馬振源,魏義保,廖太陽,黃正泉,茆軍,王培民

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種好發(fā)于中老年人群以膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、畸形為主要臨床表現(xiàn)的常見的退行性骨關(guān)節(jié)疾病[1]。流行病學(xué)研究顯示,自20世紀(jì)90年代以來,世界上KOA的發(fā)病率隨著人口老齡化持續(xù)增長,其中65%以上的患者均以疼痛為主要癥狀,給生活帶來了極大的不便[2-4]。因此,有效地降低KOA患者的疼痛對提高患者生活質(zhì)量有著重要的意義。

研究表明疼痛致敏在KOA相關(guān)疼痛中起著重要作用[5],且與感覺神經(jīng)支配的神經(jīng)纖維密度密切相關(guān)[6-7]。軸突導(dǎo)向因子Netrin-1是眾多軸突導(dǎo)向因子家族中研究最多的,它參與了調(diào)控機(jī)體的感覺神經(jīng)萌發(fā),是具有導(dǎo)向性的一類導(dǎo)向因子[8]。研究表明Netrin-1與神經(jīng)元表面受體結(jié)直腸癌缺失基因(Deleted in colorectal cancer,DCC)或非協(xié)調(diào)同源-5(Uncoordinated-5,UNC5)的結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對感覺神經(jīng)萌發(fā)的導(dǎo)向性調(diào)控。其中,Netrin-1/DCC對神經(jīng)元軸突具有吸引作用,引導(dǎo)神經(jīng)纖維向受損位置生長,改變神經(jīng)纖維的密度進(jìn)而影響信息傳遞的強(qiáng)度;而Netrin-1/UNC5卻更多地表現(xiàn)出排斥作用。Netrin-1在KOA疼痛領(lǐng)域中具有得巨大研究價(jià)值和潛力[9-12]。

溫經(jīng)活血外治法代表方“易層”貼敷是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院諸方受教授在繼承傳統(tǒng)中醫(yī)貼敷療法基礎(chǔ)上,研制出的一種新的中醫(yī)外治法技術(shù)[13]。前期研究表明溫經(jīng)活血外治法對KOA疼痛具有良好療效,但具體機(jī)制尚未闡明[14-15]。本實(shí)驗(yàn)擬通過探討溫經(jīng)活血外治法對Netrin-1、神經(jīng)萌發(fā)指標(biāo)和疼痛介質(zhì)的作用,發(fā)現(xiàn)潛藏的機(jī)制,為緩解KOA疼痛提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

實(shí)驗(yàn)選用4月齡健康的SPF級SD雄大鼠共30只,體質(zhì)量180～240 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2021-0011,所有動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物倫理號:202208A032)。

將30只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、外治法組,每組各10只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,空白組不作任何干預(yù),模型組使用前交叉韌帶橫斷術(shù)(Anterior cruciate ligament transection,ACLT)造模處理無需藥物干預(yù),外治法組行ACLT造模14 d后采用溫經(jīng)活血外治法藥物貼敷28 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物準(zhǔn)備

“易層”貼敷購自江蘇省中醫(yī)院,由三色散和復(fù)方三黃油膏組成,所用的中藥材均符合《中國藥典》要求,所有藥物于4 ℃環(huán)境中保存。

1.3 造模方法

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,空白組不做任何處理,模型組、外治法組大鼠,用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,膝關(guān)節(jié)備皮消毒,自膝關(guān)節(jié)外側(cè)切開至關(guān)節(jié)腔,離斷前交叉韌帶,行抽屜試驗(yàn)陽性后逐層縫合,造模后將大鼠放回籠中,關(guān)節(jié)不固定,讓其自由活動。動物房室溫維持在(25±2)℃,相對濕度控制在(60±5)%,每天日照/夜晚為12 h輪替。

