繆蓉,周李煜,白丹丹,楊云君,陳艷冉,姜林宏,袁冬平,龍軍,吉娟

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所,江蘇 南京 210042)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是脂質(zhì)沉積驅(qū)動(dòng)的慢性炎癥性疾病,機(jī)體亢進(jìn)的免疫應(yīng)答與脂質(zhì)負(fù)載共同參與AS病變[1]。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族催化,將甲基添加到CpG位點(diǎn)5′位置的胞嘧啶碳上的表觀遺傳修飾過程[2]。異常的DNA甲基化通過參與炎癥形成、平滑肌增殖、脂代謝調(diào)控和血管損傷等過程在AS病程中發(fā)揮重要作用[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方可以對(duì)DNA甲基化進(jìn)行調(diào)控從而干預(yù)疾病的進(jìn)程,包括AS、腫瘤等[4-5]。中醫(yī)理論認(rèn)為,AS的病機(jī)是肝腎陰虛,痰濁瘀阻,瘀熱蘊(yùn)毒損脈[6]。養(yǎng)陰活血方是江蘇省名老中醫(yī)唐蜀華教授依據(jù)多年治療AS的臨床經(jīng)驗(yàn),以補(bǔ)益肝腎陰血、活血清熱解毒并治為原則創(chuàng)立的復(fù)方。課題組前期在高脂飲食(High fat diet,HFD)聯(lián)合HSP65免疫和HFD聯(lián)合LPS注射誘導(dǎo)的2種ApoE-/-小鼠AS模型中發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰活血方對(duì)AS具有積極的治療作用[7],這些作用與其調(diào)節(jié)免疫和炎癥有密切關(guān)系。然而養(yǎng)陰活血方能否通過調(diào)節(jié)感染性炎癥條件下DNA甲基化的酶水平來減輕AS尚不清楚。本研究在構(gòu)建HFD聯(lián)合LPS注射形成AS疾病模型[8]的基礎(chǔ)上,研究養(yǎng)陰活血方對(duì)感染性炎癥誘發(fā)的ApoE-/-AS小鼠DNA甲基化酶水平的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物

ApoE-/-小鼠(6～7周,18～22 g,雄性,SPF級(jí)),由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究所提供,許可證號(hào):SCXK(蘇)2015-0001,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障環(huán)境。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過,倫理批號(hào):201804A011。

1.2 藥物與試劑

養(yǎng)陰活血方由制何首烏20 g,酒黃精10 g,虎杖30 g,漏蘆30 g,姜黃10 g,紅花10 g組成(江陰天江藥業(yè)有限公司),批號(hào):1511048、1512161、1510034、1506035、1507084、1512165。養(yǎng)陰單元由制何首烏、酒黃精組成,清熱單元由虎杖、漏蘆組成,活血單元由姜黃、紅花組成。按前期報(bào)道方法制備養(yǎng)陰活血方及各功效單元[7],藥物劑量(生藥量)為:全方,18 g·kg-1;養(yǎng)陰,5 g·kg-1;清熱,10 g·kg-1;活血,3.3 g·kg-1。辛伐他汀(河南天方藥業(yè)有限公司,批號(hào):160409174)。高脂飼料(含1.25%膽固醇以及20%豬油,南京市青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng))。

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)生化試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所,批號(hào):20210401、20210401、20210331、20210331);油紅O粉末(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):20210426);5×All-In-One逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix-Low ROX試劑盒(上海愛必夢(mèng)生物科技有限公司,批號(hào):Q20C22A、1051855127001);Anti-Dnmt1抗體(英國(guó)Abcam公司,批號(hào):GR193233-1);Dnmt3b(E4I4O)Rabbit mAb(Mouse Specific)、Dnmt3a (D23G1) Rabbit mAb(美國(guó)CST公司,批號(hào):1、5);Goat anti-rabbit IgG(H+L)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,批號(hào):20000199);Mouse IL-2 ELISA檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物,批號(hào):A20220755)、Mouse IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物,批號(hào):A20630415)、Mouse TGF-β1 ELISA檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物,批號(hào):A98130432)。

