桑舒柳，丁蓉珍，姜靖潔，龔亞斌

作者單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，上海 200437

據(jù)統(tǒng)計，目前肺癌的死亡率仍居首位，是癌癥死亡的主要原因［1］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）約占肺癌總發(fā)病率的85%［2］。肺癌治療方法包括手術(shù)、放化療、靶向、免疫等［3-4］，但病人預(yù)后欠佳。據(jù)調(diào)查顯示約40%的NSCLC 病人存在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變［5］，靶向治療在臨床應(yīng)用越來越廣泛，但病人仍出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。多項研究已證實中醫(yī)藥在惡性腫瘤的治療中應(yīng)用廣泛，可增效減毒，提高病人生存質(zhì)量、延長生存期等［6］。肺巖寧方是上海市名中醫(yī)徐振曄教授總結(jié)多年臨床實踐而研發(fā)出來的抗癌經(jīng)驗方，由生黃芪、黃精、石見穿、七葉一枝花等組成，具有益氣養(yǎng)精，解毒散結(jié)之功［7］。臨床研究表明肺巖寧方能有效抑制晚期肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［8］，并能有效提高NSCLC 病人的生存質(zhì)量［9］，但肺巖寧方治療EGFR 突變型NSCLC 的具體分子機制仍未闡明。本研究于2020 年 11 月至2021 年 2 月以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點，預(yù)測肺巖寧方治療EGFR 突變型NSCLC 的主要活性成分、作用靶點及作用通路，并通過細胞實驗進行生物學(xué)驗證，探討肺巖寧方治療EGFR突變型NSCLC的潛在作用機制，為其臨床上更廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化合物有效成分和靶點的收集及疾病靶點的預(yù)測以“白術(shù)”“蜂房”“干蟾皮”“黃精”“黃芪”“靈芝”“山慈菇”“石見穿”“淫羊藿”“重樓”“山茱萸”為檢索詞，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中檢索11 味藥的化學(xué)成分，根據(jù)藥物動力學(xué)（ADME），以生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為限制條件。查閱文獻后對TCMSP中未預(yù)測到的有效化合物成分進行補充。在Pubchem提取相應(yīng)化學(xué)成分對應(yīng)的smile 號，并通過Swiss Tar?get Prediction收集對應(yīng)的靶點。

將關(guān)鍵詞設(shè)置為“non-small cell lung cancer”，檢索Genecard（www.genecards.org）和DisGeNET（www.disgenet.org）數(shù)據(jù)庫，選擇“Homo sapiens”，檢索NSCLC 的疾病靶點。然后將藥物靶點與疾病相關(guān)靶點取并集，得到韋恩圖，并集得到的靶點則為肺巖寧方治療NSCLC的潛在靶點。

1.2 肺巖寧方活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建將上述獲得的活性成分及靶點對應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入到軟件Cytoscape 3.7.2 中進行相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析，畫出肺巖寧方“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)”圖，采用“Network Analyze”插件進行網(wǎng)絡(luò)特征分析來篩選重要的活性成分。

將肺巖寧方與NSCLC 的并集靶點導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org） 平臺，選擇“Homo sapiens”，篩選條件為置信度>0.7，下載蛋白互作文件后將其導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 中，生成PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，以“De?gree”“BetweennessCentrality”和“ClosenessCentrality”超過中位數(shù)的值來篩選出重要靶點。

1.3 基因富集分析和化合物-靶點-通路圖的構(gòu)建將1.2 的重要靶點導(dǎo)入Metascape（http：//metascape.org/）平臺，選擇“Homo sapiens”， 進行GO 和 KEGG富集分析。用Cytoscape畫出肺巖寧方化合物-靶點-通路關(guān)系圖。

1.4 肺巖寧方抗非小細胞肺癌核心靶點的篩選將“1.2”篩選的靶點導(dǎo)入GEPIA 數(shù)據(jù)庫，選擇“總體生存”，P<0.05 和P（HR）<0.05 作為LUAD 數(shù)據(jù)集的顯著性閾值，篩選出肺巖寧方治療NSCLC 的核心靶點。

