張占蛟,徐中海,章珊,張雪蓮 （南京金域醫(yī)學(xué)檢驗所,江蘇 南京 210000）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）經(jīng)常與其他惡性腫瘤同時發(fā)生，大多數(shù)病例為腺癌[1]。由于GIST和脂肪肉瘤都是間質(zhì)性起源，所以它們的共存非常罕見。GIST的診斷大多依據(jù)影像學(xué)檢查如計算機斷層掃描和MRI、內(nèi)窺鏡和組織活檢[2]，然而，影像學(xué)檢查結(jié)果大多不具備特異性，而最終確診往往需要組織標本病理學(xué)檢查。

磷酸化組蛋白H3（Phospho-histone H3，PHH3）是細胞質(zhì)核心染色質(zhì)的重要組成之一，其在有絲分裂的早期、中期、后期與末期的核分裂象均呈陽性表達，而在分裂間期及核固縮、核碎裂均不表達。它是研究細胞核有絲分裂特異性較高的抗體之一，近年來被用于研究和腫瘤核分裂相關(guān)的一些項目。然而，筆者在實際工作中發(fā)現(xiàn)，PHH3的陽性細胞計數(shù)要遠高于HE染色下核分裂計數(shù)。分析原因，考慮是PHH3染色存在某些未知的細胞非特異著色，從而造成計數(shù)遠高于實際核分裂數(shù)，而人工在HE下計數(shù)核分裂，僅計數(shù)形態(tài)明確的核分裂[3]，由此造成了計數(shù)差異，那么，PHH3這個抗體對于病理醫(yī)生到底還有沒有幫助呢？本文選取胃腸道間質(zhì)瘤作為實驗對象，進一步明確這一抗體在實驗中的作用。

本文收集了南京金域醫(yī)學(xué)檢驗所2019年1月-2021年12月期間進行病理檢查的胃腸道間質(zhì)瘤患者52例為研究對象，同時在HE下和PHH3標記下進行核分裂計數(shù)，并進行比較。以明確PHH3對于臨床病理醫(yī)生核分裂計數(shù)是否有所幫助，以此增加準確度、減輕工作量、縮短工作時間。與以往計算PHH3陽性細胞數(shù)不同的是，本次研究僅計數(shù)PHH3陽性細胞內(nèi)可明確辨認為核分裂的細胞。以此過濾掉一些非特異著色，增加準確度。此研究為回顧性分析，不涉及患者姓名、年齡等隱私信息，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集南京金域醫(yī)學(xué)檢驗所2019年1月-2021年12月期間進行病理學(xué)檢查的胃腸道間質(zhì)瘤患者52例為研究對象，其中低度危險性42例，中度危險性8例，高度危險性2例，采用隨機的方法進行排列。同一腫瘤組織分別進行HE染色和PHH3免疫組化標記，計算兩種不同染色方法下核分裂數(shù)和觀測時間并進行比較。

1.2 方法 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度4微米。裱貼于防脫片玻片上，PHH3抗體及二抗、DAB顯色劑均采用邁新生物試劑。免疫組化方法采用En Vision兩步法，高壓鍋抗原修復(fù)。免疫組化操作人員為資深病理技術(shù)員，有多年的免疫組化制片經(jīng)驗[4]。所有病例在核分裂計數(shù)時均用了PHH3進行標記，并且每例標本均經(jīng)過3位資深病理醫(yī)生于高倍鏡下分別計數(shù)5mm2視野的核分裂數(shù)，計算其平均值。同時分別記錄HE和PHH3的閱片時間，并計算平均閱片時間[5]。所有數(shù)據(jù)經(jīng)jamovi軟件分析，計算PHH3和HE下核分裂的數(shù)量及平均時間，并對二者進行比較，分析其相關(guān)性。

1.3 結(jié)果判讀 由于目前GIST的核分裂計數(shù)標準為HE下人工計數(shù)，通常僅能辨認明確的有絲核分裂（見圖1），故計數(shù)PHH3標記的核分裂數(shù)時僅計算形態(tài)明確的有絲核分裂（見圖2），而不是計數(shù)所有陽性細胞（見圖3），因為那樣將導(dǎo)致GIST危險度升級，可能給患者帶來過度治療，影響身體健康，同時給患者增加不必要的經(jīng)濟支出。