1.3 主要儀器

5417R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);EPS300雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀(上海天能公司);GelDoc XR+全自動(dòng)凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Heraeus Multifuge X1R離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司);Infinite M200PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司);JB-L6生物組織包埋機(jī)(武漢俊杰公司);KZ-Ⅱ高速組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司);Micro17R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司);Pannoramic MIDI組織切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司);PowerPac HV電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);RM2235病理切片機(jī)(上海徠卡公司);SynergyH1全功能微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)Biotek公司);Veriti 96-Well Thermal Cycler梯度逆轉(zhuǎn)錄PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

ApoE-/-小鼠分為對(duì)照組、模型組、辛伐他汀組、養(yǎng)陰活血方組、養(yǎng)陰組、清熱組及活血組,每組10只。正常組飼喂普通飼料,其余各組給予高脂飼料(含1.25%膽固醇,20%豬油)喂養(yǎng),持續(xù)20周。分別于第10、12、14、16、18周,對(duì)照組以外的各組動(dòng)物腹腔注射10 μg LPS,對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積無菌PBS。灌胃給藥與高脂飲食同期進(jìn)行,均采用臨床等效量給藥(辛伐他汀,3.3 mg·kg-1;養(yǎng)陰活血方,18 g·kg-1;養(yǎng)陰,5 g·kg-1;清熱,10 g·kg-1;活血,3.3 g·kg-1),每日灌胃給藥1次。

2.2 血脂檢測(cè)

TC、TG、LDL-C和HDL-C生化試劑盒檢測(cè)血脂,酶標(biāo)儀讀取OD值,再按公式計(jì)算得到血清中血脂含量。非高密度脂蛋白膽固醇(Non-HDL-C)的含量以TC扣除HDL-C計(jì)算得到。

2.3 qPCR檢測(cè)小鼠脾臟和主動(dòng)脈Tets和Dnmts mRNA表達(dá)

低溫條件下稱取約50 mg組織(脾臟/主動(dòng)脈),剪碎后放入EP管,每份組織中加入1 mL TRIzol提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄成模板DNA前,RNA通過微量紫外分光光度計(jì)將脾臟/主動(dòng)脈RNA定量為10 μg·mL-1后,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA。qPCR操作及反應(yīng)條件按試劑盒說明書進(jìn)行,引物委托上海生工合成(見表1)。數(shù)據(jù)按2-ΔΔCt法(內(nèi)參β-actin)分析。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used in qPCR

2.4 Western blot檢測(cè)小鼠脾臟/主動(dòng)脈蛋白表達(dá)

低溫條件下稱取約50 mg組織(脾臟/主動(dòng)脈),剪碎后放入EP管,管內(nèi)加入2枚鋼珠。采用蛋白裂解液提取組織中Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b。通過BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度后,加入上樣緩沖液在100 ℃金屬浴中變性10 min。樣品以30 μg的上樣量進(jìn)行電泳(先60 V,30 min;后90 V,60 min)。再轉(zhuǎn)膜,封閉,加入兔抗鼠抗體Dnmt1(1∶1 000)、Dnmt3a(1∶1 000)、Dnmt3b(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000),4 ℃過夜,次日洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)搖床孵育2 h,洗膜后,全自動(dòng)凝膠成像儀獲取條帶圖像,Image Lab 4.0.1軟件分析。

2.5 主動(dòng)脈斑塊面積測(cè)定及冠脈病理分析

將主動(dòng)脈從主動(dòng)脈弓至左右髂總動(dòng)脈分支分離,多余組織在解剖鏡下進(jìn)一步精密剖離,并在4%多聚甲醛中固定12 h。生理鹽水洗滌后滴加油紅O染色。Image J軟件測(cè)量主動(dòng)脈斑塊面積,計(jì)算斑塊與血管總面積的比值。心臟取下后于4%多聚甲醛中固定,進(jìn)行HE冠脈染色。滴加中性樹膠,封片后制成玻片標(biāo)本,顯微鏡下拍攝(放大倍數(shù):×400,標(biāo)尺:50 μm)并分析病變程度。