1.5 細胞培養(yǎng)EGFR 突變型肺癌細胞株HCC827購于中國科學(xué)院上海細胞庫，用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，置于37 ℃、二氧化碳體積分數(shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中。將肺巖寧方干燥成凍干粉后保存于?20 ℃冰箱中。按照實驗要求將肺巖寧方凍干粉溶解于培養(yǎng)基中稀釋成所需濃度，用0.22μm濾器過濾后現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.6 CCK8 實驗HCC827 細胞用不同濃度（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 g/L）的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)在96 孔板中，對照組則為不含肺巖寧方的培養(yǎng)基，密度為3×103個/孔。肺巖寧方干預(yù)48 h后在每板內(nèi)加入CCK-8 試劑（每孔10 μL），隨后放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測定每孔的吸光度（OD）值，波長設(shè)置為450 nm，計算細胞抑制率和IC50值。

1.7 平板克隆形成實驗將HCC827 細胞以1 000個/孔的密度接種于六孔板孔內(nèi)，用含30%FBS 的培養(yǎng)基，用不同濃度的肺巖寧方干預(yù)細胞，2 周后棄培養(yǎng)基，用PBS 清洗后用多聚甲醇固定30 min，加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色，30 min 后流水沖洗，晾干拍照。

1.8 細胞侵襲實驗將HCC827細胞消化計數(shù)重懸至2×104個/孔，先加入100 U Matrigel 膠，再吸取細胞懸液，同時加入不同濃度的肺巖寧方到上室，下室加入500 μL 含15% FBS 的培養(yǎng)基后將24 孔板置于培養(yǎng)箱，24 h 將Transwell 小室取出，棄培養(yǎng)基，用PBS 輕微沖洗2 次，甲醛固定30 min 后加入 0.1%結(jié)晶紫溶液染色，30 min后用PBS清洗，晾干即可于倒置顯微鏡下拍照。

1.9 qRT-PCR 實驗用trizol 試劑提取HCC827 細胞中總RNA。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書采用RT-qPCR 芯片分析基因表達譜。采用2?ΔΔCt計算法測定mRNA表達水平，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法所有細胞實驗重復(fù)3 次。統(tǒng)計作圖采用GraphPad 軟件。數(shù)據(jù)以表示，兩組獨立樣本資料采用t檢驗，多組間統(tǒng)計用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及治療靶點結(jié)合已有文獻報道和TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出有效成分白術(shù)8 種，蜂房6 種，干蟾皮10 種，黃精13 種，黃芪13 種，靈芝42 種，山慈菇7 種，石見穿7 種，淫羊藿16 種，重樓11 種。取P>0，將所有化合物對應(yīng)靶點去掉重復(fù)后得到靶點共904 個。GenCards 等數(shù)據(jù)庫收集到NSCLC 疾病靶點共3 813 個，我們將肺巖寧方和疾病靶點取并集得到521 個靶點，即肺巖寧方治療NSCLC 的潛在靶點。見圖1。

圖1 肺巖寧方與NSCLC交叉靶點的韋恩圖

2.2 活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由972 個節(jié)點構(gòu)成，包括7 637 條邊，其中單個靶點的度值（degree）決定所連接靶點的數(shù)量，見圖2。

圖2 肺巖寧方成分潛在治療靶點網(wǎng)絡(luò)圖

將521個靶點導(dǎo)入STRING平臺，以置信度>0.7為條件進行篩選后導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2生成PPI網(wǎng)絡(luò)。進行網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)分析，以“Degree”大于中位數(shù)（51）、“BetweennessCentrality”大于中位數(shù)（0.009 325 23）和“ClosenessCentrality”大于中位數(shù)（0.454 049 14）為條件共篩選出重要靶點共71個。見圖3。

圖3 肺巖寧方NSCLC潛在治療靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 和KEGG 富集分析將71 個重要靶點導(dǎo)入Metascape 平臺，分析GO 和KEGG 富集情況。GO分析取P值前20，其中生物過程主要包括細胞遷移、正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移酶活性等，細胞組成主要包括膜筏、膜微區(qū)、胞質(zhì)核周區(qū)等，分子功能主要包括蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等。KEGG 富集分析顯示肺巖寧方抗NSCLC 的信號通路主要有PI3K-AKT 信號通路、癌癥相關(guān)信號通路HIF-1信號通路等。見圖4。

