張明 楊帥 曹艷飛 盧曉文 焦鈺

摘要：【目的】分析組蛋白乙?；揎椣嚓P(guān)基因的分子進(jìn)化及其在馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）植核后的表達(dá)變化，明確組蛋白乙?；揎椩谥埠嗣庖咧械淖饔茫瑸楹侠砜刂浦埠嗣庖叻磻?yīng)提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)生物信息學(xué)分析方法對(duì)馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣、斑馬魚及人類等9個(gè)物種的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）和組蛋白去乙?；福℉DAC）進(jìn)行全基因組鑒定，并分析其分子進(jìn)化歷程，同時(shí)通過(guò)已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析馬氏珠母貝HAT和HDAC基因在植核后的表達(dá)變化，采用組蛋白H3/H4總乙?；糠治鲈噭┖袡z測(cè)馬氏珠母貝植核后血細(xì)胞組蛋白H3/H4乙?；??！窘Y(jié)果】HAT和HDAC基因家族在9個(gè)物種基因組中的數(shù)目差異不明顯，其原始共同祖先（MRCA）共包含8個(gè)HAT基因家族的9個(gè)基因及19個(gè)HDAC基因家族的22個(gè)基因。馬氏珠母貝基因組含有2個(gè)HAT家族（GNAT和MYST）的8個(gè)基因（2個(gè)GNAT類基因，6個(gè)MYST類基因）；HAT基因家族成員中含有18個(gè)保守氨基酸序列，且所有MYST類基因均含有MOZ_SAS結(jié)構(gòu)域，GNAT類基因則含有Hat1_N或Acetyltransf_1結(jié)構(gòu)域，即具有較高的保守性。馬氏珠母貝基因組含有13個(gè)HDAC家族的18個(gè)基因，包含3個(gè)I類、3個(gè)II類、10個(gè)Ⅲ類和2個(gè)IV類。其中，HDAC Ⅲ類基因家族包含3個(gè)保守氨基酸序列，HDAC I/II/IV類基因家族包含21個(gè)保守氨基酸序列，但分布位置和序列組成差異明顯，說(shuō)明該家族成員結(jié)構(gòu)具有多樣性。馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類中HDAC Ⅲ類基因均包含1～2個(gè)SIR2結(jié)構(gòu)域，HDAC I/II/IV類基因包含1個(gè)或多個(gè)Hist-deacety1結(jié)構(gòu)域。在馬氏珠母貝血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中可檢測(cè)到所有的HDAC和HAT基因，HDAC基因在植核后的表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化，而多數(shù)HAT基因表達(dá)未發(fā)生變化；植核后6、12和24 h馬氏珠母貝血細(xì)胞組蛋白H3和H4的乙?；揎椝斤@著上升（P<0.05），至植核后48 h組蛋白H3仍保持較高乙?；剑M蛋白H4乙?；交謴?fù)正常?！窘Y(jié)論】組蛋白乙?；揎椣嚓P(guān)基因的基因組拷貝數(shù)、結(jié)構(gòu)域組成及保守氨基酸序列等在不同物種間具有保守性，且組蛋白乙酰化修飾參與調(diào)控馬氏珠母貝的植核免疫。

關(guān)鍵詞：馬氏珠母貝；組蛋白；乙?；揎?；植核免疫

中圖分類號(hào)：S968.316.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0575-11

Abstract：【Objective】To analyze molecular evolution of histone acetylation modification related genes and expression changes of the genes in Pinctada fucata martensii after nucleus transplantation， and to make clear the function of histone acetylation modification on nucleus transplantation immunity， so as to provide theoretical and technical guidance for appropriate control of immune response to nucleus transplantation. 【Method】Whole genome identification of histone ace-tylase （HAT） and histone deacetylase （HDAC） related genes in 9 species including P. fucata martensii， Crassostrea gigas， Danio rerio and Homo sapiens was operated through bioinformatics methods， and molecular evolution of the genes was analyzed. Based on transcriptomes data already obtained， expression change of HAT and HDAC genes in P. fucata martensii after nucleus transplantation， and hemocyte histone H3/H4 acetylation level was determined using histone H3/H4 total acetylation quantitative analysis kit. 【Result】The numbers of HAT and HDAC gene families in the genomes of 9 species varied inobviously， and the most recent common ancestor （MRCA） included 9 genes from 8 HAT gene families and 22 genes from 19 HDAC gene families. P. fucata martensii genome contained 8 genes （2 GNAT-like genes and 6 MYST-like genes） from 2 HAT families （GNAT and MYST）； HAT gene family members contained 18 conserved amino acid sequences， and all existing MYST-like genes contained MOZ_SAS domain and GNAT-like genes contained Hat1_N or Acetyltransf_1 domains， indicating that the sequences were highly conserved. P. fucata martensii genome contained 18 genes from 13 HDAC gene families， including 3 genes in Class I， 3 in Class II， 10 in Class III and 2 in Class IV. HDAC Class III gene family contained 3 conserved amino acid sequences， and HDAC Class I/II/ IV gene families contained 21 conserved amino acid sequences， but they were distributed in different positions and had different sequence composition， indicating that the structure of the family members was diverse. HDAC Class III genes in P. fucata martensii， C. agigas， and H. sapiens contained from 1 to 2 SIR2 domains， and HDAC Class I/II/IV genes contained one or more Hist-deacety1 domains. Hemocytes transcriptome of P. fucata martensii contained all of the detected HDAC and HAT genes， and expression of HDAC genes changed dynamically after nucleus transplantation， but most expression of HAT genes did not change； acetylation modification level of histone H3 and histone H4 increased significantly at 6， 12 and 24 h after nucleus transplantation in P. fucata martensii （P<0.05）， and at 48 h， the acetylation level of histone H3 was still high， while the acetylation level of histone H4 returned to normal. 【Conclusion】Genome copy number， domain composition and conserved amino acid sequence of histone acetylation related genes are conserved in different species， and histone acetylation modification is involved in regulation of immune response to nucleus transplantation in P. fucata martensii.

