詹志敏，付萬(wàn)進(jìn)，胡偉

作者單位：1合肥新橋國(guó)際機(jī)場(chǎng)有限公司急救站，安徽 合肥 230086；

2安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥物臨床試驗(yàn)研究中心，安徽 合肥 230022

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活質(zhì)量的提高，T2DM 發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前我國(guó)已成為全球糖尿病病人最多的國(guó)家。T2DM 為內(nèi)分泌科常見(jiàn)疾病，以多飲、多食、多尿、消瘦和乏力為主要臨床癥狀，可導(dǎo)致糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)性病變、心腦血管疾病等并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類健康，給社會(huì)、家庭帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)［1-2］。

中醫(yī)認(rèn)為T(mén)2DM 屬于為“消渴癥”范疇，其病機(jī)主要在于機(jī)體的陰虛燥熱，以陰虛為本，燥熱為標(biāo)，中藥治療時(shí)基本原則以清熱潤(rùn)燥、養(yǎng)陰生津?yàn)橹鳎?-4］。中藥知母為百合科植物知母的干燥后的根、莖，性苦、甘、寒，具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥之功，適用于高熱煩渴，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘之癥，能有效降低T2DM 病人血糖水平，改善臨床癥狀，療效肯定［5-7］。但中藥通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用治療疾病，使用現(xiàn)代藥理學(xué)研究方法難以系統(tǒng)全面解析中藥治療疾病的作用機(jī)制［8］，目前知母治療T2DM 的具體作用機(jī)制尚未明確，限制其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是由藥理學(xué)、生物信息學(xué)及計(jì)算機(jī)學(xué)的融合而發(fā)展起來(lái)的一門(mén)學(xué)科，主要通過(guò)大數(shù)據(jù)挖掘中藥化學(xué)成分用于構(gòu)建中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)；使用機(jī)器學(xué)習(xí)方法預(yù)測(cè)化合物和靶點(diǎn)之間作用關(guān)系；通過(guò)疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)的挖掘方法獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)；將藥物化學(xué)成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)獲得藥物治療疾病靶點(diǎn)；將上述信息抽象為網(wǎng)絡(luò)關(guān)系模型后可以解釋中藥治療疾病作用機(jī)制［9］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理在研究多成分和多靶點(diǎn)方面的優(yōu)勢(shì)，研究知母治療T2DM 的主要機(jī)制，并為知母在臨床應(yīng)用提供證據(jù)，其研究方法流程見(jiàn)圖1。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究知母治療T2DM作用機(jī)制流程圖

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

1.1.1 知母化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)建立通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP）挖掘中藥知母中每個(gè)化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)的化學(xué)性質(zhì)參數(shù)，將得到的數(shù)據(jù)用于組建知母的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.1.2 ADME 模型篩選知母活性分子體外ADME模型（吸收，分布，代謝和排泄）主要利用體外實(shí)驗(yàn)與數(shù)學(xué)建模方法研究藥物在體內(nèi)吸收代謝情況，該方法較以往基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法研究藥物體內(nèi)吸收過(guò)程效率更高、成本更低，可用于大規(guī)模預(yù)測(cè)化學(xué)分子的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)［10］。本次研究利用體外AD?ME 模型中的口服生物利用度（oralbioavailability，OB），半衰期（half-life，HL）和類藥性（drug-like，DL）三個(gè)指標(biāo)篩選知母中的潛在活性分子。OB 指藥物經(jīng)口服吸收后進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)的能力，化合物OB指標(biāo)值的大小與合物在體內(nèi)吸收率呈正相關(guān)，本研究篩選了OB 指標(biāo)值大于0.3 的化合物作為潛在的活性分子［11］。通過(guò)計(jì)算化學(xué)分子與已被批準(zhǔn)上市藥物結(jié)構(gòu)之間的相似性來(lái)計(jì)算化學(xué)分子的類藥性，DL 指標(biāo)值大小與化合物成藥可能性呈正比。DL 指標(biāo)在藥物的前期開(kāi)發(fā)中促進(jìn)高活性化合物篩中率，提高藥物的開(kāi)效率，本研究通過(guò)篩選化學(xué)分子的DL值大于0.18 作為潛在的活性分子［12］。半衰期指標(biāo)化合物的血液濃度降低一半所需的時(shí)間，本研究篩選化合物半衰期指標(biāo)值大于3 h 作為潛在的活性成分。