圖4 肺巖寧方治療NSCLC潛在靶點的GO和KEGG富集分析

2.4 肺巖寧方成分-NSCLC 治療靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建利用Cytoscape 建立肺巖寧方治療NSCLC的活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)由219 個節(jié)點和1 579條邊組成（圖5）。

2.5 肺巖寧方核心靶點分析在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中搜索71 個重要靶點，通過總體生存率篩選出了14個核心靶點（表1）。

2.6 肺巖寧方具有抑制HCC827 細胞增殖的作用CCK8 結(jié)果顯示，用不同濃度的肺巖寧方（0~1 g/L）干預(yù)HCC827 細胞48 h，肺巖寧方能顯著降低細胞HCC827 細胞的增殖能力，并呈劑量依賴性。IC50值約為700 mg/L。見表2。

表2 用CCK8法檢測肺巖寧方（0~1 000 mg/L）作用48 h后的HCC827細胞的抑制率/（%，）

注：①與0 mg/L相比，P<0.01。②與對照組相比，P<0.001。

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2.7 肺巖寧方具有抑制HCC827 細胞集落形成的作用克隆形成實驗結(jié)果如圖6 所示，與對照組相比，肺巖寧方干預(yù)14 d 后，HCC827 細胞的克隆形成數(shù)量明顯降低，且呈濃度依賴性，說明肺巖寧方具有抑制HCC827細胞集落形成的作用。見表3。

圖6 肺巖寧方對HCC827細胞克隆形成的影響）

表3 肺巖寧方對HCC827細胞克隆形成的影響/（%，）

表3 肺巖寧方對HCC827細胞克隆形成的影響/（%，）

注：①與對照組相比，P=0.015。

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2.8 肺巖寧方具有抑制HCC827 細胞侵襲能力的作用侵襲結(jié)果顯示，與對照組相比，肺巖寧方干預(yù)24 h 后，HCC827 細胞的侵襲能力受到明顯抑制（P<0.001），說明肺巖寧方具有抑制肺癌細胞的侵襲能力。見圖7，表4。

圖7 肺巖寧方對HCC827細胞侵襲能力的影響

表 4 肺巖寧方對HCC827細胞侵襲能力的影響/（%，）

表 4 肺巖寧方對HCC827細胞侵襲能力的影響/（%，）

注：①與對照組相比，P<0.01。②與對照組相比，P<0.001。

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2.9 肺巖寧方核心靶點mRNA 的驗證為了驗證肺巖寧方對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的14 個核心靶點mRNA 水平的影響，用IC50的濃度干預(yù)HCC827 細胞48 h 后，采用RT-qPCR 芯片進行檢測。結(jié)果顯示肺巖寧方能抑制HCC827 細胞中KIT 的mRNA 表達（P<0.01）。見圖8，表5。

圖8 對照組和肺巖寧方組14個核心靶點的mRNA表達熱圖

表 5 干細胞生長因子受體KIT mRNA的表達/

表 5 干細胞生長因子受體KIT mRNA的表達/

注：①與對照組相比，P<0.05。

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3 討論

中藥方劑的化合物成分復(fù)雜，目前研究仍未完全闡明其分子機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種生物信息分析工具，被廣泛用于研究中藥方劑的活性成分及潛在作用靶點，為其作用機制提供依據(jù)［10-11］。近年來有研究發(fā)現(xiàn)肺巖寧方能下調(diào)CXCLs/CXCR2 軸抑制腫瘤微環(huán)境中性粒細胞浸潤從而預(yù)防肺癌轉(zhuǎn)移［12］。此外，肺巖寧方可以促進代謝和改變線粒體膜電位來誘導(dǎo)肺腺癌細胞凋亡［13］。為了進一步研究肺巖寧方抗NSCLC 的分子機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘肺巖寧方的活性成分，探索肺巖寧方化合物對應(yīng)的靶點與NSCLC 疾病靶點的關(guān)聯(lián)，并根據(jù)篩選出的核心靶點進行實驗驗證。