Key words： Pinctada fucata martensii； histone； acetylation modification； nucleus transplantation immunity

Foundation items： Guangdong Natural Science Foundation （2021A1515011199）； Guangdong Education Department Characteristic Innovation Project of Higher Learning Institutes （2021KTSCX041）

0 引言

【研究意義】乙?；揎棧ˋcetylation）是指將乙酰輔酶A的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白氨基酸殘基上，此修飾過(guò)程在組蛋白及其他蛋白上均可發(fā)生。組蛋白乙酰化修飾是重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone acetylase，HAT）和組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase，HDAC）共同調(diào)控（陳宇等，2019；馬田等，2022）。組蛋白修飾參與調(diào)控蛋白活性及基因轉(zhuǎn)錄，在免疫調(diào)節(jié)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。珍珠貝生產(chǎn)過(guò)程中通常伴隨著貝體免疫排斥反應(yīng)，因此，開展乙酰化修飾研究對(duì)了解功能基因的表達(dá)及調(diào)控具有重要意義，可為進(jìn)一步揭示珍珠貝植核免疫的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】HAT和HDAC可作用于組蛋白N端的賴氨酸殘基，通過(guò)改變組蛋白乙酰化修飾狀態(tài)來(lái)激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄（Kouzarides，2000；Lusser et al.，2001；姜綺霞和袁洪，2007）。根據(jù)序列同源性，HAT主要分為GNAT和MYST兩大類（Berger，1999；Dyda et al.，2000）。其中，GNAT主要包括PCAF、Gcn5、Elp3、Hpa2和Hat1等，MYST主要包括Sas3、Morf、Tip60、MOZ、Hbo1和Sas2等。HDAC主要分為四大類（Smith et al.，2008；Haberland et al.，2009）：I類包括HDAC1～HDAC3和 HDAC8，與酵母RPD3同源；II類包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9，與酵母HDA1同源；III類包括Sirtuins1～Sirtuins7，與沉默調(diào)節(jié)蛋白（Sirtuins）同源，為NAD+依賴型Sir2超蛋白家族，是非典型的HDAC家族；IV類包括HDAC11，是最短的HDAC。其中，I、II、IV類統(tǒng)稱為Rpd3/Had1-like HDAC家族，在細(xì)胞免疫耐受、免疫調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用（賴星等，2011）。HAT主要對(duì)組蛋白H2A、H2B（Buerki et al.，2008；Schug et al.，2010）、H3（Saha et al.，2007）和H4（Adcock et al.，2006）末端的賴氨酸殘基進(jìn)行乙?；揎?，從而選擇性激活基因轉(zhuǎn)錄（呂琳等，2008）； HDAC的作用恰好相反，促使組蛋白發(fā)生去乙?；?，而抑制基因轉(zhuǎn)錄（Yang and Seto，2007；Hyndman，2020）。HAT與HDAC間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持生物體的生命活動(dòng)十分重要，若打破該平衡將會(huì)影響生物體代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)，從而引發(fā)疾病（Saha and Pahan，2006；Wang et al.，2009）。已有研究證實(shí)，賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶2B的異常表達(dá)致使IL-10表達(dá)下降而引發(fā)腸炎（Bai et al.，2016）。此外，乙?；揎椏烧{(diào)控炎癥因子NF-кB和MKP-1，通過(guò)改變炎癥因子NF-кB與DNA的結(jié)合能力及轉(zhuǎn)錄因子活力，而調(diào)控炎癥反應(yīng)（Pan et al.，2010），即乙?；揎椷€與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國(guó)生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類，其人工養(yǎng)殖過(guò)程中需將供體貝的細(xì)胞小片和珠核植入受體貝中（王梅芳和余祥勇，2010），植入后圍繞珠核形成珍珠囊并分泌珍珠質(zhì)，進(jìn)而形成珍珠（焦鈺等，2010；符韶等，2013）。但在珍珠的生產(chǎn)過(guò)程中，由于植核手術(shù)導(dǎo)致的創(chuàng)傷及植核過(guò)程中的病原體感染等，通常促使植核貝出現(xiàn)免疫排斥現(xiàn)象，導(dǎo)致珍珠產(chǎn)量下降（焦鈺等，2010；Kishore and Southgate，2015）。因此，如何減少植核后供體與受體間的免疫排斥反應(yīng)是馬氏珠母貝養(yǎng)殖過(guò)程的關(guān)鍵?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管目前已有較多研究報(bào)道了珍珠貝植核后的免疫反應(yīng)機(jī)制，且獲得大量參與植核免疫的相關(guān)基因和信號(hào)通路，但這些基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于組蛋白乙酰化修飾在基因表達(dá)和免疫反應(yīng)中的調(diào)控作用，以馬氏珠母貝為研究對(duì)象，通過(guò)分析組蛋白乙?；揎椣嚓P(guān)基因的分子進(jìn)化及其在植核后的表達(dá)變化，探究組蛋白乙?；揎椩谥埠嗣庖咧械淖饔茫云跒楹侠砜刂浦埠嗣庖叻磻?yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 HDAC和HAT篩選