1.1.3 化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)將ADME 模型篩選獲的活性分子在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘其作用的靶點(diǎn)。該數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)隨機(jī)森林和支持向量機(jī)（SVM）機(jī)器學(xué)習(xí)方法建模預(yù)測(cè)化合物作用靶點(diǎn)模型。隨機(jī)森林和 SVM 模型性能對(duì)于化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)具有較高的可靠性和魯棒性，模型的平均準(zhǔn)確率82.83%、召回率 81.33%、查準(zhǔn)率 93.62%［13］。

1.1.4 疾病靶點(diǎn)挖掘在Uniprot、遺傳關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)（GAD）和人類孟德?tīng)栠z傳疾病數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）3 個(gè)人類疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)上使用“Diabetes mellitus type 2”和“Type 2 diabetes mellitus”2 個(gè)關(guān)鍵詞、物種選擇上使用“homo species”方法來(lái)挖掘與T2DM 相關(guān)的靶點(diǎn)，將獲得靶點(diǎn)使用Venny 2.1系統(tǒng)取交集獲得與T2DM相關(guān)的靶點(diǎn)集［14］。

1.1.5 T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）數(shù)據(jù)挖掘使用bisogenet 3.0 插件挖掘T2DM 中相關(guān)靶點(diǎn)蛋白之間相互作用關(guān)系，bisogenet 3.0插件通過(guò)整合6 個(gè)生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)間的作用關(guān)系，可較全面獲得的疾病靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)［15］。本研究將bisogenet 3.0插件獲得蛋白-蛋白作用關(guān)系使用Cytoscape 軟件構(gòu)建T2DM 靶點(diǎn)的蛋白-蛋白（PPI）相互作用網(wǎng)絡(luò)，為更加簡(jiǎn)潔展示PPI 作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建時(shí)刪除無(wú)相互作用節(jié)點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)自身相互作用的邊和度值小于3的節(jié)點(diǎn)［16-17］。

1.2 富集分析將C-D網(wǎng)絡(luò)中的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入DA?VID 6.8 系統(tǒng)中，使用Fisher 精確檢驗(yàn)方法進(jìn)行KEGG 通路富集分析，排除與T2DM 疾病不相關(guān)通路，篩選出P<0.01 的通路進(jìn)行分析，并構(gòu)建C-D-M網(wǎng)絡(luò)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建本研究使用Cytoscape 3.6.0 軟構(gòu)建了以下4 種網(wǎng)絡(luò)：T2DM 疾病靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)、藥物分子-靶點(diǎn)（C-T）網(wǎng)絡(luò)、藥物分子-疾病靶點(diǎn)（C-D）網(wǎng)絡(luò)和藥物分子-疾病靶點(diǎn)-通路（CD-M）網(wǎng)絡(luò)。

1.4 分子對(duì)接在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載格式為“.mol2”化合物對(duì)應(yīng)分子結(jié)構(gòu)，使用Discovery Studio 軟件對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，使用AutoDock軟件中prepare_ligand4腳本將“.mol2”格式分子轉(zhuǎn)化為“.pbdqt”格式文件。

在Uniport 中檢索GSK-3β 蛋白結(jié)構(gòu)，并下載“PDB”格式的蛋白分子，使用Discovery Studio 軟件去除蛋白中的水分子和配體化合物，再使用Discov?ery Studio 軟件對(duì)蛋白分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，使用AutoDock 軟件中prepare_receptor4 腳本將“PDB”蛋白結(jié)構(gòu)加氫并轉(zhuǎn)化為“.pdbqt”格式文件，最后使用AutoDock 軟件對(duì)蛋白對(duì)接盒子的空間坐標(biāo)進(jìn)行確定。

