced by IPTG. ProtParam， ProtScale， TMHMM-2.0， SignalP-5.0， SOPMA and SWISS-MODEL were used for bioinformatics analysis of Desmin protein. 【Result】The murine Desmin gene was 1410 bp long. pGEX-4T-1 vector and pcDNA3.0 vector were used to successfully construct the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-Desmin-Flag and the eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Desmin-Flag respectively. Prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-Desmin-Flag was transformed into Escherichia coli and successfully expressed a 70 kD fusion protein Desmin-Flag， after induction by IPTG. The eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Desmin-Flag was transfected with BHK-21 cells and the Flag tag was detected at 56 kD by Western blotting， in other words，the Desmin protein was successfully expressed in eukaryotic cells and was mainly localized in the cytoplasm. Desmin protein consisted of 470 amino acids residues with a molecular weight of 54 kD， a molecular formula of C2299H3722N688O755S13 and a theoretical isoelectric point （pI） of 5.21， which was an unstable protein； its lipolysis coefficient was 79.94 and its mean hydrophilicity coefficient （GRAVY） was -0.721. It was presumed to be a hydrophilic protein； there was no transmembrane structural domain and signal peptide； its secondary structure consisted of α-helix （67.59%）， random coil （22.39%）， β-turn （1.92%） and extended chain （8.10%）. 【Conclusion】In the prokaryotic expression system， murine Desmin protein is mainly expressed in the form of inclusion bodies， while in eukaryotic cells， it is mainly expressed in the cytoplasm， with skeletal structure distribution， unstable physical and chemical properties， and no transmembrane domain or signal peptide. It is a hydrophilic protein， Desmin， as an important type III intermediate filament protein， plays an important role in signal transduction and interaction with related proteins in neuromuscular tissue.

Key words： murine； Desmin gene； prokaryotic expression； eukaryotic expression； bioinformatics analysis