從NCBI下載馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）、帽貝（Lottia gigantea）、章魚（Octopus bima-culoides）、海兔（Aplysia californica）、海蠕蟲（Capitella teleta）、水蛭（Helobdella robusta）、斑馬魚（Danio rerio）及人類（Homo sapiens）的蛋白序列。使用KEGG和Nr進(jìn)行注釋分析，以BLAST進(jìn)行校正（E value≤1e-5），并采用InterProScan和SMART預(yù)測(cè)其功能結(jié)構(gòu)域。根據(jù)上述預(yù)測(cè)結(jié)果，得到9個(gè)物種的全部HAT和HDAC基因。具有2種酶的特有功能結(jié)構(gòu)域，且與HAT和HDAC同源（E value≤1e-5）即被鑒定為HDAC或HAT。

1. 2 HDAC和HAT基因家族進(jìn)化分析及Motif預(yù)測(cè)

利用馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣、帽貝、章魚、海兔、海蠕蟲、水蛭、斑馬魚和人類9個(gè)物種的所有基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，以模式生物人類和斑馬魚的化石時(shí)間為參照，參考本課題組前期使用CAFE軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果（de Bie et al.，2006；鄭哲，2017），篩選出不同分化節(jié)點(diǎn)9個(gè)物種各HAT和HDAC基因家族及其基因數(shù)目，分析各物種中HDAC和HAT的擴(kuò)張或收縮情況。此外，利用MEGA 6.0中的最大似然法構(gòu)建馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣、人類的HDAC和HAT系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，通過(guò)BioEdit進(jìn)行多序列比對(duì)，并以MEME （http：//meme-suite.org/tools/meme）對(duì)組蛋白HDAC和HAT進(jìn)行Motif預(yù)測(cè)。

1. 3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

馬氏珠母貝植核后不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)自本課題組前期研究成果（Jiao et al.，2019）。血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的同種植核是指供體貝和受體貝均為馬氏珠母貝，而異種植核的供體貝為大珠母貝（Pinctada maxima）、受體貝為馬氏珠母貝。

1. 4 組蛋白乙?；綑z測(cè)

1. 4. 1 試驗(yàn)材料 選取的馬氏珠母貝采自我國(guó)湛江大井海區(qū)，對(duì)其進(jìn)行植核手術(shù)，植核后將馬氏珠母貝置于裝有海水的水箱中養(yǎng)殖，對(duì)照組為正常養(yǎng)殖的馬氏珠母貝。分別在植核后6、12、24和48 h，使用2 mL注射器從每組5只馬氏珠母貝中提取血淋巴，4 ℃下3000 r/min離心6 min，收集血細(xì)胞，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4. 2 總組蛋白提取 采用總組蛋白提取試劑盒（EpiQuikTM Total Histone Extraction Kit）提取組蛋白，以1×Pre-Lysis Buffer將血細(xì)胞樣品配制成×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，冰上輕輕搖晃10 min后，4 ℃下10000 r/min離心1 min，棄上清液。收集的沉淀用3倍體積的Lysis Buffer進(jìn)行懸浮，冰上孵育30 min，4 ℃下12000 r/min離心5 min，使用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中。將Balance Buffer和DTT Solution按1∶499的比例配制成Balance DTT Buffer，然后按1∶3的比例添加至上清液中即獲得組蛋白， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4. 3 組蛋白濃度檢測(cè) 使用1×PBS將小牛胚胎血清（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成合適的濃度梯度，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定OD值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測(cè)定的樣品OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)馬氏珠母貝血細(xì)胞在不同試劑處理下的組蛋白濃度。