使用AutoDock Vina 軟件將處理好的小分子與蛋白文件進(jìn)行批量分子對(duì)接。每個(gè)小分子化合物與蛋白對(duì)接后產(chǎn)生20個(gè)構(gòu)象，本次研究選擇能量最低的構(gòu)象進(jìn)行展示，其中蛋白與分子相互作用的三維結(jié)構(gòu)使用Pymol 軟件制作，二維結(jié)構(gòu)圖使用Dis?covery Studio軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 藥物化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

2.1.1 知母成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建知母通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘獲得81 個(gè)化學(xué)分子，將81 個(gè)分子的化學(xué)性質(zhì)參數(shù)信息用于構(gòu)建知母成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。知母化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中的化學(xué)分子根據(jù)成分性質(zhì)可分為雙苯吡酮類、皂苷類、甾醇類、木質(zhì)素類、生物堿、多糖類化合物。

2.1.2 ADME 篩選活性分子使用ADME 模型指標(biāo)篩選活性分子，其中OB 指標(biāo)篩選出28種化學(xué)分子，半衰期指標(biāo)篩選出27 個(gè)化合物，DL 指標(biāo)值篩選出48種化學(xué)分子，篩選結(jié)果見(jiàn)圖2，對(duì)ADME 模型各個(gè)指標(biāo)篩選活性分子使用Venny 2.1 系統(tǒng)取交集得到15個(gè)活性分子，知母活性化合物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

圖2 ADME活性分子篩選

表1 知母活性成分篩選結(jié)果

2.1.3 知母藥物化合物和靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)知母活性分子作用靶點(diǎn)（C-T）網(wǎng)絡(luò)一共包括129 個(gè)節(jié)點(diǎn)和250個(gè)邊，見(jiàn)圖3。該網(wǎng)絡(luò)由15 個(gè)活性分子節(jié)點(diǎn)和114個(gè)蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)組成，其中活性分子節(jié)點(diǎn)與靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)間有250 個(gè)作用關(guān)系。不同節(jié)點(diǎn)在C-T 網(wǎng)絡(luò)的重要程度并不相同，不同的化學(xué)分子作用靶點(diǎn)數(shù)量并不均衡，如山奈酚分子作用72 個(gè)潛在靶點(diǎn)，分子豆甾醇作用43 個(gè)靶點(diǎn)，而淫羊藿苷Ⅰ、菊花黃素和知母皂苷E_qt 其僅影響1 個(gè)蛋白靶點(diǎn)。同樣的，一些蛋白靶點(diǎn)可被多種化合物協(xié)同作用，一些靶點(diǎn)僅受很少化合物的作用。例如，ERS1 靶標(biāo)被12 種化合物調(diào)節(jié)，知母中11種化學(xué)分子調(diào)節(jié)AR蛋白靶點(diǎn)，但是一些靶點(diǎn)如TP3、TNF 靶點(diǎn)僅受一個(gè)分子的調(diào)節(jié)。知母C-T網(wǎng)絡(luò)不同節(jié)點(diǎn)重要程度不相同說(shuō)明知母在治療T2DM可能由關(guān)鍵化合物起重要作用。

圖3 知母活性分子作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)：綠色圓形表示靶點(diǎn)，黃色三角形表示知母活性分子

2.2 T2DM 相關(guān)的靶點(diǎn)挖掘本研究從Uniprot 中獲得288 個(gè)、從OMIM 獲得183 個(gè)、從GAD 獲得356個(gè)與T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，將上述結(jié)果取交集獲得730個(gè)T2DM相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 T2DM相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白