Foundation items：National Natural Science Foundation of China （31902311）

0 引言

【研究意義】動(dòng)物細(xì)胞由細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架及細(xì)胞器組成，維持其正常功能很大程度上取決于細(xì)胞的機(jī)械性能，而細(xì)胞骨架的完整性決定著細(xì)胞機(jī)械性能（Charrier et al.，2018）。細(xì)胞骨架由微管（Microtubule）、微絲（Microfilament）和中間絲（Intermediate filament）構(gòu)成。各類(lèi)真核細(xì)胞都包含有微絲和微管，高級(jí)真核細(xì)胞還特有中間絲。中間絲于1968年首次在肌肉中被描述，此后在生化鑒定中發(fā)現(xiàn)III型中間絲蛋白Desmin（Gomes et al.，2022）。大多數(shù)疾病會(huì)引起細(xì)胞骨架發(fā)生變化，其中又以中間絲變化最顯著。根據(jù)其分布位置及功能，可將中間絲蛋白分成5種類(lèi)型：I型為細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin，CK），分布在上皮細(xì)胞；II型為毛發(fā)角蛋白（Hair keratin），分散在毛發(fā)及其他附屬器官；III型為Desmin蛋白，基本分布在肌肉中（Joanne et al.，2021）；IV型為神經(jīng)原纖維蛋白（Internexin nestin synemin syncoilin），分布在神經(jīng)纖維和肌纖維等；V型為核層蛋白，廣泛存在于各種細(xì)胞中。Desmin是一種肌肉特異性蛋白，在維持肌肉機(jī)械完整性和肌肉組織收縮性方面發(fā)揮重要作用（Paulin and Li，2004；Hakibilen et al.，2022），因此開(kāi)展Desmin基因生物學(xué)特性研究對(duì)揭示神經(jīng)肌肉組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機(jī)理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)的中間絲生物學(xué)研究結(jié)果表明，細(xì)胞骨架張力、細(xì)胞核形狀所體現(xiàn)的機(jī)械化學(xué)信號(hào)是調(diào)節(jié)組織發(fā)育及其維護(hù)的基礎(chǔ)。尤其是在肌肉中，機(jī)械力的正確傳播和感知需要多個(gè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核成分的協(xié)調(diào)，而這種胞內(nèi)通信的主要分子就是Desmin（Capetanaki et al.，2007，2015）。Desmin不僅將收縮的肌原纖維連接到質(zhì)膜、細(xì)胞核和線(xiàn)粒體，還能與線(xiàn)粒體直接相互作用。Desmin突變或缺乏引起的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)紊亂致使肌原纖維組織損害，進(jìn)而導(dǎo)致線(xiàn)粒體分布、形態(tài)及其功能發(fā)生變化（Dayal et al.，2020）。Desmin蛋白還能調(diào)節(jié)蛋白平衡及細(xì)胞大小，在骨骼肌中Desmin動(dòng)力學(xué)的變化可促進(jìn)分解代謝，即對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性反應(yīng)（Agnetti et al.，2021）；Desmin蛋白在營(yíng)養(yǎng)不良肌肉的萎縮、生物性能和脆弱性中也發(fā)揮著重要作用（Ferry et al.，2020）。當(dāng)Desmin纖維網(wǎng)絡(luò)丟失，肌纖維中的Desmin形成異常聚集體，引起的相關(guān)疾病特征為非壓實(shí)型心肌病、心臟傳導(dǎo)缺陷和冠狀動(dòng)脈夾層（Tamiya et al.，2020），臨床表現(xiàn)為異質(zhì)性，如骨骼肌病、心肌病、平滑肌病及呼吸缺陷等（Goldfarb and Dalakas，2009）。還有研究表明，Desmin蛋白對(duì)于竇房結(jié)的結(jié)構(gòu)及功能至關(guān)重要，對(duì)心律失常的影響十分顯著（Mavroidis et al.，2020），缺乏Desmin蛋白會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭的結(jié)構(gòu)和功能障礙（Eiber et al.，2020）。Winter等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)骨骼肌蛋白穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生熱休克蛋白，而加速Desmin及其伴侶分子發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞骨架和肌纖維發(fā)生障礙。Langer等（2021）研究證實(shí)，Desmin基因突變后，即使大鼠偏心負(fù)荷其骨骼肌也不受急性肌肉損傷的影響。此外，Desmin蛋白可作為細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑（Kural-Mangit et al.，2021），即揭示Desmin的核功能可為研究其生物學(xué)意義提供新見(jiàn)解?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)人類(lèi)Desmin蛋白已有深入研究，但有關(guān)于鼠源Desmin的研究相對(duì)較少，因此亟待通過(guò)構(gòu)建真核/原核表達(dá)載體及開(kāi)展生物信息學(xué)分析進(jìn)一步揭示鼠源Desmin蛋白的生物學(xué)特性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)構(gòu)建鼠源Desmin基因真核/原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)，明確鼠源Desmin蛋白生物學(xué)功能，為在體外及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)中鑒定Desmin互作蛋白及探索其作用網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

BHK-21細(xì)胞、pcDNA3.0載體、pGEX-4T-1載體、細(xì)胞爬片由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；總RNA提取試劑盒、膠回收純化試劑盒、氨芐青霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；大腸桿菌（DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞）、EcoR I/Not I限制性?xún)?nèi)切酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒、pMD18-T載體及T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；3周齡昆明小白鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要儀器設(shè)備：超聲波破碎儀器（JY92-Ⅱ）和分散均質(zhì)機(jī)（S10）購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；共聚焦掃描成像顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；分光光度計(jì)（NanoDrop-1000）購(gòu)自L(fǎng)imited基因有限公司。

1. 2 鼠源Desmin基因擴(kuò)增與測(cè)序

使用總RNA提取試劑盒提取昆明小白鼠肌肉組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為Desmin基因擴(kuò)增模板，擴(kuò)增引物序列信息見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：Max PCR Master Mix（2×Premix）12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 18 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，加入poly（A）尾，反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃ 30 min，純化回收后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pMD18-T-Desmin普通引物。

1. 3 Desmin基因原核表達(dá)

以pMD18-T普通引物質(zhì)粒為模板，選用原核表達(dá)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，測(cè)序正確后抽提質(zhì)粒。質(zhì)粒pMD18-T-Desmin原核引物和pGEX-4T-1載體分別用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，使用T4連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Desmin-Flag，同時(shí)轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定后對(duì)陽(yáng)性重組菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在菌液中按合適比例加入0.5 mmol/L IPTG，選擇不同溫度（28和30 ℃）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色鑒定和Western blotting檢測(cè)。

1. 4 Desmin基因真核表達(dá)

