王羽儂，馮蕙裳，王瑩，王家悅，李元文，張豐川

作者單位：1北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚科，北京 100029；

2北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科，北京 100029；

3北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院皮膚科，北京 100027

慢性濕疹常由急性及亞急性濕疹遷延不愈而成，常表現(xiàn)為患部皮膚肥厚粗糙，呈苔蘚樣變、鱗屑及皸裂，瘙癢程度輕重不一，病情遷延反復(fù)數(shù)月或數(shù)年。多發(fā)于手足、軀干四肢間擦部位及外陰、肛門等處，以四肢多見，常對稱分布。慢性濕疹病人無法忍受癥狀反復(fù)發(fā)作，嚴重影響其正常生活和工作，無論生理還是心理都遭受長期折磨［1］。目前外用藥治療中，糖皮質(zhì)激素藥膏應(yīng)用最為廣泛，但存在長期應(yīng)用耐藥、激素依賴等問題；中醫(yī)外治常采用多種中藥外洗及中成藥軟膏涂抹［2］。慢性濕疹屬于中醫(yī)“濕瘡，血虛風(fēng)燥證”范疇，治療以活血祛風(fēng)，潤燥止癢為原則。

二白膏為導(dǎo)師張豐川教授經(jīng)驗方，由白及粉、三七粉組成，用時取適量加凡士林調(diào)和成膏涂抹患處，具有潤燥生肌、養(yǎng)血活血、收斂止癢的功效。張教授多年在臨床中用其治療身體各部位慢性濕疹，改善皮膚粗糙肥厚、皸裂及瘙癢療效甚佳，且使用方便易攜帶，病人依從性好。本研究在2019年的臨床研究基礎(chǔ)上，于2022 年1―5 月開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，從藥物活性成分出發(fā)，多角度、多層次聯(lián)系“藥物-疾病-基因”相互作用靶點及相關(guān)作用通路，探討二白膏多靶點整合調(diào)節(jié)慢性濕疹的作用機制，進而驗證其臨床療效。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方二白膏活性成分的篩選及靶點預(yù)測利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（TCMSP）搜集白及、三七化學(xué)成分，將類藥性≥0.18 和脂水分配系數(shù)<0.5 作為機體對外源化學(xué)物的吸收、分布、代謝和排泄（ab?sorption，distribution，metabolism，and excretion，AD?ME）性質(zhì)參數(shù)以預(yù)測以上單味藥的有效成分。為避免個別認可度較高的有效成分被篩選掉，故同時查閱《中國藥典（2015 版）》與CNKI 中相關(guān)文獻，得到此類成分并合并至TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果。通過SwissTargerPrediction 網(wǎng)站（http：//www. swisstarget?prediction.ch/）進行靶點預(yù)測［3］。

1.2 慢性濕疹靶點預(yù)測在人類在線孟德爾遺傳平臺（OMIM，https：//www.omim.org/）和人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，http：//www.genecards.org/）輸入關(guān)鍵詞“chronic eczema”獲取慢性濕疹的靶點。

1.3 成分疾病共有靶點的獲取及蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將二白膏靶點與慢性濕疹靶點通過Draw Venn Diagrams 網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，得到成分疾病共有靶點。將共有靶點導(dǎo)入String網(wǎng)站（https：//string-db.org/）繪制蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein in?teraction，PPI），并利用Cytoscape 3.9.1軟件對蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進行可視化處理及拓撲特征分析，以“節(jié)點度中心性”（degree centrality，DC）、“中介中心性”（betweenness centrality，BC）及“接近中心性”（close?ness centrality，CC）3 個參數(shù)的中位數(shù)作為篩選條件，篩選2次得到成分治療疾病的核心靶點。