首先，通過ADME 篩選，從肺巖寧方11 味藥中鑒定出了133個活性成分，主要包括槲皮素、白藜蘆醇、黃芩素等。已有研究［14-15］證實，肺巖寧方中多個活性成分可以抗腫瘤，比如槲皮素（SCG5、YYH14、CL1、SJC2、HQ13）是一種黃酮類化合物，存在于山慈菇、淫羊藿、重樓、石見穿、黃芪中，可通過抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲以及抑制腫瘤血管生成、促進細胞凋亡和介導(dǎo)細胞自噬等多條途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。黃芩素（HJ1）來源于黃精，是一種生物類黃酮，在不同癌細胞中均具有抗腫瘤作用［16］，并能抑制EMT 通過PI3K/Akt/NF-kB 途徑使肺腺癌細胞抗凋亡從而提高肺腺癌細胞對順鉑的敏感性［17］。白藜蘆醇（SJC5）來源于石見穿，是一種天然的多萜類化合物，可作為癌細胞凋亡的增強劑［18］，可通過抑制細胞周期和誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制乳腺癌細胞的增殖［19］。因此，肺巖寧方抗NSCLC 的機制可能與多個化合物協(xié)同作用有關(guān)。

然后，本研究對肺巖寧方的化合物成分對應(yīng)的重要靶點進行進一步分析和實驗驗證。通過PPI網(wǎng)絡(luò)和生存分析篩選出14 個靶點，PCR array 結(jié)果顯示肺巖寧方能抑制HCC827 細胞KIT 基因的mRNA水平。KIT 是一種干細胞生長因子受體，也被稱為原癌基因c-KIT 或CD117，是一種受體酪氨酸激酶。據(jù)研究［20］，KIT 是經(jīng)典的腫瘤干細胞（tumor stem cells，TSCs）標志分子，參與新生血管形成。此外，KIT 基因在肺癌和其他小細胞癌，胸腺癌以及卵巢癌等多種腫瘤中過表達［21］，同時也是預(yù)測NSCLC 預(yù)后不佳的潛在標志物［22-24］。我們發(fā)現(xiàn)KIT 基因直接靶向肺巖寧方中華蟾素（GCP4）、華蟾素毒精（GCP3）、黃芩素（HJ1）、薯蕷皂素（HJ4）、白藜蘆醇（SJC5）等化合物。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以激活Sirt1 來下調(diào)c-kit/SCF，影響慢性前列腺炎進展中平滑肌癌的發(fā)展［25］。因此，肺巖寧方可能是通過KIT下調(diào)達到抗腫瘤的目的。

最后，本研究通過中藥-化合物-靶點通路的關(guān)系探索肺巖寧方治療NSCLC的潛在機制。KEGG結(jié)果顯示肺巖寧方治療NSCLC 主要涉及多種癌癥相關(guān)信號通路、PI3K-AKT 信號通路、HIF-1 信號通路等信號通路。據(jù)報道，PI3K/Akt 信號通路是重要的癌癥通路，可以促進癌細胞生長［26］，在某些癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中易發(fā)生異常激活［27］，其中最廣泛的兩種機制是由受體酪氨酸激酶和信號通路中特定元素的體細胞突變觸發(fā)［28］。研究［29-30］顯示，PI3KAkt 信號通路在抑制肺癌細胞增殖和促凋亡中起著重要作用。PI3K 活性受多種癌基因和生長因子受體的調(diào)控，其信號升高常被認為是癌癥發(fā)生的標志［31］。本研究發(fā)現(xiàn)KIT 基因是PI3K-AKT 通路的關(guān)鍵分子。研究［32］表明KIT 能與干細胞生長因子（SCF） 結(jié)合激活下游PI3K-AKT 通路信號。因此，肺巖寧方可能是通過下調(diào)KIT 從而抑制PI3K-AKT 信號通路來達到抗NSCLC 的目的。但本研究未進一步進行機制驗證和動物實驗，這也是本研究下一步研究的方向。

綜上所述，本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來探索肺巖寧方治療NSCLC的藥物成分-靶點-疾病的相互作用。肺巖寧方可能通過下調(diào)KIT 基因調(diào)控PI3KAKT 信號通路來發(fā)揮抗癌的作用，這為臨床研究中肺巖寧方治療NSCLC 提供了科學(xué)依據(jù)，也為探索肺巖寧方抗NSCLC的作用機制提供了新的方向。

（本文圖1，2見插圖8-3，圖3~8見插圖8-4）