蔡玉豐,李歡,錢正剛,2,柳航,2,奚肇宏,張華軍,胡巍,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210008;2.南京鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇 南京 210008;3.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化科,江蘇 南京 210028;4.南京鼓樓醫(yī)院中醫(yī)科,江蘇 南京 210008)

慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis,CAG)又稱胃癌前期病變,是胃癌發(fā)展過程中重要環(huán)節(jié),其機(jī)制主要與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等有關(guān)[1-3]。由于患病人數(shù)多,易反復(fù)發(fā)作,已成為重要公共衛(wèi)生問題,近年來有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方治療CAG的療效顯著,可有效緩解癥狀,改善患者體質(zhì),防止其向胃癌進(jìn)一步發(fā)展[4-5]。石丹顆粒(Shidan granule,SDG)是江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方,由黨參、黃芪、白術(shù)、茯苓、石見穿、土茯苓、薏苡仁、丹參、廣木香等13味中藥組成,有益氣健脾,化瘀通絡(luò)之效。前期研究表明SDG不僅可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路以減輕炎癥,還能夠調(diào)節(jié)能量平衡,對(duì)CAG有明顯的療效[6-7]。但作為復(fù)雜的中藥復(fù)方,傳統(tǒng)的藥理學(xué)研究策略存在一定的局限性,其作用機(jī)制難以完全闡明。如何深入闡釋SDG治療CAG的分子機(jī)制,對(duì)于臨床上SDG的廣泛應(yīng)用具有重要意義。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為多學(xué)科交叉研究手段,對(duì)于發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方藥物靶點(diǎn),揭示其科學(xué)內(nèi)涵有顯著優(yōu)勢(shì)[8]。因此,本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,篩選SDG有效成分,分析其治療CAG的作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路。并基于此進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,探討SDG治療CAG的作用機(jī)制,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 石丹顆?；钚猿煞值暮Y選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)[9](TCMSP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索SDG各中藥化學(xué)組成成分,根據(jù)2個(gè)ADEM參數(shù)口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性≥0.18(Drug likeness,DL)進(jìn)行活性成分初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。近年來,本團(tuán)隊(duì)致力于SDG物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的研究,經(jīng)前期對(duì)SDG的體內(nèi)外成分鑒定,補(bǔ)充活性成分并預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)[10]。篩選結(jié)束后,經(jīng)Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.1.2 慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞,挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫[11](https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫[12](https://omim.org/)中治療CAG的潛在靶點(diǎn)。

1.1.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 為明晰SDG藥物相關(guān)靶點(diǎn)與CAG靶點(diǎn)間的相互作用,通過Sangerbox 3.0在線作圖平臺(tái)[13](http://vip.sangerbox.com/login.html)將二者靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖。進(jìn)而將交集靶點(diǎn)提交至String11.0數(shù)據(jù)庫[14](https://cn.string-db.org/)構(gòu)建蛋白互作(Protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)模型,將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”,得到PPI網(wǎng)絡(luò)。為篩選發(fā)揮作用的核心靶點(diǎn),將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件,利用其Network Analyzer內(nèi)置分析工具對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析,獲得各靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),包括連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closeness)等,而后通過Cytoscape 3.9.0軟件Cytohubba插件基于Degree算法篩選核心靶點(diǎn),將其可視化[15]。

1.1.4 “藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析 通過Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建“石丹顆粒藥物-活性成分-慢性萎縮性胃炎-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。為探討SDG發(fā)揮藥效的潛在化合物,運(yùn)用Cytoscape 3.9.0軟件中Network Analyzer獲得連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closeness)等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),并根據(jù)Degree值判斷主要活性成分。