1.4 GO 分析和KEGG 富集分析基因本體論GO分析是一種可以通過生物途徑對基因進行說明與注釋的富集分析方法。京都基因與基因組百科全書通路分析可對篩選靶標參與的通路進行富集分析。本研究將成分對疾病的直接作用靶點導(dǎo)入DA?VID 網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/），進行GO 和KEGG分析。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將二白膏藥物、有效成分、靶點及作用通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，建立“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物設(shè)計的方法。主要研究分子間（如配體和受體）相互作用，并預(yù)測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法。本研究基于在線CB-Dock 網(wǎng)站（http：//cao.labshare.cn/）進行分子對接驗證［4］；通過蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB（https：//www.rcsb.org/）得到核心靶點的3D 晶體結(jié)構(gòu)，TCMSP 網(wǎng)站得到成分的mol2 結(jié)構(gòu)，同時將活性成分的mol2結(jié)構(gòu)和靶點的PDB 文件導(dǎo)入CB-Dock網(wǎng)站，進行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 二白膏化學(xué)成分篩選與靶點預(yù)測從TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索二白膏各味藥的化學(xué)成分，白及36 種，三七119 種；根據(jù)其中“類藥性≥0.18 和脂水分配系數(shù)<0.5”條件，選定17 種成分作為活性成分，其中白及9 種，三七8 種，另從藥典及相關(guān)文獻［5-6］驗證指標性成分。

將活性成分通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫進行的靶點預(yù)測，去除重復(fù)項后共得到626 個成分靶點。

2.2 慢性濕疹靶點以“chronic eczema”為關(guān)鍵詞在OMIM 和GeneGards 數(shù)據(jù)庫中分別找到2 342 和2 421個疾病靶點，篩選、合并去除重復(fù)項后，共得到689種疾病靶點。

2.3 藥物成分與疾病靶點映射結(jié)果及PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過Draw Venn Diagrams 網(wǎng)站，得到97 個共有靶點，如圖1所示。

圖1 二白膏靶點和慢性濕疹靶點的韋恩圖

String 網(wǎng)站是一個功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，可以預(yù)測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。將所有靶點導(dǎo)入網(wǎng)站后，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，其中一個靶點被String網(wǎng)站自動刪除，保存為TSV格式后，并利用Cy?toscape 3.9.1 軟件對蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進行拓撲特征分析，篩選成分治療疾病的核心靶點，如圖2，表1 所示；將構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化處理，如圖3所示。將15 個核心靶點排序后，SRC（度值=60）、ESR1（度值=42）、MMP9（度值=44）、AKT1（度值=67）、EGFR（度值=58）是該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)的拓撲篩選過程

圖3 二白膏中97個靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 二白膏治療慢性濕疹的15個核心靶點信息

2.4 GO 分析及KEGG 富集分析利用DAVID 網(wǎng)站對97 個靶點進行富集分析。以FDR<0.05 為篩選條件，得到GO 生物學(xué)條目146 條，主要涉及細胞信號傳導(dǎo)（細胞增殖、細胞遷移、細胞凋亡等）、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等方面，根據(jù)FDR 值排序后，排名前10的生物過程如圖4所示。由此推測二白膏治療慢性濕疹可能是一個復(fù)雜的多途徑協(xié)同作用的結(jié)果。

圖4 97個靶點的GO富集分析

為了進一步揭示二白膏治療慢性濕疹的作用機制，我們對97 個靶點進行KEGG 通路分析，根據(jù)FDR<0.05 及慢性濕疹相關(guān)信號通路篩選出18 條相關(guān)途徑，分析結(jié)果如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)這些基因數(shù)目主要在PI3K-Akt 信號通（hsa04151）（見圖6）、JAK-STAT 信號通路（hsa04630）、TNF 信號通路（hsa04668）、MAPK信號通路（04010）等相關(guān)通路。

圖5 97個靶點的KEGG通路分析

圖6 KEGG通路圖（PI3K）

2.5 “藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為了更好地闡明藥物、成分、靶點和通路之間的關(guān)系，我們使用Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建了“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖7A）及靶點-通路網(wǎng)絡(luò)（圖7B）。通過該網(wǎng)絡(luò)，我們可以直觀地展示二白膏治療慢性濕疹的有效物質(zhì)及其可能的作用機制。

圖7 藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖：A為藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖(綠色節(jié)點代表藥物，黃色節(jié)點代表成分，藍色節(jié)點代表靶點)；B為靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖(紅色節(jié)點代表核心靶點，黃色節(jié)點代表核心靶點外的靶點，藍色節(jié)點代表通路)