1.4 給藥方法

造模14 d后開始用藥。膝關(guān)節(jié)備皮后,皮膚表面均勻涂抹[16]溫經(jīng)活血外治法膏藥,每天貼敷8 h,共貼敷28 d。使用獨(dú)特設(shè)計(jì)的樂扣杯[17],誘使大鼠進(jìn)入杯中,將鼠尾置于杯外,底部鉆出多個(gè)中型孔洞,方便大鼠飲水,保持通氣性,保證給藥后的大鼠舔舐不到膝關(guān)節(jié)所涂抹的外治藥膏,8 h后再取出大鼠置于籠中正常飼養(yǎng)。

1.5 組織樣本提取和保存方法

給藥干預(yù)28 d后,使用配置好的3%戊巴比妥鈉(Sigma公司)腹腔注射麻醉各組大鼠,剖開腹部,將腹腔內(nèi)臟翻至一側(cè),找到腹主動脈后采血至采血管中,靜置,離心后-80 ℃凍存;大鼠背部備皮,剝離腰段脊柱,沿著矢狀位剪開脊柱,循神經(jīng)根走形尋找并提取L3～L5背根神經(jīng)節(jié)(Dorasal root ganglion,DRG)組織;大鼠膝關(guān)節(jié)備皮,自髕韌帶兩側(cè)切開后,再橫向切開股四頭肌遠(yuǎn)端,向遠(yuǎn)端翻折髕骨及韌帶,取下髕韌帶上滑膜組織。每組隨機(jī)選取3只大鼠滑膜組織和DRG組織放入事先準(zhǔn)備好的含有4%多聚甲醛的凍存管中保存,以備病理切片,其余放入對應(yīng)的凍存管,-80 ℃保存。

1.6 HE染色和鍍銀染色

將4%多聚甲醛固定的滑膜,用石蠟包埋,切片,滑膜組織常規(guī)HE染色,鏡下攝片;用石蠟包埋,切片,水洗,銀染,固定,封固等,依據(jù)神經(jīng)纖維染色試劑盒說明書進(jìn)行,鏡下攝片。

1.7 ELISA法檢測血清中炎性及疼痛標(biāo)志物

在眾多病理性疼痛的研究中降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)是觀察疼痛敏感性的關(guān)鍵指標(biāo)[18];P物質(zhì)(Substance P,SP)是廣泛分布于細(xì)神經(jīng)纖維內(nèi)的一種神經(jīng)肽,且與痛覺傳遞密切相關(guān)[19]。這兩者是常見的疼痛相關(guān)標(biāo)志物。而白介素-6(Interleukin 6,IL-6)則作為臨床上常見的促炎因子,其在血清中的含量被作為評價(jià)機(jī)體炎癥反應(yīng)的指標(biāo)之一[20]。本研究分別依據(jù)大鼠IL-6(檢測范圍:0.25～8 ng·mL-1)、SP(檢測范圍:5～160 pg·mL-1)和CGRP(檢測范圍:1.25～40 pg·mL-1) ELISA檢測試劑盒(購自金益佰公司)說明書進(jìn)行以下步驟檢測:標(biāo)準(zhǔn)、空白每孔加入50 μL,樣本孔中每孔加入10 μL(40 μL樣本稀釋液);每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL,空白孔除外,后蓋上封板膜,至37 ℃孵育60 min;在孵育過程中將洗滌液配好,將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用;每孔加入250～300 μL的洗滌液,將板子平放在桌子上晃動5 s,然后靜置30 s,甩干,拍板;然后每孔中依次加入顯色A液50 μL,顯色B液50 μL避光37 ℃顯色15 min后,每孔加入50 μL的終止液。以空白孔調(diào)零,450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