1. 4. 4 組蛋白總H3和H4乙酰化水平檢測(cè) 使用組蛋白H3和H4總乙?；糠治鲈噭┖校‥piQuikTM Total Histone H3/H4 Acetylation Detection Fast Kit）進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)空白組、標(biāo)準(zhǔn)品組和樣品組所需孔數(shù)，每孔添加50 μL抗體緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)組酶標(biāo)孔添加不同濃度的組蛋白H3/H4標(biāo)準(zhǔn)品1 μL，樣品組酶標(biāo)孔添加不同時(shí)間點(diǎn)的馬氏珠母貝血細(xì)胞組蛋白200 ng，空白組不添加任何試劑。室溫孵育1～2 h后，每孔添加150 μL稀釋的洗滌液，反復(fù)洗滌3次，再每孔添加50 μL稀釋的Detection Antibody，搖床混勻1 h?；靹蚪Y(jié)束再反復(fù)洗滌6次，每孔添加100 μL Color Developer，避光孵育2～10 min后每孔添加50 μL終止液，放入酶標(biāo)儀中讀取吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算組蛋白H3/H4乙?；健?/p>

2 結(jié)果與分析

2. 1 HAT和HDAC篩選結(jié)果

對(duì)馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣、帽貝、章魚、海兔、海蠕蟲、水蛭、斑馬魚和人類9個(gè)物種的HAT和HDAC全基因組進(jìn)行篩選，結(jié)果（表1）表明，人類和馬氏珠母貝中均含有8個(gè)HAT和18個(gè)HDAC，長(zhǎng)牡蠣中含有6個(gè)HAT和20個(gè)HDAC。HAT在馬氏珠母貝中含有2個(gè)GNAT類，分別是10009612（KAT1）和10020342（KAT2）；6個(gè)MYST類，分別是10020994（KAT5）、10019553（KAT8）、10028977（KAT8）、10028973（KAT8）、10022287（KAT6B）和10009751（KAT7）。HDAC在馬氏珠母貝中有3個(gè)I類HDAC（10023132、10032700和10021146）、3個(gè)II類HDAC（10001025、10006221和10009193）、10個(gè)III類HDAC（10032193、10009359、10032192、10014771、10027317、10031932、10020349、10028169、10005793和10009979）及2個(gè)IV類HDAC（10020335和10006290）。

2. 2 HAT和HDAC基因家族進(jìn)化分析結(jié)果

追溯組蛋白HAT和HDAC基因家族的進(jìn)化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)原始共同祖先（MRCA）共包含8個(gè)HAT基因家族的9個(gè)基因及19個(gè)HDAC基因家族的22個(gè)基因（圖1）。在物種進(jìn)化過(guò)程中，軟體動(dòng)物的共同祖先（節(jié)點(diǎn)B）HAT基因家族數(shù)目減少至6個(gè)，長(zhǎng)牡蠣和馬氏珠母貝的共同祖先基因數(shù)目未發(fā)生變化，但長(zhǎng)牡蠣的基因數(shù)目減少1個(gè)，馬氏珠母貝則增加1個(gè)。人類HAT基因家族還保留著與原始祖先相同的數(shù)目，僅基因數(shù)目減少1個(gè)。此外，雙殼軟體動(dòng)物的共同祖先（節(jié)點(diǎn)E）HDAC基因家族數(shù)目有16個(gè)基因家族的19個(gè)基因得到保留，長(zhǎng)牡蠣的基因家族數(shù)目減少1個(gè)、基因數(shù)目增加2個(gè)，馬氏珠母貝的基因家族數(shù)目減少3個(gè)、基因數(shù)目均減少1個(gè)。

構(gòu)建馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣、人類的HAT和HDAC家族基因進(jìn)化樹，以探究三者間的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示，HAT基因的GNAT家族有7個(gè)基因，MYST家族有15個(gè)基因，兩大家族的基因各自聚為一支，相同家族基因也聚在同一分支，且每支均包含馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類3個(gè)物種（圖2）。Motif預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，HAT基因家族含有18條序列（表2），其中，MYST家族基因中均包含保守的序列1、序列2和序列3，GNAT家族基因中均包含序列5、序列8和序列14，其組成與進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)基本一致。HDAC家族基因進(jìn)化樹與HAT基因進(jìn)化樹的結(jié)構(gòu)相似，馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類中HDAC基因多數(shù)相同家族基因呈聚集狀態(tài)，且每個(gè)分支均包含馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類3個(gè)物種（圖3）。

對(duì)馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類的HDAC I、II和IV類基因進(jìn)行Motif預(yù)測(cè)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)21條保守氨基酸序列（圖4），根據(jù)其保守序列分布位置及組成結(jié)構(gòu)的不同，可確認(rèn)HDAC I、II和IV類基因家族成員結(jié)構(gòu)上存在多樣性。HDAC Ⅲ類基因家族可分為兩大類，具有7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（圖5），在馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類基因中均包含有序列2、序列4和序列5；序列7僅在長(zhǎng)牡蠣和馬氏珠母貝基因中存在，在人類基因中未發(fā)現(xiàn)，故推測(cè)序列2、序列4和序列5在馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣及人類進(jìn)化過(guò)程中必不可少。