1.1.5 靶點(diǎn)GO功能與KEGG通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫[16-17](https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對(duì)“石丹顆粒-慢性萎縮性胃炎交集靶點(diǎn)”進(jìn)行GO功能與KEGG代謝通路富集分析,其中GO功能分析包括生物過程(Biological process,BP)、細(xì)胞成分(Cellular component,CC)、分子功能(Molecular function,MF)三部分,利用Sangerbox 3.0對(duì)保存的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載SDG中排名前7的關(guān)鍵活性成分的3D結(jié)構(gòu);通過RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)查找并下載排名前10的核心靶點(diǎn)的3D晶體結(jié)構(gòu)。利用AutodockTools1.5.6軟件對(duì)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、加氫、加電荷處理,再利用Autodock Vina1.1.2軟件對(duì)活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接操作,以Affinity結(jié)合能值來評(píng)價(jià)二者的結(jié)合強(qiáng)度并通過Sangerbox 3.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化[18-19]。最后利用Pymol 2.5軟件對(duì)部分對(duì)接結(jié)果以Affinity值最低位點(diǎn)的圖像進(jìn)行可視化。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 細(xì)胞 人胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1細(xì)胞)購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.2.2 試劑N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine,MNNG,批號(hào):C14503078)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;SDG藥液由南京鼓樓醫(yī)院提供;RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào):KGM31800)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,批號(hào):KGY008)、全蛋白提取試劑盒(批號(hào):KGP250)、細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8,批號(hào):BS350A)均購(gòu)自凱基生物;人IL-6、TNF-αELISA試劑盒(批號(hào):A10620524,A18221132)購(gòu)自聯(lián)科生物;磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS,批號(hào):G4202)、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào):G2026)、蛋白激酶B1(Protein kinase B1,Akt1,批號(hào):GB111114)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6,批號(hào):GB11117)、腫瘤壞死因子-α(Tumour necrosis factor-α,TNF-α,批號(hào):GB11188)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,批號(hào):GB15002)、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HPR)標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG抗體(批號(hào):GB23301,GB23303)均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。磷酸化Akt1(Phosphorylated-Akt1,p-Akt1,批號(hào):AF0908)購(gòu)自美國(guó)Affinity公司。

1.2.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)、全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)、熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、曝光儀(上海Tanon公司)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)、模型構(gòu)建及給藥 GES-1細(xì)胞用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用30 μmol·L-1MNNG孵育GES-1細(xì)胞24 h誘導(dǎo)模型的形成,之后分別給予低、中、高劑量(50、100、125 μg·mL-1)的SDG藥液干預(yù)24 h,對(duì)照組不予誘導(dǎo)與干預(yù)處理。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,將細(xì)胞接種在96孔板中,每孔6×103個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞長(zhǎng)滿至70%～80%時(shí),進(jìn)行下一步干預(yù)處理。對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基,干預(yù)組分別給予不同濃度(0、5、10、20、30、40 μmol·L-1)的MNNG培養(yǎng)24 h;30 μmol·L-1MNNG誘導(dǎo)24 h后,用不同濃度(0、20、50、100、125、150 μg·mL-1)的SDG藥液培養(yǎng)24 h。之后吸去每孔上清液,每孔加入100 μL檢測(cè)試劑(10 μL CCK-8溶液+90 μL無血清培養(yǎng)基),繼續(xù)孵育2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.6 ELISA檢測(cè)炎癥因子 按照“1.2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞并給藥后,收集細(xì)胞上清液,按照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書操作,測(cè)定培養(yǎng)液中IL-6和TNF-α的含量。

1.2.7 qPCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) 按照“1.2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞并給藥后,收集細(xì)胞,采用熒光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)檢測(cè)GES-1細(xì)胞Akt1、IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá),運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。引物信息見表1,引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.8 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 按照“1.2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞并給藥后,收集細(xì)胞并于冰上裂解,采用Western blot半定量分析各組細(xì)胞Akt1、p-Akt1、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平。使用Image J軟件分析條帶灰度值,對(duì)目的蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 石丹顆粒活性成分靶點(diǎn)的獲取 經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索篩選得到SDG活性成分229個(gè),靶點(diǎn)262個(gè)。基于團(tuán)隊(duì)前期對(duì)SDG體內(nèi)外成分研究對(duì)活性成分進(jìn)行補(bǔ)充,整合后得到SDG活性成分共230個(gè),靶點(diǎn)共268個(gè),結(jié)果見表2。

表2 石丹顆?；钚猿煞?jǐn)?shù)及靶點(diǎn)數(shù)Table 2 Numbers of active components andtargets of Shidan Granules