2.3 T2DM 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)將730個(gè)T2DM 相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白置入bisogenet 3.0 插件中獲得蛋白之間相互作用數(shù)據(jù)后，刪除網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)有相互作用節(jié)點(diǎn)和自相作用節(jié)點(diǎn)的邊，再使用Cytoscape軟件重新構(gòu)建T2DM靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，并刪除度值小于3 的節(jié)點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖5，該網(wǎng)絡(luò)由230 個(gè)節(jié)點(diǎn)和777 作用關(guān)系構(gòu)成。PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)“度值”越大說(shuō)明節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中與其他節(jié)點(diǎn)連接程度越高，在T2DM 的PPI 網(wǎng)絡(luò)中NTRK1、TP53、ESR1、ATK1、STAT3、SMAD3靶點(diǎn)的“度值”較高，對(duì)應(yīng)的度分別為78、44、32、30、26、24，說(shuō)明這些靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要程度越高，這些靶點(diǎn)在T2DM 的發(fā)展中可能起重要作用。

圖5 T2DM相關(guān)的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 知母-T2DM 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 軟件中的Merge 工具對(duì)知母C-T 網(wǎng)絡(luò)、T2DM 的PPI 網(wǎng)絡(luò)取交集，獲得知母分子-T2DM 靶點(diǎn)（C-D）網(wǎng)絡(luò)。知母-T2DM 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中分子作用靶點(diǎn)詳細(xì)信息見(jiàn)表2。該網(wǎng)絡(luò)由33 個(gè)節(jié)點(diǎn)和76 個(gè)邊構(gòu)成，其中含有13 個(gè)知母活性分子，20個(gè)T2DM靶點(diǎn)蛋白，見(jiàn)圖6。

圖6 知母活性分子-T2DM靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 知母-T2DM靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中分子作用靶點(diǎn)詳細(xì)信息

2.5 知母活性分子作用T2DM 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)為研究知母治療T2DM 主要作用通路，本研究將知母活C-D網(wǎng)絡(luò)中的T2DM 靶點(diǎn)蛋白置入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行KEGG 富集分析，將富集結(jié)果中特殊疾病信號(hào)通路刪除，保留P值最小10 個(gè)通路，再利用Cyto?scape 軟件將上述結(jié)果構(gòu)建知母活性分子-T2DM 靶點(diǎn)-通路（C-D-M）網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。C-D-M 網(wǎng)絡(luò)由43個(gè)節(jié)點(diǎn)和133個(gè)邊組成，該網(wǎng)絡(luò)包含13個(gè)知母中的化合物和20個(gè)T2DM靶點(diǎn)和10個(gè)通路。

圖7 知母活性分子-T2DM靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 知母活性分子-T2DM靶點(diǎn)-通路氣泡圖

從C-D-M 網(wǎng)絡(luò)可知母中活性分子作用的8 個(gè)蛋白靶點(diǎn)富集到胰島素抵抗通路，7 個(gè)蛋白靶點(diǎn)富集到PI3K-Akt 信號(hào)通路，6 個(gè)蛋白靶點(diǎn)富集到流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病性心肌病和胰島素信號(hào)通路，5 個(gè)蛋白靶點(diǎn)富集到AGE-RAGE 信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、HIF-1 信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路和甲狀腺激素信號(hào)通路，4個(gè)蛋白靶點(diǎn)富集到2型糖尿病通路上，詳細(xì)信息見(jiàn)表3。

表3 知母治療T2DM富集通路信息

2.6 分子對(duì)接結(jié)果使用AutoDock Vina 分子對(duì)接結(jié)果提示MOL000631、MOL000422、MOL004373、MOL004497 與糖原合成酶激酶（GSK-3β）有明顯相互 作 用 關(guān) 系 ， MOL000631、 MOL000422、MOL004373、MOL004497 與GSK-3β 對(duì)接后最穩(wěn)定構(gòu)象的能量分別為?8.3、?7.3、?8.0 和?7.6 kcal/mol，結(jié)果見(jiàn)表4。