2.6 分子對接驗證根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)及拓撲學(xué)分析，選擇“度”排名前5 的靶點SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）、ESR1（雌激素受體α）、MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）、AKT1（絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶1）、EGFR（表皮生長因子受體）；通過構(gòu)建核心靶點-成分網(wǎng)絡(luò)（圖8），選擇對應(yīng)核心靶點數(shù)最多的前4個化合物ginsenoside f2（人參皂苷F2）、3-（p-hydroxyben?zyl）-4-methoxy-9，10-dihydrophenanthrene［3-（對-羥芐基）-4-甲氧基-9，10-二氫菲］、DFV（二羥基黃烷酮）、Diop（鄰苯二甲酸二異辛酯）做進一步分析?；谠诰€對接網(wǎng)站，將5 個靶蛋白與4 個活性成分分別進行對接，結(jié)果見表2。表2中受體和配體進行分子對接所得到復(fù)合物的得分越低，代表受體和配體親和力越高。20 種對接方法均顯示較好的對接活性，表明二白膏的活性成分可能通過與SRC、ESR1、MMP9、AKT1、EGFR 等活性靶點作用，發(fā)揮治療慢性濕疹的作用。

圖8 核心靶點-成分網(wǎng)絡(luò)：圖左節(jié)點代表核心靶點，圖右節(jié)點代表成分

表2 二白膏治療慢性濕疹的成分與靶點的結(jié)合能/（kJ/mol)

3 討論

濕疹屬中醫(yī)“濕瘡”范疇，常反復(fù)發(fā)作，瘙癢劇烈［7］。中醫(yī)認為濕邪郁久耗傷氣陰，局部血虛津虧，肌膚失養(yǎng)，故皮膚干燥粗糙、肥厚乃至皸裂。西醫(yī)認為本病與免疫、遺傳、過敏原、皮膚屏障功能障礙等因素有關(guān)，局部治療多采用糖皮質(zhì)激素［8-9］。但局部外用藥物治療存在潛在的不良反應(yīng)，如誘發(fā)感染、皮膚燒灼感、皮膚萎縮、毛細血管擴張等，且易形成激素依賴，停藥后癥狀反復(fù)［10］。

二白膏為張豐川教授治療慢性濕疹局部外用藥多年經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用療效確切。白及、三七均為植物藥，無毒性，無特殊氣味，顏色較淺，對皮膚美觀無礙，且?guī)缀鯚o不良反應(yīng)，方便病人自行調(diào)配及隨身攜帶，病人依從性好?！短票静荨份d白及“手足皸拆，嚼以涂之”，言其因味澀收斂，能生肌斂瘡，治療手足皸裂、肛裂等收效甚佳。現(xiàn)代研究表明其可縮短凝血時間及抑制纖溶，具有良好的局部止血作用，能形成人工血栓而止血［11］。其根中含白及甘露聚糖，具抗?jié)兓钚裕?2］。體外實驗表明白及對多種細菌及真菌有一定抑制作用［13］。還可以通過提高細胞外角質(zhì)膠原水平、傷口巨噬細胞數(shù)量以抵御氧化、幫助皮膚生成皮膚保護膜［14］，可謂是卓越的藥用輔料，可見治療慢性濕疹大有裨益。三七“能治一切血病”，具有養(yǎng)血止血、補血散瘀、活血定痛的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究認為三七中主要含有皂苷類、三七素、三七氨酸等成分［15］，具有活血、止血、促造血；抗氧化、促進成纖維細胞和膠原合成、改善皮膚組織結(jié)構(gòu)；抗組胺、增強皮膚免疫力、抗炎等作用［16-17］?？梢姸赘鄬^敏性炎癥性皮膚病有較好的抗過敏抗炎作用，減輕慢性濕疹。