2.1.2 慢性萎縮性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 經(jīng)GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索篩選得到CAG靶點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為404、86,去除重復(fù)值后得到484個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 通過Sangerbox 3.0將篩選的SDG成分靶點(diǎn)與CAG靶點(diǎn)取交集,并繪制韋恩圖,得到“石丹顆粒-慢性萎縮性胃炎”共同靶點(diǎn)82個(gè),見圖1。隨后將82個(gè)交集靶點(diǎn)提交至String11.0平臺(tái),通過Cytoscape 3.9.0軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)圖可視化,見圖2,其中網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)的大小代表相應(yīng)的度值,節(jié)點(diǎn)越大則Degree值越大,具體參數(shù)見表3。再利用Cytohubba插件篩選并繪制Degree排名前10的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3,結(jié)果表明這10個(gè)靶點(diǎn)可能是SDG治療CAG的潛在治療靶點(diǎn),其中IL-6、Akt1和TNF的Degree最高為140,預(yù)測(cè)三者為最主要的靶點(diǎn)。

圖1 “石丹顆粒-慢性萎縮性胃炎”靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of targets in ShidanGranules-chronic atrophic gastritis

圖2 “石丹顆粒-慢性萎縮性胃炎”交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein-protein interaction network of ShidanGranules-chronic atrophic gastritis

圖3 前10核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Diagram of the top 10 core target network

表3 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果(Degree前10)Table 3 Core target network topology analysisresults (Degree Top 10)

2.1.4 “石丹顆粒藥物-活性成分-慢性萎縮性胃炎-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及分析 利用Cytoscape 3.9.0軟件對(duì)“藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化并分析,共獲得258個(gè)節(jié)點(diǎn)和879條關(guān)系,結(jié)果見圖4。網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)大小與Degree值成正比。使用軟件內(nèi)置工具Network Analyzer分析活性成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),活性成分的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)結(jié)果見表4,結(jié)果顯示槲皮素、木犀草素、豆甾醇、常春藤皂苷元的Degree值較高,表明上述成分是SDG治療CAG的主要有效成分。

注:正方形.藥物;八邊形.藥材;菱形.活性成分;六邊形.疾病;圓形.靶點(diǎn)圖4 “藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Drugs-components-disease-targets interaction network

表4 主要活性成分網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果(Degree前10)Table 4 Network topology analysis results of main active ingredients (Degree Top 10)

2.1.5 GO功能與KEGG通路富集分析 將得到的SDG治療CAG的82個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。針對(duì)富集程度排名前20的GO分析結(jié)果繪制氣泡圖,包括生物功能(圖5A)、細(xì)胞成分(圖5B)、分子功能(圖5C)。GO富集結(jié)果顯示SDG活性成分主要作用于細(xì)胞質(zhì)、基質(zhì)膜、核質(zhì)、線粒體等;分子功能包括調(diào)節(jié)酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合和磷酸化、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、NF-κB結(jié)合等;生物過程包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、DNA轉(zhuǎn)錄、RNA結(jié)合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄等。

注:A.GO-BP分析;B.GO-CC分析;C.GO-MF分析;D.KEGG分析圖5 石丹顆粒治療慢性萎縮性胃炎作用靶點(diǎn)富集氣泡圖Fig.5 Target enrichment bubble map of Shidan Granules in treatment of chronic atrophic gastritis

KEGG通路富集分析共得到152條富集信息,結(jié)果顯示作用靶點(diǎn)主要涉及的信號(hào)通路有IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖、PI3K-Akt信號(hào)通路等,將富集程度排名前20的結(jié)果可視化,見圖5D。