以pMD18-T普通引物質(zhì)粒為模板，選用真核表達(dá)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，測(cè)序正確后抽提質(zhì)粒。質(zhì)粒pMD18-T-Desmin真核引物和pcDNA3.0載體分別用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，使用T4連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag，測(cè)序正確后轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染24 h的蛋白樣品進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證，采用特異性的Flag標(biāo)簽確認(rèn)表達(dá)情況。

1. 5 Desmin基因生物信息學(xué)分析

構(gòu)建的原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體經(jīng)深圳華大基因科技有限公司測(cè)序鑒定后，通過(guò)ProtParam分析Desmin蛋白理化性質(zhì)，使用ProtScale預(yù)測(cè)Desmin蛋白親/疏水性，采用TMHMM-2.0預(yù)測(cè)Desmin蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，運(yùn)用SignalP-5.0預(yù)測(cè)Desmin蛋白信號(hào)肽，并利用SOPMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測(cè)Desmin蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 鼠源Desmin基因擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果

以小鼠肌肉組織總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，首先以普通引物擴(kuò)增Desmin基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出大小約1400 bp的特異性條帶（圖1-A），與預(yù)期結(jié)果一致。取5管克隆載體轉(zhuǎn)化的菌液進(jìn)行Desmin基因PCR鑒定，結(jié)果顯示泳道1和泳道4的培養(yǎng)菌液能擴(kuò)增出Desmin基因（圖1-B），送華至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序合格后抽提質(zhì)粒，并命名為pMD18-T-Desmin普通引物。

2. 2 Desmin基因原核表達(dá)結(jié)果

2. 2. 1 Desmin基因原核表達(dá)載體構(gòu)建 以克隆質(zhì)粒pMD18-T-Desmin普通引物為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示得到1410 bp的目的條帶（圖2-A），與預(yù)期結(jié)果一致。取克隆質(zhì)粒pMD18-T-Desmin原核引物轉(zhuǎn)化的DH5α菌液進(jìn)行Desmin基因PCR鑒定，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確后抽提質(zhì)粒，并命名為pMD18-T-Desmin-Flag。pMD18-T-Desmin-Flag和pGEX-4T-1載體用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，然后以T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取3管原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Desmin-Flag轉(zhuǎn)化菌液進(jìn)行Desmin基因PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示泳道2和泳道3的菌液能擴(kuò)增出Desmin基因條帶（圖2-B），測(cè)序合格后抽提質(zhì)粒，再以EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果獲得2條目的條帶，分別是4969 bp的pGEX-4T-1載體和1410 bp的Desmin基因（圖2-C），因此可確定原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Desmin-Flag構(gòu)建成功。

2. 2. 2 Desmin蛋白原核表達(dá)及鑒定結(jié)果 以原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Desmin-Flag轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，加入0.5 mmol/L IPTG，分別在28和30 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h，然后采用考馬斯亮藍(lán)對(duì)融合蛋白Desmin進(jìn)行鑒定。結(jié)果（圖3）顯示，在28和30 ℃誘導(dǎo)下均有可溶性的融合蛋白Desmin表達(dá)，但主要以包涵體的形式表達(dá)，蛋白大小與預(yù)期結(jié)果相符，在70 kD處出現(xiàn)目的條帶。

2. 2. 3 融合蛋白Desmin表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 由于pGEX-4T-1載體本身攜帶有GST標(biāo)簽，而構(gòu)建的原核表達(dá)載體設(shè)計(jì)有Flag標(biāo)簽，因此在誘導(dǎo)表達(dá)后取相應(yīng)的融合蛋白樣品以GST標(biāo)簽（圖4-A）和Flag標(biāo)簽（圖4-B）進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證誘導(dǎo)表達(dá)情況。結(jié)果表明，在28和30 ℃下以0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，均有可溶性Desmin蛋白表達(dá)。

2. 3 Desmin基因真核表達(dá)結(jié)果

2. 3. 1 Desmin基因真核表達(dá)載體構(gòu)建 以克隆質(zhì)粒pMD18-T-Desmin普通引物為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示得到1410 bp的目的條帶（圖5-A），與預(yù)期結(jié)果相符。取克隆載體pMD18-T-Desmin真核引物轉(zhuǎn)化的DH5α菌液進(jìn)行Desmin基因PCR檢測(cè)，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確后抽提質(zhì)粒，并命名為pMD18-T-Desmin-Flag。pMD18-T-Desmin-Flag和pcDNA3.0載體用EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切，然后以T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取4管真核表達(dá)載體pcDNA 3.0-Desmin-Flag轉(zhuǎn)化的菌液進(jìn)行Desmin基因PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示泳道1～泳道4的菌液均能擴(kuò)增出Desmin基因條帶（圖5-B），測(cè)序合格后抽提質(zhì)粒，再以EcoR I和Not I進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果獲得2條目的條帶，分別是5427 bp的pcDNA 3.0載體和1410 bp的Desmin基因（圖5-C），因此可確定真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag構(gòu)建成功。