1.8 Western blot檢測Netrin-1、DCC、UNC5、CGRP蛋白表達(dá)

提取滑膜組織和DRG組織總蛋白:滑膜組織和DRG組織自-80 ℃中取出,剪碎研磨成粉,后按說明書要求加入400 μL RIPA裂解液(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解,繼續(xù)研磨10～15 min,再于冰上靜置30 min后離心取上清,按BCA蛋白測定試劑盒(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書測定各組織蛋白濃度,后將配平的組織蛋白置于98 ℃變性5 min。取樣化凍并離心,制膠,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,再用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,封閉完成后用1×TBST洗膜3次,每次10 min,后加入一抗:Netrin-1(DF8579,affinity公司)、DCC(DF3611,affinity公司)、UNC5(DF13685,affinity公司)、CGRP(df7386,affinity公司)、β-actin(ab8227,美國Abcam公司),4 ℃孵育過夜,次日1×TBST洗滌3次,每次10 min,二抗(羊抗兔二抗,ab205718,美國Abcam公司)室溫孵育2 h,ECL顯色曝光。以β-actin作為內(nèi)參,分析灰度值,計(jì)算灰度系數(shù)=(目標(biāo)蛋白的面積×灰度值)/(β-actin的面積×灰度值)取樣。

1.9 qPCR檢測Netrin-1、DCC、UNC5、CGRP基因表達(dá)

按Trizol法說明書進(jìn)行滑膜組織和DRG組織總RNA提取,并測定各組RNA吸光度。逆轉(zhuǎn)錄后按照SYBR qPCR mix說明書操作,qPCR結(jié)果以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量計(jì)算,采用2-ΔΔCt計(jì)算法,即(ΔCt=樣本Ct值-內(nèi)參Ct值)對目的基因的相對表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物設(shè)計(jì)如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.10 大鼠冷板抬爪實(shí)驗(yàn)

將各組大鼠在第0、14、28、42天置于提前設(shè)定好的溫度為0 ℃的可調(diào)溫金屬板上,透明罩子罩住后,通過可調(diào)溫金屬板系統(tǒng)(35150-001,意大利Ugo Basil SLR)監(jiān)測大鼠在冷板上的抬爪時(shí)間并記錄。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對各組所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用Graphpad Prism 8.0軟件統(tǒng)計(jì)分析并繪制柱狀圖,各組間均采用單因素方差法分析,其中P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠滑膜組織HE染色

倒置顯微鏡觀察滑膜組織HE染色切片,空白組滑膜細(xì)胞有序分布,幾乎無炎性細(xì)胞浸潤;KOA組中炎性細(xì)胞浸潤明顯增加,滑膜細(xì)胞大量增生,并且排列不規(guī)則,呈重度滑膜炎病理改變;外治法組中炎性細(xì)胞浸潤相比于KOA組明顯減少。見圖1。

圖1 滑膜組織HE染色切片(×200)Fig.1 HE staining sections of synovial tissue(× 200)

2.2 大鼠滑膜組織神經(jīng)鍍銀染色

倒置顯微鏡觀察滑膜組織神經(jīng)鍍銀染色切片,空白組滑膜細(xì)胞和神經(jīng)纖維表達(dá)量少;KOA組中滑膜細(xì)胞大量增生,且神經(jīng)纖維數(shù)量和表達(dá)量明顯上升,呈嚴(yán)重的滑膜纖維化及感覺神經(jīng)萌發(fā)改變;外治法組相比于KOA組滑膜細(xì)胞明顯減少,且神經(jīng)纖維數(shù)量和表達(dá)量也明顯減少。見圖2。

圖2 滑膜組織神經(jīng)鍍銀染色切片(×200)Fig.2 Nerve silver staining sections of synovial tissue(× 200)

2.3 大鼠血清中促炎因子和疼痛因子含量的變化

KOA組中促炎因子IL-6的表達(dá)量相比于空白組有了明顯增多的趨勢,而外治法組相比于KOA組則減少趨勢明顯;同時(shí),KOA組大鼠血清中疼痛介質(zhì)SP和CGRP的表達(dá)量相比于空白組也有了明顯的增加趨勢,外治法組則相比于KOA組有了明顯的減少趨勢。見圖3。

注:與空白組比較,**P<0.01;與KOA組比較,圖3 各組大鼠血清中促炎因子IL-6和疼痛因子SP、CGRP含量Fig.3 Levels of pro-inflammatory factor IL-6 and pain mediator SP and CGRP in the serum of rats in each group