本研究進行了二白膏中有效成分與靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)拓撲篩選、PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析、GO 富集分析和 KEGG 通路分析等。從藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，二白膏的關(guān)鍵化合物主要集中在人參皂苷F2、二氫菲類化合物、食脂素、鄰苯二甲酸二異辛酯，其中人參皂苷F2 表現(xiàn)了高強度的活性，主要存在于三七中。多項研究表明，人參皂苷F2作為具有抗氧化應(yīng)激作用的天然產(chǎn)物，可通過一系列信號通路發(fā)揮抑制細胞凋亡作用［18］，且被證實具有良好的抗菌、抗炎活性［19］，可通過增加IL-10和Tregs的表達，降低IL-17和Th17細胞的表達來減輕炎癥［20］。二氫菲類化合物可有效地抑制炎性因子的產(chǎn)生，有抗病原菌［21］、解痙、抗血小板凝集、抗過敏等生物活性［22］。三七中的食脂素、鄰苯二甲酸二異辛酯在抗腫瘤、抗衰老、增強人體免疫力等方面發(fā)揮了重要的藥理活性［23-24］。從基因蛋白分子層面，二白膏的分子作用靶點中有15個與慢性濕疹關(guān)的核心靶點，這15 個靶點進行 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，可以發(fā)現(xiàn)主要分為細胞因子和蛋白激酶。細胞因子中AKT1、SRC、EG?FR、VEGFA、STAT3等體現(xiàn)了高度的協(xié)同作用，也是二白膏治療慢性濕疹發(fā)揮藥理作用的主要作用靶點。AKT1 是核降解的重要因子，參與了濕疹模型中角化不全病理中的角質(zhì)細胞終末分化和角質(zhì)化包膜形成的關(guān)鍵過程［25］。SRC 是重要的抗炎因子，有體外實驗證實某種中藥成分在NF-κB 信號通路中通過作用于SRC 而發(fā)揮抗炎作用［26］。外國學(xué)者Su 等［27］研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性和基因間相互作用，證明EGFR、SRC 和STAT3 作為轉(zhuǎn)錄因子或復(fù)合物發(fā)揮作用，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和激活，并與腫瘤生長、腫瘤血管生成、胚胎植入和抗磷脂綜合征相關(guān)，能通過調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)細胞因子參與免疫反應(yīng)。故筆者從分子層面猜測，二白膏通過抗炎、修復(fù)皮膚組織，調(diào)控皮膚角化來治療慢性濕疹。從功能作用層面，GO 富集分析得到的條目中，主要涉及增強細胞增殖及遷移、抑制細胞凋亡、增加蛋白激酶活性、細胞表面黏附復(fù)合物、炎癥反應(yīng)、信號傳導(dǎo)等多種生物過程，可作為二白膏治療慢性濕疹的關(guān)鍵過程。KEGG 通路富集分析篩選得到18 條信號通路，基因數(shù)目在P13-Akt 及JAK-STAT 通路上富集較多。其中PI3K-Akt 信號通路可被多種類型的細胞刺激或毒性損傷激活，調(diào)節(jié)細胞的基本功能，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、生長和存活。已有大量證據(jù)表明，AKT 一旦被激活，可以通過磷酸化參與細胞凋亡、蛋白質(zhì)合成、代謝和細胞周期的底物來控制關(guān)鍵的細胞過程［28］。且AKT1 缺失的小鼠可顯著抑制微血管通透性和白細胞向炎癥部位的募集，使得過敏反應(yīng)明顯減輕［29］，與本文中最主要的核心靶點作用機制相佐證。根據(jù)我們的研究結(jié)果，通過抑制AKT1 從而降低 PI3K -Akt 信號通路可能在二白膏活性成分治療慢性濕疹中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。此外，抑制JAKSTAT 信號通路可降低炎癥，改善細胞穩(wěn)態(tài)［30］，且有研究證實糖皮質(zhì)激素正是通過抑制本文核心靶點中的IL-2 所誘導(dǎo)的JAK-STAT 通路來發(fā)揮其強效抗炎作用［31］?？梢姸赘嗟乃幚碜饔门c糖皮質(zhì)激素有異曲同工之妙，且使用安全，不具有其可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對二白膏治療慢性濕疹的作用機制進行了探究，證明為多成分、多靶點、多途徑的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用的結(jié)果，可以推測二白膏通過抗炎、抗氧化、調(diào)控細胞增殖和凋亡、修復(fù)皮膚屏障等作用來治療慢性濕疹，臨床應(yīng)用前景廣闊。

（本文圖1~6見插圖8-2，圖7，8見插圖8-3）