2.6 ELISA法檢測(cè)小鼠血清細(xì)胞因子表達(dá)

眼眶后靜脈叢采血收集小鼠外周血,靜置2 h,室溫下3 000 r·min-1離心10 min獲取血清,-80 ℃超低溫冰箱分裝保存?zhèn)溆?。使用提供的IL-2、IL-6、TGF-β1 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè),ELISA酶標(biāo)板每孔血清上樣量為20 μL,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行,加入顯色劑后,使用酶標(biāo)儀讀取規(guī)定波長(zhǎng)下的OD值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線以及說明書中的公式計(jì)算各細(xì)胞因子含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.995。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)ApoE-/-小鼠AS斑塊的影響

油紅O染色結(jié)果如圖1A所示。與對(duì)照組相比,模型組小鼠主動(dòng)脈斑塊顯著增多,且主動(dòng)脈弓處尤為明顯(P<0.01)。與模型組相比,給藥各組斑塊面積均有所減少,其中養(yǎng)陰活血方組與清熱組抑制斑塊面積的效果更佳(P<0.01)。冠脈HE染色顯示(圖1B),與對(duì)照組相比,模型組小鼠出現(xiàn)明顯管腔狹窄,管腔面積變小(P<0.05)。與模型組比較,辛伐他汀組、養(yǎng)陰活血方組及清熱組管腔狹窄情況和管腔面積有明顯改善(P<0.01)。以上結(jié)果表明,20周高脂飲食聯(lián)合5次LPS注射造成了ApoE-/-小鼠嚴(yán)重的AS病變,表現(xiàn)為主動(dòng)脈斑塊增加與冠脈血管腔狹窄。養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)主動(dòng)脈斑塊形成和冠脈壁管腔變窄均有抑制作用。

注:A.油紅O染色;B.HE染色;a.對(duì)照組;b.模型組;c.辛伐他汀組;d.養(yǎng)陰活血方組;e.養(yǎng)陰組;f.清熱組;g.活血組;與對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,圖1 各組主動(dòng)脈斑塊油紅O染色(n=3)和冠脈HE染色(n=5)Fig.1 Aortic plaque oil red O staining (n=3) and coronary artery HE staining(n=5)

3.2 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)ApoE-/-小鼠體質(zhì)量和血脂的影響

各組小鼠體質(zhì)量在20周內(nèi)整體穩(wěn)步上升。但在第12周,除對(duì)照組外,其他組體質(zhì)量有所下降,第14周又恢復(fù)正常水平(圖2A)。

注:與對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,圖2 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)ApoE-/-小鼠體質(zhì)量及血脂水平的影響Fig.2 Effects of Yangyin Huoxue Prescription and its efficacy units on weight and serum lipid levels of ApoE-/- mice

實(shí)驗(yàn)初期(第0周)各組小鼠血脂水平基本保持一致(圖2B)。在實(shí)驗(yàn)中期(第10周,圖2C),與對(duì)照組相比,模型組小鼠TC、non-HDL-C、LDL-C水平顯著升高(P<0.01,P<0.001),而TG與HDL-C無變化。與模型組比較,各給藥組non-HDL-C水平均明顯升高(P<0.05)。在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?第20周,圖2D),與對(duì)照組相比,模型組小鼠TC、TG、non-HDL-C和LDL-C水平顯著升高(P<0.05,P<0.01),HDL-C水平顯著降低(P<0.001)。與模型組比較,養(yǎng)陰活血方組TG、LDL-C水平顯著降低(P<0.01),而HDL-C水平顯著升高(P<0.05),TC與non-HDL-C無變化;養(yǎng)陰組TC、non-HDL-C、LDL-C水平顯著降低(P<0.05,P<0.01),而HDL-C升高(P<0.05);清熱組TC(P<0.01)和TG(P<0.001)水平顯著降低;活血組LDL-C、non-HDL-C、TG水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)。以上結(jié)果表明,養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)高脂飲食聯(lián)合LPS刺激引起的AS ApoE-/-小鼠的血脂水平具有不同程度的調(diào)節(jié)作用,但對(duì)體質(zhì)量無影響。