2.1.6 分子對(duì)接結(jié)果 將7種關(guān)鍵活性成分分別與10個(gè)核心靶點(diǎn)IL-6(PDBID:7NXZ)、Akt1(PDBID:1GZK)、TNF(PDBID:2E7A)、TP53(PDBID:1UOL)、VEGFA(PDBID:1MJV)、IL-1β(PDBID:1HIB)、MMP9(PDBID:5TH6)、STAT3(PDBID:6NJS)、CASP3(PDBID:3DEH)、PTGS2(PDBID:5IKT)進(jìn)行分子對(duì)接,得到70組對(duì)接結(jié)果。其中Affinity<-5 kcal·mol-1(1 kcal≈4.185 85 kJ)的組合共有69組,Affinity<-7 kcal·mol-1的有50組,結(jié)果表明絕大部分靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分的結(jié)合活性較好,分子對(duì)接結(jié)果見圖6,其中豆甾醇與CAPS3蛋白結(jié)合能為-10.4 kcal·mol-1,表明二者結(jié)合活性最優(yōu)。隨后將IL-6、Akt1、TNF分別與槲皮素、木犀草素、豆甾醇、常春藤皂苷元分子對(duì)接結(jié)果可視化處理,見圖7。對(duì)接結(jié)果顯示各活性成分均嵌入靶點(diǎn)的活性口袋中,分別與IL-6、Akt1、TNF中的多個(gè)氨基酸殘基通過形成氫鍵發(fā)生作用,其中槲皮素分子對(duì)接結(jié)果構(gòu)象更為穩(wěn)定,如圖7所示,槲皮素通過與IL-6的LEU-63、SER-168氨基酸殘基形成3個(gè)氫鍵;通過與Akt1的ASP-354、PHE-350、GLY-346氨基酸殘基形成3個(gè)氫鍵;通過與TNF的SER-99、ARG-98、GLU-116氨基酸殘基形成9個(gè)氫鍵。

圖6 分子對(duì)接結(jié)果Fig.6 Results of molecular docking

圖7 石丹顆粒主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接圖Fig.7 Molecular docking diagram of main active components and core target of Shidan Granules

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)CCK-8檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞活力,結(jié)果顯示當(dāng)以30 μmol·L-1濃度的MNNG培養(yǎng)GES-1細(xì)胞24h后,細(xì)胞活力與對(duì)照組相比明顯下降(P<0.01),見圖8A,故選用30 μmol·L-1培養(yǎng)24 h為造模條件;當(dāng)SDG濃度為20 μg·mL-1時(shí),GES-1細(xì)胞活力與MNNG組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而SDG濃度為50、100、125、150 μg·mL-1時(shí),與MNNG組相比細(xì)胞活力顯著升高(P<0.01),見圖8B,結(jié)果表明SDG濃度為50、100、125 μg·mL-1時(shí)可以提高細(xì)胞活力并對(duì)GES-1細(xì)胞無明顯損害,而濃度為150 μg·mL-1時(shí)細(xì)胞活力略有下降,故選取50、100、125 μg·mL-1作為給藥組濃度,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注:圖8 MNNG和石丹顆粒對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effects of MNNG and Shidan Granules oncell viability

2.2.2 石丹顆粒對(duì)IL-6、TNF-α含量的影響 經(jīng)ELISA檢測(cè)分析,結(jié)果表明與對(duì)照組相比,MNNG組IL-6、TNF-α含量明顯升高(P<0.01);經(jīng)SDG(50、100、125 μg·mL-1)干預(yù)后,與MNNG組相比,IL-6、TNF-α含量明顯下降(P<0.01),見圖9。結(jié)果表明,SDG能降低炎癥因子分泌。

注:圖9 石丹顆粒對(duì)IL-6、TNF-α的影響Fig.9 Effect of Shidan Granules on IL-6、TNF-α

2.2.3 石丹顆粒對(duì)核心靶基因表達(dá)的影響 經(jīng)qPCR檢測(cè)分析,與對(duì)照組相比,MNNG組Akt1的mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),而IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯上升(P<0.01);經(jīng)SDG(50、100、125 μg·mL-1)干預(yù)后,與MNNG組相比,Akt1的mRNA表達(dá)水平明顯上升(P<0.01),而IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),見圖10。結(jié)果表明,SDG能明顯調(diào)節(jié)核心靶基因表達(dá)水平。

注:圖10 石丹顆粒對(duì)核心靶基因mRNA表達(dá)的影響Fig.10 Effect of Shidan Granules on mRNA expression of core target genes

2.2.4 石丹顆粒對(duì)核心靶蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)Western blot檢測(cè)分析,與對(duì)照組相比,MNNG組p-Akt1蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),而IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)(P<0.01);經(jīng)SDG(50、100、125 μg·mL-1)干預(yù)后,與MNNG組相比,p-Akt1蛋白表達(dá)水平明顯上升(P<0.01),而IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),見圖11。結(jié)果表明,SDG能顯著調(diào)節(jié)核心靶點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平。