由分子對(duì)接的三維結(jié)構(gòu)圖可知，對(duì)接后MOL000631、MOL000422、MOL004373、MOL004497分子最穩(wěn)定的構(gòu)象在GSK-3β 表面空隙或表面溝壑空隙中。由分子對(duì)接二維結(jié)構(gòu)圖可知，MOL000631分子可以與GSK-3β 第338 位絲氨酸殘基產(chǎn)生一個(gè)氫鍵；MOL000422分子可以與GSK-3β第336位丙氨酸殘基產(chǎn)生一個(gè)氫鍵；MOL004373分子可以與GSK-3β 第341 位天冬氨酸殘基產(chǎn)生一個(gè)氫鍵相互作用；MOL004497分子可以與GSK-3β第89位谷氨酰胺殘基、第94 位的賴氨酸殘基、第95 位的天冬酰胺殘基和第96位精氨酸殘基分別產(chǎn)生一個(gè)氫鍵相互作用，見(jiàn)圖9。

圖9 知母活性分子與糖原合成酶激酶對(duì)接后對(duì)接結(jié)構(gòu)圖

3 討論

糖尿病以高血糖為特征的代謝性疾病，長(zhǎng)期高血糖可導(dǎo)致機(jī)體的心血管、消化、神經(jīng)等組織出現(xiàn)并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制與胰島素通路、免疫反應(yīng)、抗炎反應(yīng)氧化應(yīng)激等反應(yīng)有關(guān)［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)知母通過(guò)多成分、多靶、多通路協(xié)同效應(yīng)用于T2DM治療。

在C-D 網(wǎng)絡(luò)中有13 個(gè)知母分子調(diào)控20 個(gè)T2DM 疾病相關(guān)靶點(diǎn)來(lái)用于糖尿病的治療。其中糖原合成酶激酶（GSK-3β）在C-D網(wǎng)絡(luò)的可被4個(gè)知母活性分子調(diào)節(jié)。GSK-3β 酶在肝臟的葡萄糖代謝中起著重要作用，GSK-3β可通過(guò)磷酸化糖原合成酶可抑制其酶活性，抑制肝臟糖原的合成，使機(jī)體的血糖升高，在糖尿病病人體內(nèi)GSK-3β 表達(dá)量較正常人高30%、其酶的活性高一倍［20］，分子對(duì)接提示4 個(gè)知母活性分子可與GSK-3β 產(chǎn)生氫鍵相互作用。糖尿病血管病變是糖尿病導(dǎo)致后遺癥產(chǎn)生的主要原因，血管病變與機(jī)體炎癥的氧化應(yīng)激有著密切關(guān)系，體內(nèi)一氧化氮（NO）可以明顯降低體內(nèi)的炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（NOS3）作用底物是精氨酸，可將精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸或者是N-羥基精氨酸，并進(jìn)一步代謝合成NO，NO促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)；NO 也可減緩胰島β 細(xì)胞損傷，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，加速細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的脂代謝增強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病病人體內(nèi)NO 含量較正常人組明顯降低［21-22］，本研究發(fā)現(xiàn)知母活性分子可以調(diào)節(jié)NOS3信號(hào)通路。

通過(guò)分析C-D-M 網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，知母可通過(guò)調(diào)節(jié)8個(gè)靶點(diǎn)調(diào)控胰島素抵抗通路，胰島素抵抗是指靶細(xì)胞對(duì)胰島素的代謝反應(yīng)降低、或在整個(gè)機(jī)體水平上、循環(huán)或注射胰島素對(duì)血糖的降低作用受損。機(jī)體主要在外周組織（肌肉和脂肪）和肝臟組織出現(xiàn)胰島素抵抗。體內(nèi)胰島素在外周組織可促進(jìn)葡萄糖吸收或儲(chǔ)存，在肝臟組織抑制肝臟的葡萄糖輸出從而達(dá)到降低血糖的水平，胰島素抵抗是導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)糖尿病主要原因［23］。