2. 3. 2 真核表達(dá)載體Western blotting檢測(cè)結(jié)果 培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，待其狀態(tài)良好時(shí)轉(zhuǎn)移至6孔板中，以空載體pcDNA3.0和真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染24 h后收集蛋白樣品，采用Flag標(biāo)簽進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag的孔細(xì)胞在56 kD處能檢測(cè)到Flag標(biāo)簽，而轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.0的細(xì)胞孔檢測(cè)不到Flag標(biāo)簽（圖6），表明真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag能成功表達(dá)。

2. 3. 3 pcDNA 3.0-Desmin-Flag在BHK-21細(xì)胞中的共聚焦定位 培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，待其狀態(tài)良好時(shí)轉(zhuǎn)移至6孔板中，同時(shí)在6孔板中鋪上細(xì)胞爬片，以真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后以鼠源Flag抗體為一抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA），抗小鼠綠色熒光為二抗，同時(shí)用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色（藍(lán)色），結(jié)果證實(shí)Desmin蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)（圖7）。

2. 4 Desmin基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 4. 1 Desmin蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果 在不考慮蛋白翻譯后修飾、蛋白多聚體的情況下，利用ProtParam對(duì)Desmin蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明該蛋白由470個(gè)氨基酸殘基組成（表2），分子量為54 kD，分子式為C2299H3722N688O755S13，理論等電點(diǎn)（pI）為5.21。Desmin蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為52.24，屬于不穩(wěn)定蛋白；蛋白脂溶系數(shù)為79.94，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.721，故推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

2. 4. 2 Desmin蛋白親/疏水性、信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 通過(guò)ProtScale對(duì)Desmin蛋白親/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖8）顯示，分?jǐn)?shù)<0的區(qū)域較密集，分?jǐn)?shù)>0的區(qū)域較分散，綜合蛋白理化性質(zhì)中的GRAVY為-0.721，初步判斷該蛋白為親水性蛋白。TMHMM 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果（圖9）表明，Desmin蛋白不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，即該蛋白是以非跨膜蛋白的形式表達(dá)。利用SignalP-5.0對(duì)Desmin蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖10）表明該蛋白無(wú)信號(hào)肽位點(diǎn)，即Desmin蛋白不屬于分泌蛋白，而是經(jīng)游離核糖體合成后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。

2. 4. 3 Desmin蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果（圖11）顯示，Desmin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（占67.59%）、無(wú)規(guī)則卷曲（占22.39%）、β-轉(zhuǎn)角（占1.92%）和延伸鏈（占8.10%）構(gòu)成。利用SWISS-MODEL構(gòu)建Desmin蛋白可能的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果表明，Desmin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)GMQE值為0.77，與模板序列匹配度高（圖12），Seq Identity為96.38%，即預(yù)測(cè)結(jié)果可靠。