圖1 HE下核分裂

圖2 PHH3下核分裂

圖3 PHH3下非特異陽性細胞

1.4 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)經(jīng)jamovi軟件分析，計數(shù)5mm2視野的核分裂數(shù)，計算其平均值，同時分別記錄HE和PHH3的閱片時間，并計算平均閱片時間。計算PHH3和HE下核分裂的數(shù)量及平均時間，并對二者進行比較，分析其相關(guān)性。計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，雙側(cè)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHH3和HE下核分裂數(shù)的相關(guān)性分析 假設(shè)HE下核分裂≠PHH3下核分裂，PHH3下核分裂計數(shù)和HE總體一致（P＞0.05），沒有統(tǒng)計學(xué)差異性，PHH3可以用于核分裂計數(shù)。

2.2 PHH3和HE計數(shù)核分裂所用時間的比較分析，PHH3下核分裂計數(shù)所用時間相比HE下所用時間減少了131%。

2.3 經(jīng)過PHH3染色計數(shù)核分裂后重新評估危險度，與HE下危險度前后一致。

3 討論

胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）是獨立起源于胃腸道間質(zhì)干細胞的腫瘤，屬于消化道間葉性腫瘤，發(fā)病率10/100萬-20/100萬，年齡多在40歲以上，中位年齡為50-60歲，男女發(fā)病率相當(dāng)，但有些報道提示男性發(fā)病率略高，兒童少見[6]。GIST的確診最終需病理切片及免疫組化的結(jié)果。其治療方式主要為手術(shù)治療及靶向藥物治療（口服的小分子酪氨酸激酶抑制劑——格列衛(wèi)），其預(yù)后取決于腫瘤的危險度、大小、生長位置、有無轉(zhuǎn)移等。而GIST危險度的判斷，目前標準為計數(shù)5mm2核分裂數(shù)，再結(jié)合腫瘤的大小、有無自發(fā)破裂、壞死等來綜合判定[7]。在更好的計數(shù)方法出現(xiàn)以前，人工在顯微鏡下數(shù)核分裂是主要的方法，其不僅用時較長，且容易視覺疲勞，容易漏數(shù)。

PHH3改良計數(shù)方法的簡便性及省時性不僅可以用于GIST的診斷，還可以用于所有需要觀測腫瘤核分裂的場景中，如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌等涉及到病理分級分期的診斷中，在一些軟組織腫瘤的診斷中，核分裂的多少甚至關(guān)系到良惡性或惡性程度的診斷，其雖然不如其他免疫組化抗體在診斷中起著一些關(guān)鍵性的作用，但仍然給病理醫(yī)生的診斷工作帶來了很大的便利性和直觀性[8]。

磷酸化組蛋白H3（Phospho-histone H3，PHH3）是新近發(fā)現(xiàn)的五個核心組蛋白之一，在真核細胞中與其他組蛋白構(gòu)成染色質(zhì)中的主要蛋白組分[9]。PHH3在有絲分裂的G2期及M期達到最大值，因此被認為是一種特異性的核分裂標志物。磷PHH3抗體被認為是細胞增殖的生物標志物，對有絲分裂中的細胞具有特異性，在不同惡性腫瘤中具有預(yù)后價值，但在胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）中的研究很少[10]。本研究主要對同一腫瘤組織分別進行HE染色和PHH3免疫組化標記，計算兩種不同染色方法下核分裂數(shù)和觀測時間并進行比較，以評估PHH3改良計數(shù)方法在核分裂計數(shù)中的作用。應(yīng)用PHH3的改良計數(shù)方法得到的核分裂數(shù)和HE下核分裂數(shù)基本一致，沒有統(tǒng)計學(xué)差異，同時可以節(jié)約大量時間。因此筆者認為，PHH3這一抗體應(yīng)用于臨床病理工作可以為病理醫(yī)生節(jié)約大量時間，并減少漏數(shù)幾率，提高核分裂計數(shù)精確度，但要注意精確識別核分裂才可納入計數(shù)范圍。

目前PHH3已經(jīng)被證實對確定腫瘤細胞的核分裂象，區(qū)分核分裂象和凋亡小體、核碎片非常有用[11-12]。目前PHH3下計數(shù)核分裂時僅觀察明確的有絲分裂，而不是計算所有的陽性細胞，這給計算機閱片計數(shù)帶來技術(shù)上的困難，對于計算所有陽性細胞的診斷標準仍然需要更多的樣本量及更多的研究來確定[13-14]。PHH3改良計數(shù)方法在臨床病理診斷工作中用于核分裂計數(shù)，其不僅計數(shù)準確、不易漏數(shù)，且用時遠遠短于常規(guī)HE下計數(shù)方法，給臨床病理醫(yī)生節(jié)省了很大的時間成本，可以在病理實驗室推廣應(yīng)用。