注:圖11 石丹顆粒對(duì)核心靶蛋白表達(dá)的影響Fig.11 Effect of Shidan Granules on expression of core target proteins

3 討論

本研究基于拓?fù)鋮?shù)分析發(fā)現(xiàn)槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元等為SDG治療CAG的重要活性成分,其中前兩者分別來自本方君藥黃芪、黨參,豆甾醇來自黨參和土茯苓,常春藤皂苷元來自黃芪和茯苓。槲皮素和木犀草素均為天然的黃酮類化合物,二者都具有抗炎、抗氧化、抗癌以及抗病毒活性等藥理作用[20-21]。文獻(xiàn)報(bào)道,黃酮類化合物對(duì)預(yù)防胃癌有明顯療效,被證明是一種可行的替代療法[22]。近年來有研究表明,槲皮素可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路和AP-1信號(hào)通路減輕TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥[23-24],還能夠通過介導(dǎo)IRF8/IFN-γ改善幽門螺桿菌感染誘導(dǎo)的慢性萎縮性胃炎[25]。木犀草素通過抑制IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2等多種促炎因子,進(jìn)而參與調(diào)控炎癥反應(yīng)[26]。豆甾醇和常春藤皂苷元二者近年來常被作為潛在的抗癌藥物,對(duì)各類腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移有良好的抑制作用[27-28]。有研究報(bào)道,豆甾醇通過調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡和自噬[29];常春藤皂苷元通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制HGC-27細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而發(fā)揮抗胃癌作用[30]。以上提示SDG可能通過參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)控腫瘤細(xì)胞,以促進(jìn)CAG患者病情趨于好轉(zhuǎn),延緩或抑制其發(fā)生癌變。

針對(duì)“石丹顆粒-慢性萎縮性胃炎”82個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行分析,基于Degree值推測(cè)IL-6、Akt1、TNF為SDG治療CAG的核心靶點(diǎn)。IL-6為促炎細(xì)胞因子家族的成員之一,可通過多種途徑參與炎癥反應(yīng),在炎癥性疾病治療中發(fā)揮重要作用[31-32]。近年來研究表明,在CAG的發(fā)生和發(fā)展中,IL-6不僅參與炎癥反應(yīng)和組織損傷過程,而且還可以促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[33-35]。Akt1作為Akt亞型之一,有研究發(fā)現(xiàn),在CAG模型中,Akt1主要通過PI3K/Akt信號(hào)通路負(fù)責(zé)參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過程,Akt1的激活能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞增生修復(fù),影響炎癥反應(yīng)[36]。TNF是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞因子,能夠促進(jìn)炎癥因子的釋放,誘發(fā)凋亡的產(chǎn)生[37]。有研究報(bào)道,在胃炎患者的胃黏膜組織中,TNF-α的表達(dá)明顯增高。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TNF-α可以激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而導(dǎo)致胃癌的發(fā)展[38-41]。利用Autodock對(duì)槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,驗(yàn)證其結(jié)合能力,結(jié)果顯示對(duì)接良好,進(jìn)一步說明槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元可能主要通過IL-6、Akt1和TNF等靶點(diǎn)發(fā)揮治療CAG的作用。GO和KEGG富集分析結(jié)果亦顯示,SDG主要通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)從而改善CAG。

為證實(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,本研究選擇IL-6、TNF-α和Akt1核心靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果表明SDG中槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元等主要活性成分可能通過調(diào)節(jié)IL-6、Akt1和TNF-α等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮作用,降低IL-6和TNF-α炎癥因子水平,緩解炎癥反應(yīng),從而改善CAG抑制其向胃癌發(fā)展,與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

綜上,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測(cè)SDG中槲皮素、木犀草素、豆甾醇和常春藤皂苷元等主要活性成分通過作用于IL-6、TNF-α和Akt1等核心靶點(diǎn)調(diào)控IL-17、TNF-α和PI3K-Akt等信號(hào)通路,參與細(xì)胞凋亡與增殖、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程,從而發(fā)揮抗炎、抗腫瘤作用;并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,為進(jìn)一步研究SDG治療CAG的分子作用機(jī)制提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。