對(duì)馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣、人類的HAT和HDAC基因家族編碼蛋白序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行SMART預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類HAT基因MYST家族成員均具有MOZ_SAS結(jié)構(gòu)域，且部分基因能與其他結(jié)構(gòu)域發(fā)生整合，如KAT6基因具有PHD和H15結(jié)構(gòu)域，KAT7基因具有ZnF_C2H2結(jié)構(gòu)域。此外，MYST家族含有AT_hook結(jié)構(gòu)域，在動(dòng)物中AT_hook結(jié)構(gòu)域通過(guò)與染色體結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。GNAT家族成員均具有Hat1_N或Acetyltransf_1結(jié)構(gòu)域，且KAT2B、KAT2基因中具有BROMO和PCAF_N結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)化過(guò)程中，結(jié)構(gòu)域的組成在不同物種間尚未發(fā)生改變（表3）。馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類的HDAC II類基因具有2個(gè)及2個(gè)以上Hist-deacety1結(jié)構(gòu)域，HDAC I類和IV類基因具有1個(gè)Hist-deacety1結(jié)構(gòu)域，HDAC III類基因具有1～2個(gè)SIR2結(jié)構(gòu)域（表4）。

2. 3 HAT和HDAC基因在植核后的表達(dá)變化情況

利用本課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析同種植核和異種植核后不同時(shí)間點(diǎn)HAT和HDAC基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明，同種植核后HAT基因表達(dá)變化較?。ㄗ兓稊?shù)小于2），而HDAC6/10、HDAC8基因分別在植核后6 h和3 d呈上調(diào)表達(dá)，有2個(gè)Sir2基因則在植核后3和12 d呈上調(diào)表達(dá)（圖6-A）。異種植核后，KAT8基因在植核后24 h呈下調(diào)表達(dá)，KAT1基因在植核后6 h的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，但在植核6 d后又顯著上調(diào)（P<0.05，下同），其他基因無(wú)顯著變化（P>0.05）；HDAC1/2基因在植核后12 h呈上調(diào)表達(dá)，有2個(gè)Sir2基因及1個(gè)HDAC3基因和1個(gè)HDAC8基因在植核后3 d呈上調(diào)表達(dá)，有2個(gè)Sir2基因分別在植核后6和12 h呈上調(diào)表達(dá)，有2個(gè)HDAC4/5基因則在植核后12 h呈下調(diào)表達(dá)（圖6-B）。

2. 4 植核后組蛋白乙酰化水平檢測(cè)結(jié)果

對(duì)植核處理前及植核后（6、12、24和48 h）馬氏珠母貝組蛋白H3和H4的乙?；竭M(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖7）表明，在植核后6、12和24 h馬氏珠母貝組蛋白H3和H4顯著上調(diào)，組蛋白H3在植核后48 h仍保持較高乙?；剑M蛋白H4乙?；交謴?fù)正常。

3 討論

組蛋白的乙?；腿ヒ阴；揎椃謩e由HAT和HDAC催化完成，且參與調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（Marampon et al.，2019），在細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)及增殖等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但至今有關(guān)軟體動(dòng)物組蛋白乙?；腿ヒ阴；揎椀难芯肯鄬?duì)較少。根據(jù)序列同源性，HAT主要分為GNAT和MYST兩大類，馬氏珠母貝中包含有2個(gè)GNAT家族的2個(gè)基因（KAT1和KAT2）及4個(gè)MYST家族的6個(gè)基因［KAT8（包含3個(gè)基因）、KAT6B、KAT5和KAT7］。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，在馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類中相同類別的基因呈聚集狀態(tài)，說(shuō)明在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物分化后HAT基因才開始分類。序列分析結(jié)果表明，HAT家族含有18個(gè)保守氨基酸序列，其中，MYST家族基因中均包含序列1、序列2和序列3，而GNAT家族基因中均包含序列5、序列8和序列14，說(shuō)明不同基因家族在進(jìn)化過(guò)程中形成不同的保守氨基酸序列，同一類基因家族具有類似的保守氨基酸序列，即具有較高的保守性（Heintzman et al.，2009）。此外，MYST家族成員均含有MOZ_SAS結(jié)構(gòu)域，GNAT家族成員均含有Hat1_N或Acetyltransf_1結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步說(shuō)明在家族基因功能發(fā)揮方面這些結(jié)構(gòu)域扮演著重要角色。