3 討論

鼠源Desmin是由470個(gè)氨基酸組成的一種不穩(wěn)定肌肉組織中間絲蛋白，其N(xiāo)端主要調(diào)控蛋白結(jié)合，C端提供二聚化結(jié)合位點(diǎn)，且包含1個(gè)α-螺旋的桿狀體區(qū)，此桿狀體區(qū)又分成1A、1B、2A和2B等4個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，存在于細(xì)胞核周邊，通過(guò)網(wǎng)格蛋白作用使Desmin蛋白連接于肌原纖維的Z線(xiàn)上，促使相近的肌原纖維相互連接，而發(fā)揮動(dòng)力傳輸效應(yīng)，在維持肌肉組織收縮器官的結(jié)構(gòu)及機(jī)械完整性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用（Paulin and Li，2004）。Desmin是翻譯后修飾的目標(biāo)，如磷酸化及非酶修飾。其中，磷酸化和二磷酸腺苷—核糖基化的主要作用是分解中間絲，涉及多個(gè)重要的生物過(guò)程，包括肌細(xì)胞的產(chǎn)生與融合、肌肉收縮、肌肉萎縮及肌細(xì)胞分裂（Winter et al.，2014）。已有研究表明，通過(guò)野生AB型斑馬魚(yú)肌肉組織Desmin蛋白和層黏連蛋白B間免疫共沉淀，證實(shí)Desmin蛋白與層黏連蛋白B間的相互作用可能是新型核細(xì)胞質(zhì)通信網(wǎng)絡(luò)的線(xiàn)索（Kural-Mangit and Din?er，2021）。Desmin蛋白作為基于酵母雙雜交篩選的基質(zhì)相互作用分子1（STIM1）結(jié)合伙伴，通過(guò)免疫共沉淀和免疫定位證實(shí)，STIM1的CC1-SOAR結(jié)構(gòu)域與Desmin蛋白相互作用能增強(qiáng)STIM1寡聚。Zhang等（2021）通過(guò)對(duì)Desmin缺失小鼠的研究，發(fā)現(xiàn)Desmin蛋白在神經(jīng)肌肉Z線(xiàn)上連接STIM1以調(diào)節(jié)肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+填充效率，即Desmin-STIM1組裝形成了細(xì)胞骨架—肌質(zhì)網(wǎng)連接，對(duì)骨骼肌中的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)起重要作用。Desmin作為神經(jīng)肌肉接頭處的重要蛋白，還能將肌原纖維的被動(dòng)成分連接到肌肉細(xì)胞側(cè)表面（Tidball，1992）。

目前，原核表達(dá)載體構(gòu)建使用較多的是pGEX-4T-1和pET-32a（+），操作簡(jiǎn)單且可高效表達(dá)，pGEX-4T-1載體本身攜帶有GST標(biāo)簽，可通過(guò)檢測(cè)特異性標(biāo)簽以確定融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況（趙祥秀等，2020）。融合蛋白在表達(dá)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量較少或不表達(dá)的情況，最適誘導(dǎo)條件難以把握，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量達(dá)不到免疫量要求（李玉霄等，2020）。本研究的鼠源Desmin基因原核誘導(dǎo)表達(dá)選用pGEX-4T-1載體，構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Desmin-Flag在28和30 ℃下以0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h后，通過(guò)特異性的GST標(biāo)簽可成功檢測(cè)到在菌體沉淀和上清液中均有Desmin蛋白表達(dá)，但在28 ℃誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生的可溶性蛋白較30 ℃誘導(dǎo)的多，說(shuō)明在低溫誘導(dǎo)條件下可產(chǎn)生更多的可溶性Desmin蛋白，因此后期采用28 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。切膠純化法是經(jīng)KCl染色后針對(duì)目的蛋白條帶位置處切膠純化，原核表達(dá)純化的融合蛋白再進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western blotting檢測(cè)（黃茂發(fā)等，2021），純化后的融合蛋白可作為釣餌通過(guò)體外Pull-down鑒定與Desmin直接結(jié)合的互作蛋白。此外，本研究構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Desmin-Flag并成功表達(dá)，共聚焦定位結(jié)果顯示Desmin蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)有部分定位在細(xì)胞核周?chē)?。真核表達(dá)載體的構(gòu)建進(jìn)一步驗(yàn)證Desmin蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)及細(xì)胞內(nèi)分布定位情況，為了解物理互作的蛋白是否具有功能性關(guān)聯(lián)提供了理論依據(jù)。

鼠源Desmin蛋白為親水性蛋白，其理化性質(zhì)不穩(wěn)定，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（由317個(gè)氨基酸殘基組成）占67.59%、無(wú)規(guī)則卷曲（由105個(gè)氨基酸殘基組成）占22.39%、β-轉(zhuǎn)角（由9個(gè)氨基酸殘基組成）占1.92%、延伸鏈（由38個(gè)氨基酸殘基組成）占8.10%，α-螺旋是最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。Desmin作為一種重要的III型中間絲蛋白，在神經(jīng)肌肉組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及與相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用方面發(fā)揮重要作用，為后續(xù)研究其生物學(xué)特性打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

鼠源Desmin蛋白在原核表達(dá)體系中主要以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)，在真核細(xì)胞中表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈骨架結(jié)構(gòu)分布，其理化性質(zhì)不穩(wěn)定，屬親水性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。Desmin作為一種重要的III型中間絲蛋白，在神經(jīng)肌肉組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及與相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用方面發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）