2.4 大鼠冷板抬爪時(shí)間

與空白組相比,KOA組和外治法組在第14天冷板抬爪時(shí)間有了明顯的縮短,KOA組直至末次給藥的第42天抬爪時(shí)間的波動都較為平緩,而外治法組則在開始給藥后抬爪時(shí)間在緩慢延長,趨近于空白組。見圖4。

圖4 各組大鼠不同時(shí)間冷板抬爪時(shí)間Fig.4 Cold plate paw lifting time for each group of rats at different time

2.5 各組大鼠滑膜組織Netrin-1、CGRP蛋白和基因的表達(dá)量

Netrin-1、CGRP蛋白在KOA組相比于空白組表達(dá)明顯增加(P<0.01),外治法組較KOA組的表達(dá)則明顯減少(P<0.01);同時(shí)KOA組滑膜組織中Netrin-1的基因表達(dá)相比于空白組明顯增加(P<0.05),外治法組相比于KOA組中Netrin-1的基因表達(dá)則明顯減少(P<0.01);KOA組滑膜組織中CGRP的基因表達(dá)相比于空白組則明顯增加(P<0.05),外治法組相比于KOA組則明顯減少(P<0.01)。見圖5。

注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與KOA組比較,圖5 各組大鼠滑膜組織Netrin-1、CGRP相對蛋白和基因表達(dá)比較Fig.5 Comparison of relative protein and gene expression of Netrin-1 and CGRP in synovial tissue of rats in each group

2.6 各組大鼠DRG組織DCC、UNC5蛋白和基因表達(dá)量

DCC蛋白在KOA組相比于空白組表達(dá)明顯增加(P<0.01),外治法組較KOA組的表達(dá)則明顯減少(P<0.01);UNC5蛋白在KOA組相比于空白組表達(dá)明顯減少(P<0.01),外治法組較KOA組的表達(dá)則明顯增加(P<0.01)。KOA組DRG組織中DCC的基因表達(dá)相比于空白組明顯增加(P<0.05),外治法組相比于KOA組中DCC的基因表達(dá)則明顯減少(P<0.05);而KOA組DRG組織中UNC5的表達(dá)相比于空白組則減少,外治法組相比于KOA組中UNC5的表達(dá)則增加。見圖6。

注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與KOA組比較,圖6 各組大鼠滑DRG組織DCC、UNC5相對蛋白和基因表達(dá)比較Fig.6 Comparison of relative protein and gene expression of DCC and UNC5 in the smooth DRG tissue of rats in each group

3 討論

KOA在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)范疇中屬于“痹癥”,根據(jù)其病因病機(jī)“不通則痛,不榮則痛”可以將本病分為虛實(shí)兩證,而疼痛則貫穿整個(gè)疾病過程,因此緩解疼痛成為了減輕KOA患者痛苦的首要需求。在中醫(yī)方面,溫經(jīng)活血外治法代表方——“易層”貼敷正是以溫經(jīng)活血立法,可以有效地針對因不通和不榮所導(dǎo)致的KOA疼痛,且在臨床實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。我們大量的前期研究表明溫經(jīng)活血外治法不僅能延緩在KOA早期出現(xiàn)的滑膜炎,還可以緩解KOA患者疼痛感受,極大地改善患者的生活質(zhì)量[21]。在前期研究中,我們對“易層”貼敷的有效成分進(jìn)行了代謝組學(xué)分析,從中檢測出大量的有效化合物[22]。有趣的是文獻(xiàn)中也報(bào)道這些有效化合物對多類疾病的疼痛均具有緩解的效果,如:溫經(jīng)活血湯加減聯(lián)合壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸治療子宮腺肌病慢性疼痛療效肯定,可明顯緩解痛經(jīng)癥狀,縮短痛經(jīng)及排卵痛持續(xù)時(shí)間[23];當(dāng)歸通過改善血液流變學(xué)、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌激素、降低鈣離子、免疫調(diào)節(jié)等途徑達(dá)到緩解原發(fā)性痛經(jīng)的效果[24];姜黃素可以顯著減輕KOA大鼠膝關(guān)節(jié)的痛覺過敏和軟骨退變,其作用機(jī)制可能與減少IL-1β、TNF-α,單核細(xì)胞趨化蛋白-1的含量及恢復(fù)軟骨代謝平衡有關(guān)[25];香草酸可以顯著減少KOA大鼠滑膜炎癥和疼痛因子CGRP、TrkA的表達(dá)[26];在白楊素的干預(yù)下,KOA大鼠滑膜炎癥和膝關(guān)節(jié)疼痛癥狀明顯改善,同時(shí)還降低了相關(guān)炎性因子和疼痛因子的表達(dá)[27]。