HDAC還在生物免疫反應(yīng)及基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。至今已發(fā)現(xiàn)有18種HDAC，根據(jù)序列同源性可分為四大類（I～I(xiàn)V）（Smith et al.，2008；Haberland et al.，2009；曹端方和楊娜，2015）。在馬氏珠母貝基因組中包含3個(gè)I類、3個(gè)II類、10個(gè)III類及2個(gè)IV類。I、II、IV類HDAC又統(tǒng)稱為Rpd3/Had1-like去乙?；讣易澹╠e Ruijter et al.，2003），含有的催化核心結(jié)構(gòu)域同源性較高，但其分布具有多樣性（鐘理等，2014）。Motif序列分析結(jié)果顯示，Rpd3/Had1-like去乙?；讣易宕嬖诿黠@的序列差異，雖然含有21個(gè)保守氨基酸序列，但在不同基因家族中的分布位置及序列組成差異明顯，故推測(cè)該家族成員結(jié)構(gòu)的多樣性與乙?；揎椕芮邢嚓P(guān)。由構(gòu)建的進(jìn)化樹可看出，HDAC II類基因大多先在物種內(nèi)呈聚集狀態(tài)，然后在馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類間聚集；HDAC I和IV類基因則呈物種間聚集；馬氏珠母貝、長(zhǎng)牡蠣和人類中相同家族的HDAC基因多聚集在一起，說(shuō)明不同類型的HDAC基因包含有脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的原始共同祖先。少數(shù)HDAC基因與其他基因差異較明顯，單獨(dú)聚集為一支，可能是這些基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了較大變異。HDAC III基因類家族SIR結(jié)構(gòu)域序列分析結(jié)果顯示含有3個(gè)保守氨基酸序列，其中所有Sir2超家族結(jié)構(gòu)域均含有序列1和序列2，但序列3僅單獨(dú)存在于進(jìn)化樹的一支，與林瑩等（2017）的研究結(jié)果相似。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，Rpd3/Had1-like去乙?；讣易灏?個(gè)或2個(gè)以上的Hist-deacety1結(jié)構(gòu)域，HDAC III類基因則包含1～2個(gè)SIR2結(jié)構(gòu)域，與Gregoretti等（2004）的研究結(jié)果一致，說(shuō)明HDAC家族基因在功能上具有保守性。

同種植核和異種植核后馬氏珠母貝血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，在血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中可檢測(cè)到所有的HDAC和HAT基因，且表達(dá)水平均較高，植核后部分HDAC基因及2個(gè)HAT基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，說(shuō)明HDAC和HAT參與調(diào)控馬氏珠母貝的植核免疫反應(yīng)。此外，馬氏珠母貝植核后6、12和24 h的組蛋白H3和H4乙?；揎棻磉_(dá)水平顯著上升，說(shuō)明組蛋白乙?；揎棤顟B(tài)在植核后發(fā)生改變，進(jìn)一步證實(shí)組蛋白乙?；瘏⑴c調(diào)控馬氏珠母貝的植核免疫。

4 結(jié)論

組蛋白乙酰化修飾相關(guān)基因的基因組拷貝數(shù)、結(jié)構(gòu)域組成及保守氨基酸序列等在不同物種間具有保守性，且組蛋白乙?；揎梾⑴c調(diào)控馬氏珠母貝的植核免疫。

參考文獻(xiàn)：

曹端方，楊娜. 2015. 組蛋白去乙?；傅慕Y(jié)構(gòu)及應(yīng)用［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，42（11）：978-993. ［Cao D F，Yang N. 2015. Structure and catalytic mechanisms of histone deacetylases［J］. Progress in Biochemistry and Biophysics，42（11）：978-993.］ doi：10.16476/j.pibb.2015.0260.

陳宇，萬(wàn)群，金露琪，閆春蘭，丁世萍. 2019. 蛋白質(zhì)乙?；揎椩诩?xì)胞自噬中的作用進(jìn)展［J］. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，46（4）：379-385. ［Chen Y，Wan Q，Jin L Q，Yan C L，Ding S P. 2019. Progress about the role of protein acetylation on autophagy［J］. Progress in Biochemistry and Biophysics，46（4）：379-385.］ doi：10.16476/j.pibb. 2018.0291.

符韶，黃邦雙，鄧岳文，梁飛龍. 2013. 馬氏珠母貝育珠效果影響因素分析［J］. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，33（1）：28-32. ［Fu S，Huang B S，Deng Y W，Liang F L. 2013. The analysis on factors affecting pearl production of pearl oyster Pinctada martensii［J］. Journal of Guangdong Ocean University，33（1）：28-32.］ doi：10.3969/j.issn.1673-9159. 2013.01.005.

姜綺霞，袁洪. 2007. 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶及脫乙?；傅淖饔眉罢{(diào)節(jié)機(jī)制［J］. 生命的化學(xué)，27（3）：218-220. ［Jiang Q X，Yuan H. 2007. The function and regulatory mechanism of histone acetyltransferases and deacetylases［J］. Chemistry of Life，27（3）：218-220.］ doi：10.3969/j.issn. 1000-1336.2007.03.010.

焦鈺，師尚麗，杜曉東，逯云召，王慶恒. 2010. 馬氏珠母貝珍珠囊發(fā)育的組織和組織化學(xué)研究［J］. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，30（4）：7-11. ［Jiao Y，Shi S L，Du X D，Lu Y Z，Wang Q H. 2010. Histology and histochemistry on the pearl sac formation of pearl oyster Pinctada martensii［J］. Journal of Guangdong Ocean University，30（4）：7-11.］ doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2010.04.002.