3.3 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)ApoE-/-小鼠DNA甲基化相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

qPCR結(jié)果如圖3顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠脾臟及主動(dòng)脈Tets mRNA含量均沒有顯著變化。與模型組比較,各給藥組小鼠脾臟及主動(dòng)脈Tets mRNA水平均沒有顯著變化。以上結(jié)果表明,高脂飲食聯(lián)合LPS刺激不影響Tets mRNA的表達(dá),養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)Tets mRNA的表達(dá)也無顯著影響。

注:與對(duì)照組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,圖3 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)ApoE-/-小鼠脾臟和主動(dòng)脈Tets、Dnmts mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Yangyin Huoxue Prescription and its efficacy units on mRNA expression of Tets and Dnmts in spleen and aorta of ApoE-/-mice

與對(duì)照組比較,模型組小鼠脾臟Dnmt3b mRNA含量增加(P<0.05),主動(dòng)脈Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA含量顯著增加(P<0.05,P<0.001)。與模型組比較,養(yǎng)陰活血方組降低主動(dòng)脈Dnmt1(P<0.001)和Dnmt3b(P<0.05)的mRNA含量;養(yǎng)陰組降低脾臟和主動(dòng)脈Dnmt3b mRNA表達(dá)量(P<0.05,P<0.001);清熱組降低主動(dòng)脈Dnmt1和Dnmt3b mRNA含量(P<0.05);活血組對(duì)脾臟和主動(dòng)脈Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA含量均無顯著影響。以上結(jié)果表明,高脂復(fù)合LPS形成的感染型AS小鼠脾臟Dnmt3b及主動(dòng)脈Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表達(dá)均增加,而養(yǎng)陰活血方及其功效單元降低主動(dòng)脈Dnmt1和Dnmt3b mRNA表達(dá)的作用比較突出。

3.4 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)ApoE-/-小鼠Dnmts相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠脾臟和主動(dòng)脈Dnmt1(P<0.05)、Dnmt3a(P<0.05,P<0.01)、Dnmt3b(P<0.01)蛋白的表達(dá)增加(圖4)。與模型組比較,養(yǎng)陰活血方降低脾臟Dnmt1和Dnmt3a的表達(dá)(P<0.05),降低主動(dòng)脈Dnmt1和Dnmt3b的表達(dá)(P<0.05);養(yǎng)陰組降低主動(dòng)脈Dnmt3a的表達(dá)(P<0.05);清熱組降低脾臟Dnmt1的表達(dá)(P<0.05),降低主動(dòng)脈Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)(P<0.05);活血組降低主動(dòng)脈Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)(P<0.05)。以上結(jié)果表明,高脂復(fù)合LPS形成的感染型AS小鼠脾臟和主動(dòng)脈Dnmts蛋白表達(dá)均異常升高,而養(yǎng)陰活血方及其功效單元可以不同程度地降低脾臟和主動(dòng)脈Dnmts蛋白的表達(dá),其中,清熱組對(duì)主動(dòng)脈Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b蛋白表達(dá)的調(diào)控作用最為明顯。

注:與對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,

3.5 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)ApoE-/-小鼠細(xì)胞因子的影響

ELISA結(jié)果顯示(圖5),與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清IL-6和IL-2水平增加(P<0.05,P<0.01),TGF-β1水平明顯下降(P<0.05)。與模型組比較,養(yǎng)陰活血方組降低IL-6水平(P<0.05),升高IL-2、TGF-β1水平(P<0.05);養(yǎng)陰組升高TGF-β1水平(P<0.05);清熱組降低IL-6水平(P<0.05),增加TGF-β1水平(P<0.05);活血組降低IL-6水平(P<0.05),升高IL-2水平(P<0.05)。以上結(jié)果表明,高脂復(fù)合LPS形成的感染型AS小鼠血清中促炎因子IL-6和調(diào)節(jié)性因子IL-2水平升高,抑炎因子TGF-β1水平下降,而養(yǎng)陰活血方及其功效單元可以不同程度地降低促炎因子表達(dá)并提高抑炎因子表達(dá)。

注:與對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,圖5 養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)ApoE-/-小鼠細(xì)胞因子的影響Fig.5 Effects of Yangyin Huoxue Prescription and its efficacy units on cytokines of ApoE-/- mice