本研究的結(jié)果顯示溫經(jīng)活血外治法能夠顯著減輕KOA大鼠疼痛,抑制血清中促炎因子IL-6和疼痛介質(zhì)SP、CGRP的表達(dá),緩解了膝關(guān)節(jié)滑膜炎癥。同時(shí),我們還觀察到在KOA組滑膜組織中軸突導(dǎo)向因子Netrin-1的表達(dá)相比于空白組明顯增加,而在溫經(jīng)活血外治法的干預(yù)下,相比于KOA組則明顯降低。此外,與KOA組相比溫經(jīng)活血外治法增加了大鼠DRG組織中UNC5的含量,雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍呈上升趨勢,我們還觀察到KOA組中UNC5含量較空白組反而有所減少,這可能是因?yàn)镵OA發(fā)生過程中激活了軸突導(dǎo)向因子Netrin-1并產(chǎn)生對神經(jīng)元的吸引和排斥作用從而共同引發(fā)神經(jīng)萌發(fā)的現(xiàn)象,導(dǎo)致疼痛的發(fā)生。對此,我們也觀察到滑膜組織中疼痛因子CGRP的表達(dá)量在KOA組相比于空白組明顯上升,而在溫經(jīng)活血外治法干預(yù)下則明顯減少,這也符合我們的猜想。

前期研究中,我們報(bào)道了KOA滑膜組織中Netrin1與CGRP標(biāo)記的神經(jīng)纖維共定位,此外,與本研究相一致,Wang等也在KOA滑膜組織中觀察到CGRP表達(dá)量的升高,預(yù)示著滑膜組織中CGRP相關(guān)神經(jīng)密度的增加[28]。我們認(rèn)為,對KOA疼痛相關(guān)研究而言,檢測滑膜組織局部的CGRP可能更有說服力。同時(shí),與我們的研究相似,新近的研究證實(shí)了Netrin-1參與外周痛敏,例如Zheng等的研究發(fā)現(xiàn),Netrin-1誘導(dǎo)椎間盤性腰痛,介導(dǎo)椎間盤變性的神經(jīng)支配和血管生成[29]。另有研究觀察到KOA破骨細(xì)胞分泌Netrin-1,通過DCC受體對DRG神經(jīng)元形成吸引導(dǎo)向,介導(dǎo)KOA小鼠的機(jī)械痛敏[30]。Ni的研究也表示,敲除破骨細(xì)胞中的Netrin-1可以有效消除多孔終板和脊柱超敏反應(yīng)的感覺神經(jīng)支配[31]。

綜上所述,我們的研究表明溫經(jīng)活血外治法有助于緩解KOA滑膜炎癥和抑制Netrin-1的表達(dá),從而緩解疼痛,這可能是通過抑制軸突導(dǎo)向因子Netrin-1的分泌達(dá)到抑制神經(jīng)萌發(fā)的作用,并干預(yù)了相關(guān)信號通路從而降低KOA疼痛,然而本研究的局限性同樣需要關(guān)注:本研究的樣本量較少,對大鼠的觀察時(shí)間短、不連續(xù),對此,在之后的研究中我們將進(jìn)一步擴(kuò)大總的樣本量,深入研究“Netrin-1-神經(jīng)萌發(fā)-疼痛”中的具體作用機(jī)制,為KOA的治療提供全新的角度。