賴星，連崢嶸，陳勇，李金政，廖汪洋，張玉君，龔建平，劉作金. 2011. 組蛋白去乙?；?1在誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受中的作用［J］. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，33（4）：342-344. ［Lai X，Lian Z R，Chen Y，Li J Z，Liao W Y，Zhang Y J，Gong J P，Liu Z J. 2011. Role of HDAC11 in induction of immune tolerance in rats after liver transplantation［J］. Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae，33（4）：342-344.］ doi：10.16016/j.1000-5404.2011.04.012.

林瑩，韓玉輝，熊思嘉，李澤斌，張欣，顧婷婷. 2017. 森林草莓組蛋白去乙酰化酶基因的鑒定和分析［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，40（2）：225-233. ［Lin Y，Han Y H，Xiong S J，Li Z B，Zhang X，Gu T T. 2017. Identification and analysis of histone deacetylase in Fragaria vesca［J］. Journal of Nanjing Agricultural University，40（2）：225-233.］ doi：10.7685/jnau.201607018.

呂琳，吳少瑜，饒進(jìn)軍. 2008. 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙酰化酶的研究［J］. 現(xiàn)代醫(yī)院，8（4）：1-6. ［Lü L，Wu S Y，Rao J J. 2008. The study on histone acetyl transferase and deacetylase［J］. Modern Hospitals，8（4）：1-6.］ doi：10. 3969/j.issn.1671-332X.2008.04.001.

馬田，王玉婧，程爽，張小華，劉向勇. 2022. 乙酸脅迫條件下釀酒酵母全基因組啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H4 K16乙?；揎椃治觯跩］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，51（1）：71-78. ［Ma T，Wang Y J，Cheng S，Zhang X H，Liu X Y. 2022. Analysis of histone H4 K16 acetylation in genome?wide promoter region in Saccharomyces cerevisiae under acetic acid stress［J］. Journal of Henan Agricultural Sciences，51（1）：71-78.］ doi：10.15933/j.cnki.1004?3268.2022.01.009.

王梅芳，余祥勇. 2010. 育珠貝細(xì)胞小片及處理技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，30（4）：86-91. ［Wang M F，Yu X Y. 2010. Research progress on cell slices and treatment technology of pearl oyster［J］. Journal of Guangdong Ocean University，30（4）：86-91.］ doi：10.3969/j.issn.1673-9159.2010.04.018.

鄭哲. 2017. 基于多組學(xué)分析的馬氏珠母貝礦化相關(guān)基因研究［D］. 湛江：廣東海洋大學(xué). ［Zheng Z. 2017. The studies of biomineralization related genes based on multi-omic analyses in Pinctada fucata martensii［D］. Zhanjiang：Guangdong Ocean University.］

鐘理，楊春燕，吳佳海. 2014. 組蛋白去乙?；福℉DACs）及其調(diào)控的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，30（21）：1-8. ［Zhong L，Yang C Y，Wu J H. 2014. The progress of histone deacetylases （HDACs） and its regulation［J］. Chiese Agricultural Science Bulletion，30（21）：1-8.］

Adcock I M，F(xiàn)ord P，Ito K，Barnes P J. 2006. Epigenetics and airways disease［J］. Respiratory Research，7（1）：21. doi：10.1186/1465-9921-7-21.

Bai A H C，Wu W K K，Xu L L，Wong S H，Go M Y，Chan A W H，Harbord M，Zhang S H，Chen M H，Wu J C Y，Chan M W Y，Chan M T V，Chan F K L，Sung J J Y，Yu J，Cheng A S L，Ng S C. 2016. Dysregulated lysine ace-tyltransferase 2B promotes inflammatory bowel disease pathogenesis through transcriptional repression of interleukin-10［J］. Journal of Crohn?s and Colitis，10（6）：726-734. doi：10.1093/ecco-jcc/jjw020.

Berger S L. 1999. Gene activation by histone and factor ace-tyltransferases［J］. Current Opinion in Cell Biology，11（3）：336-341. doi：10.1016/S0955-0674（99）80046-5.

Buerki C，Rothgiesser K M，Valovka T，Owen H R，Rehrauer H，F(xiàn)ey M，Lane W S，Hottiger M O. 2008. Functional re-levance of novel p300-mediated lysine 314 and 315 acetylation of RelA/p65［J］. Nucleic Acids Research，36（5）：1665-1680. doi：10.1093/nar/gkn003.

de Bie T，Cristianini N，Demuth J P，Hahn M W. 2006. CAFE：A computational tool for the study of gene family evolution［J］. Bioinformatics，22（10）：1269-1271. doi：10. 1093/bioinformatics/btl097.

de Ruijter A J，van Gennip A H，Caron H N，Kemp S，van Kuilenburg A B. 2003. Histone deacetylases （HDACs）：Characterization of the classical HDAC family［J］. Bioche-mical Journal，370（3）：737-749. doi：10.1042/BJ20021321.