4 討論

AS是一種復(fù)雜的慢性疾病,脂質(zhì)紊亂伴隨慢性炎癥是其主要特征,增加了AS發(fā)生的概率[9]。除高水平脂質(zhì)引起低強(qiáng)度全身性炎癥反應(yīng)外,細(xì)菌感染亦是AS形成的原因之一[10]。當(dāng)機(jī)體感染革蘭氏陰性菌時(shí),其細(xì)胞壁外膜的構(gòu)成成分之一脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)可以通過Toll樣受體(Toll-Like receptor,TLR)介導(dǎo)的信號(hào)誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化,促進(jìn)炎癥因子分泌,引起全身炎癥[11]。拮抗TLR4可以干擾LPS的促炎作用,從而延緩AS的發(fā)展[12]。本研究利用對(duì)ApoE-/-小鼠進(jìn)行高脂飼養(yǎng)并腹腔注射LPS的方法,模擬高脂伴隨感染的AS炎癥特征,并在此基礎(chǔ)上開展復(fù)方作用研究。

養(yǎng)陰活血方以制何首烏、黃精為君藥,滋陰,化濁降脂;以姜黃、紅花為臣藥,通利血脈,化瘀行氣;漏蘆與虎杖共為佐使,清熱解毒,活血化瘀。養(yǎng)陰活血方可分為3個(gè)功效單元,為養(yǎng)陰單元(制何首烏、酒黃精)、清熱單元(虎杖、漏蘆)、活血單元(紅花、姜黃),3個(gè)功效單元在AS治療中各有側(cè)重。脂質(zhì)代謝紊亂和慢性炎癥是AS形成的關(guān)鍵病機(jī)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)陰活血方在長(zhǎng)期(第20周)使用時(shí)調(diào)控血脂的作用較短期(第10周)更為明顯。養(yǎng)陰組降低TC(P<0.05)和LDL-C(P<0.01)、增加HDL-C水平(P<0.05)的作用比較突出,清熱組降低TC、TG(P<0.01,P<0.001)作用也較為突出,活血組降低TG、LDL-C(P<0.05,P<0.01)的作用比較明顯,養(yǎng)陰活血方組的調(diào)脂作用主要表現(xiàn)在降低TG(P<0.01)和LDL-C(P<0.01)、增加HDL(P<0.05)。高血脂是促進(jìn)AS斑塊形成的重要因素[14]。因此,降低血脂對(duì)減少AS斑塊的形成是有利的。養(yǎng)陰活血方及其功效單元都能降低冠脈厚度,改善冠脈血管狹窄和面積并且減少主動(dòng)脈斑塊面積,其中養(yǎng)陰活血方組及清熱組尤為明顯(P<0.01)?？梢?養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)AS斑塊形成的改善作用與其長(zhǎng)期應(yīng)用有較好的調(diào)脂作用有密切關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn),AS斑塊中多種基因存在甲基化異常的現(xiàn)象,表明甲基化參與了AS疾病進(jìn)展[15]。甲基化通過與基因組中CpG二核苷酸胞嘧啶5′碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)而發(fā)生可逆DNA甲基化修飾,通常能使基因表達(dá)沉默[2]。DNA高甲基化通常會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期且穩(wěn)定的基因抑制,相反DNA低甲基化會(huì)促進(jìn)基因表達(dá)[16]。Tets和Dnmts是調(diào)控基因甲基化的關(guān)鍵酶。Tets家族(包括Tet1、Tet2、Tet3)介導(dǎo)DNA去甲基化,而Dnmts家族(包括Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b)介導(dǎo)DNA甲基化[15]。Tet2過表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)Beclin1依賴性的自噬來減緩ApoE-/-小鼠AS發(fā)展,而Tet2缺失則加速AS發(fā)展[17]。造血細(xì)胞Tet2可以通過抑制促炎細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)以及炎癥小體的激活來預(yù)防AS[18]。AS的炎癥狀態(tài)與DNA的高甲基化有關(guān)[19]。Dnmts介導(dǎo)的甲基化可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)引發(fā)炎癥,炎癥也可以改變DNA甲基化[20]。Dnmt1和Dnmt3a介導(dǎo)了AS過程中DNA的甲基化[21]。Dnmt1是細(xì)胞內(nèi)的主要Dnmts,負(fù)責(zé)維持甲基化水平。