PI3K/AKT信號(hào)通路不但在細(xì)胞的分裂、分化和凋亡中起著重要的作用，也在糖類合成轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、蛋白質(zhì)合成以及脂肪代謝途徑起著重要作用［24］。知母活性分子通過(guò)調(diào)控7 個(gè)靶點(diǎn)作用于PI3K/AKT 信號(hào)通路。胰島素作用于細(xì)胞膜表面的胰島素受體后主要通PI3K/AKT 通路及MAPK 通路發(fā)揮功能、其中，PI3K/AKT 通路在控制體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)平衡和器官存活方面起著重要的作。胰島素在PI3K/AKT 通路中通過(guò)上調(diào)PI3K 和Akt 分子水平，啟動(dòng)PI3K-Akt 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，活化的下游分子增加細(xì)胞內(nèi)糖原的生成，抑制糖異生反應(yīng)，最終起著降低機(jī)體血糖水平［25］。

AMPK 信號(hào)通路是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路，在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)能量平衡方面起著重要作用［26］。知母活性分子通過(guò)調(diào)控5個(gè)靶點(diǎn)作用于AMPK 信號(hào)通路。AMPK 蛋白可通過(guò)調(diào)控下游多個(gè)效應(yīng)因子影響糖類代謝以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過(guò)程，保護(hù)胰島β細(xì)胞，抑制胰島素抵抗的發(fā)生，從而用于T2DM疾病的治療［27］。

HIF-1 信號(hào)主要參與細(xì)胞對(duì)氧含量的變化的反應(yīng)，尤其是對(duì)氧氣的減少或缺氧作出反應(yīng)，激活HIF-1 信號(hào)可促紅細(xì)胞生成、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和其他基因蛋白物質(zhì)增加氧的輸送或促進(jìn)缺氧能量代謝［28］。本研究發(fā)現(xiàn)知母活性分子調(diào)控5個(gè)蛋白靶點(diǎn)作用于HIF-1信號(hào)通路。長(zhǎng)期血糖升高導(dǎo)致糖化血紅蛋白在紅細(xì)胞中的上升、紅細(xì)胞攜氧量下降，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞處于缺氧環(huán)境，而低氧環(huán)境可激活HIF-1 信號(hào)促進(jìn)40 多種蛋白表達(dá)增加機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境適應(yīng)性。但長(zhǎng)期血糖水平升高會(huì)降低HIF-1α蛋白表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體缺氧對(duì)缺氧適應(yīng)性降低；嚴(yán)重持續(xù)缺氧可導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)水平下降，HIF-1α 表達(dá)水平下降是高血糖導(dǎo)致組織發(fā)生周圍神經(jīng)病變及糖尿病疾病進(jìn)展的重要因素［29］。

從C-D-M 網(wǎng)絡(luò)中通路節(jié)點(diǎn)發(fā)現(xiàn)知母也可通過(guò)流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病性心肌病和胰島素信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路及甲狀腺激素信號(hào)等通路上用于T2DM治療。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過(guò)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究知母治療T2DM 作用機(jī)制，對(duì)中藥藥理作用機(jī)制的探索提供了一定的參考價(jià)值，提示知母中的活性分子可通過(guò)調(diào)節(jié)調(diào)控胰島素通路、胰島素抵抗通路、PI3K-Akt 信號(hào)、調(diào)控NO 合成，調(diào)控缺氧信號(hào)通路、調(diào)控能量代謝等途徑用于T2DM 的治療，揭示了知母治療T2DM 的臨床治療潛力。但是，本研究主要利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)信息和算法對(duì)知母對(duì)T2DM 作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)研究，研究過(guò)程中尚未考慮到藥物質(zhì)量、劑量、劑型等因素的影響，因此后期還需采用體內(nèi)試驗(yàn)研究方法逐步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性。

（本文圖1~5見(jiàn)插圖8-5，圖6~9見(jiàn)插圖8-6）