Dyda F，Klein D C，Hickman A B. 2000. GCN5-related N-acetyltransferases：A structural overview［J］. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure，29（1）：81-103. doi：10.1146/annurev.biophys.29.1.81.

Gregoretti I V，Lee Y M，Goodson H V. 2004. Molecular evolution of the histone deacetylase family：Functional implications of phylogenetic analysis［J］. Journal of Molecular Biology，338（1）：17-31. doi：10.1016/j.jmb.2004.02.006.

Haberland M，Montgomery R L，Olson E N. 2009. The many roles of histone deacetylases in development and physio-logy：Implications for disease and therapy［J］. Nature Reviews Genetics，10（1）：32-42. doi：10.1038/nrg2485.

Heintzman N D，Hon G C，Hawkins R D，Kheradpour P，Stark A，Harp L F，Ye Z，Lee L K，Stuart R K，Ching C W，Ching K A，Antosiewicz-Bourget J E，Liu H，Zhang X M，Green R D，Lobanenkov V V，Stewart R，Thomson J A，Crawford G E，Kellis M，Ren B. 2009. Histone modi-fications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression［J］. Nature，459（7243）：108-112. doi：10.1038/nature07829.

Hyndman K A. 2020. Histone deacetylases in kidney physio-logy and acute kidney injury［J］. Seminars in Nephrology，40（2）：138-147. doi：10.1016/j.semnephrol.2020.01.005.

Jiao Y，Yang S，Cao Y F，Zheng Z，Deng Y W，Wang Q H，Huang R L，Du X D. 2019. Genome and transcriptome analyses providing insight into the immune response of pearl oysters after allograft and xenograft transplantations［J］. Fish and Shellfish Immunology，90：109-117. doi：10.1016/j.fsi.2019.04.061.

Kishore P，Southgate P C. 2015. Haemocyte persistence after grafting for pearl production in Pinctada margaritifera （Linnaeus，1758）［J］. Fish and Shellfish Immunology，42（2）：530-532. doi：10.1016/j.fsi.2014.11.035.

Kouzarides T. 2000. Acetylation：A regulatory modification to rival phosphorylation？［J］. The EMBO Journal，19（6）：1176-1179. doi：10.1093/emboj/19.6.1176.

Lusser A，K?lle D，Loidl P. 2001. Histone acetylation： lessons from the plant kingdom［J］. Trends in Plant Scien-ce，6（2）：59-65. doi：10.1016/s1360-1385（00）01839-2.

Marampon F，Leoni F，Mancini A，Pietrantoni I，Codenotti S，F(xiàn)erella L，Megiorni F，Porro G，Galbiati E，Pozzi P，Mascagni P，Budillon A，Maggio R，Tombolini V，F(xiàn)anzani A，Gravina G L，F(xiàn)estuccia C. 2019. Correction to：Histone deacetylase inhibitor ITF2357 （givinostat） reverts transformed phenotype and counteracts stemness in in vitro and in vivo models of human glioblastoma［J］. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology，145（9）：2411. doi：10.1007/s00432-019-02980-6.

Pan W W，Li J D，Huang S，Papadimos T J，Pan Z K，Chen L Y. 2010. Synergistic activation of NF-кB by bacterial che-moattractant and TNFα is mediated by p38 MAPK-depen-dent RelA acetylation［J］. Journal of Biological Chemistry，285（45）：34348-34354. doi：10.1074/JBC.M110.109165.

Saha R N，Jana M，Pahan K. 2007. MAPK p38 regulates transcriptional activity of NF-кB in primary human astrocytes via acetylation of p65［J］. The Journal of Immunology，179（10）：7101-7109. doi：10.4049/jimmunol.179.10. 7101.

Saha R N，Pahan K. 2006. HATs and HDACs in neurodege-neration：A tale of disconcerted acetylation homeostasis［J］. Cell Death and Differentiation，13（4）：539-550. doi：10.1038/sj.cdd.4401769.

Schug T T，Xu Q，Gao H M，Peres-da-Silva A，Draper D W，F(xiàn)essler M B，Purushotham A，Li X L. 2010. Myeloid deletion of SIRT1 induces inflammatory signaling in response to environmental stress［J］. Molecular and Cellular Biology，30（19）：4712-4721. doi：10.1128/MCB. 00657-10.

Smith B C，Hallows W C，Denu J M. 2008. Mechanisms and molecular probes of sirtuins［J］. Chemistry and Biology，15（10）：1002-1013. doi：10.1016/j.chembiol.2008.09.009.

Wang Z B，Zang C Z，Cui K R，Schones D E，Barski A，Peng W Q，Zhao K J. 2009. Genome-wide mapping of HATs and HDACs reveals distinct functions in active and inactive genes［J］. Cell，138（5）：1019-1031. doi：10.1016/j.cell.2009.06.049.

Yang X J，Seto E. 2007. HATs and HDACs：From structure，function and regulation to novel strategies for therapy and prevention［J］. Oncogene，26（37）：5310-5318. doi：10.1038/sj.onc.1210599.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）