Dnmt1可以促進(jìn)ABCA1甲基化,從而影響巨噬細(xì)胞膽固醇外流和泡沫細(xì)胞的形成[22]。因此,DNA甲基化酶參與了AS斑塊部位細(xì)胞脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。許多與AS發(fā)病相關(guān)的基因都受DNA甲基化的調(diào)節(jié)[16]。有研究表明,人頸AS斑塊中Dnmt1的表達(dá)減少,Dnmt3a檢測(cè)不到,Dnmt3b沒有改變,Tet1增加[23]。給予高脂飲食的ApoE-/-小鼠AS斑塊中Tet2表達(dá)水平下調(diào),而過表達(dá)Tet2有效逆轉(zhuǎn)AS病變[24]。在感染型炎癥性疾病發(fā)展過程中也存在DNA甲基化修飾的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)[25]在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥炎癥小鼠的肺組織中,Dnmt1上調(diào),而下調(diào)Dnmt1則可以抑制LPS對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的損傷作用。本研究發(fā)現(xiàn),在高脂飲食聯(lián)合LPS刺激引起的AS ApoE-/-小鼠脾臟及主動(dòng)脈中,Tets mRNA的表達(dá)未發(fā)生顯著變化,但是脾臟中Dnmt1 mRNA(P<0.05)和主動(dòng)脈中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA(P<0.05,P<0.001)的表達(dá)增加,脾臟和主動(dòng)脈中Dnmt1(P<0.05)、Dnmt3a(P<0.05,P<0.01)、Dnmt3b(P<0.01)蛋白的表達(dá)都增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè),高脂飲食聯(lián)合LPS注射造成ApoE-/-小鼠體內(nèi)呈現(xiàn)炎癥狀態(tài),進(jìn)而出現(xiàn)高DNA甲基化水平,促使AS迅速發(fā)展。干預(yù)基因的甲基化可以對(duì)AS的發(fā)展產(chǎn)生影響[26]。本研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)陰活血方及其功效單元對(duì)AS ApoE-/-小鼠脾臟及主動(dòng)脈中Tets mRNA水平無顯著影響。然而,在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平對(duì)主動(dòng)脈Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的表達(dá)具有不同程度的下調(diào)作用。養(yǎng)陰活血方可以減輕AS炎癥水平[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,養(yǎng)陰活血方及清熱、活血單元降低促炎因子IL-6表達(dá)(P<0.05),而養(yǎng)陰活血方及養(yǎng)陰、清熱單元提高抑炎因子TGF-β1表達(dá)(P<0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示養(yǎng)陰活血方及其功效單元可能下調(diào)了主動(dòng)脈斑塊的甲基化水平,并進(jìn)一步減輕了炎癥水平,這可能是養(yǎng)陰活血方減少AS斑塊形成的內(nèi)在原因。

綜上所述,養(yǎng)陰活血方能夠顯著調(diào)節(jié)AS小鼠脂質(zhì)水平,下調(diào)DNA甲基化水平,有效減少炎癥因子的分泌,因而減少AS斑塊面積。養(yǎng)陰組調(diào)節(jié)AS的效果主要來源于對(duì)血脂和抗炎因子的調(diào)節(jié),清熱組和活血組調(diào)節(jié)AS的效果則體現(xiàn)在對(duì)血脂、甲基化酶Dnmts、促炎和抗炎因子的調(diào)節(jié)方面。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)陰活血方中清熱組和活血組可以下調(diào)Dnmts的表達(dá),這可能與清熱單元中虎杖主要成分白藜蘆醇和活血單元中姜黃素的Dnmts抑制作用有密切關(guān)系[27-28]。養(yǎng)陰活血方全方對(duì)于AS的改善作用體現(xiàn)在將各功效單元的作用進(jìn)行整合,對(duì)血脂、甲基化水平和炎癥水平進(jìn)行綜合調(diào)節(jié),揭示了中藥復(fù)方在治療AS這類復(fù)雜疾病時(shí)的整體作用的優(yōu)勢(shì),但其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的闡明。