孫有朋，王 霞，符貽武，吳漢鵬，陳意純，葉映蓉，楊正濤，周二順

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528225

藍(lán)氏賈第蟲（Giardia lamblia）又稱藍(lán)氏賈第鞭毛蟲或十二指腸賈第蟲，是鞭毛綱的人畜共患腸道內(nèi)寄生原蟲[1]。藍(lán)氏賈第蟲有滋養(yǎng)體（9～20 μm×5～12 μm，倒置梨形）和包囊（10～14 μm×7.5～9.0 μm，橢圓形）2 種形態(tài)。包囊為感染階段的形態(tài)，其暴露于胃酸后脫囊形成滋養(yǎng)體并開始二分裂增殖。滋養(yǎng)體在暴露于膽汁或高pH 值的環(huán)境下形成包囊并排出體外從而感染新的宿主[2]。藍(lán)氏賈第蟲病主要通過糞口傳播，也可通過直接接觸傳播，嬰幼兒及免疫力低下者尤為易感，患者癥狀主要為腹瀉、腹痛及生長發(fā)育不良[3-4]。藍(lán)氏賈第蟲感染導(dǎo)致的腹瀉通常有惡臭氣味且油膩（脂肪痢），該病原除與宿主爭奪營養(yǎng)外，還會造成腸上皮細(xì)胞凋亡及免疫屏障的喪失[5]。

根據(jù)目前對藍(lán)氏賈第蟲基因型的研究，已證明藍(lán)氏賈第蟲可被分為A～H 8 種集聚體。集聚體A和集聚體B 為人感染的主要集聚體類型，同時(shí)也能感染犬、貓等伴侶動物，也有少量人感染其他聚集體類型的報(bào)道[6]；集聚體C 和集聚體D 主要感染貓科動物；集聚體E 主要感染牛、羊等偶蹄類動物[7-8]。藍(lán)氏賈第蟲在發(fā)展中國家的感染情況尤為嚴(yán)重，尤其是亞洲、非洲與拉丁美洲，據(jù)報(bào)道每年全球約超過2 億人感染賈第蟲病[9]。然而，大量的隱性感染和較高的誤診率帶來的防控難度的提升使藍(lán)氏賈第蟲相關(guān)研究顯得尤為必要[10]。在近幾年動物感染藍(lán)氏賈第蟲的調(diào)查報(bào)道中，廣東某地奶牛藍(lán)氏賈第蟲感染率最高可達(dá)74.2%[11-13]。同時(shí)，有報(bào)道提供了一些E 型集聚體感染人的案例[14]，這引發(fā)了我們對牛羊養(yǎng)殖業(yè)相關(guān)從業(yè)人員的擔(dān)憂。在本研究中，采集了本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常與牛羊接觸的成員的糞便進(jìn)行鏡檢，并對其DNA 樣品進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增，以評估相關(guān)人員藍(lán)氏賈第蟲的感染風(fēng)險(xiǎn)并為其預(yù)防、臨床診斷及相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

收集本實(shí)驗(yàn)室20 位成員的中段晨糞存于50 mL無菌離心管中，分別標(biāo)記好每個(gè)人的性別、是否腹瀉等基本信息，樣品短暫保存于4 ℃待測。

1.2 鏡檢

首先，用直接涂片鏡檢法檢查腸道寄生蟲多樣性，于潔凈的載玻片中央滴1 滴生理鹽水，用牙簽挑取火柴頭大小的新鮮糞便置于生理鹽水中并涂抹均勻，蓋上蓋玻片置于鏡下觀察，每個(gè)樣品重復(fù)檢查5 次。然后，用33%硫酸鋅溶液漂浮法嘗試富集藍(lán)氏賈第蟲卵，取1 g 糞便于15 mL 離心管，加入10 mL 生理鹽水充分震蕩混勻后離心10 min。棄上清，加入10 mL 硫酸鋅溶液，震蕩混勻后離心10 min，最后取上清鏡檢。

1.3 DNA 提取

1.4 藍(lán)氏賈第蟲BG、GDH、TPI 基因擴(kuò)增

采用巢式PCR對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物序列參考Bartley等[15]的報(bào)道，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，具體見表1。PCR體系由4 μL dNTP（25 mmol/L）、5 μL 10×buffer、0.6 μL Taq Polymerase（2.5 U/μL）、2 μL BSA（10 mg/mL）、1 μL Forward primer（10 μmol/L）、1 μL Reverse primer（10 μmol/L）、2 μL DNA 以及34.4 μL 去離子水組成，共50 μL。Taq DNA 聚合酶（Perfect－StartTMTaq DNA Polymerase，AP401）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。用于PCR擴(kuò)增的熱循環(huán)儀（Mini Amp）由賽默飛世爾生產(chǎn)，第1 輪擴(kuò)增BG及GDH基因退火溫度為57 ℃，TPI基因退火溫度為55 ℃;第2 輪擴(kuò)增3 種基因退火溫度均為60 ℃。DNA 擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL 產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，30 min 后把凝膠放入全自動凝膠成像儀（C280,Azure Biosystems）中進(jìn)行拍攝。

表1 BG、GDH 及TPI 引物序列

1.5 基因序列分析

委托擎科生物科技有限公司對鑒定為陽性的DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。將獲得的序列經(jīng)DNAstar拼接后，與從Genbank 數(shù)據(jù)庫中下載的序列進(jìn)行對比以確定其藍(lán)氏賈第蟲的基因型及亞型。從Genbank上選擇不同類型的參考序列使用Mega11 軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。采用鄰接法（neighbor-joining method），自展值設(shè)置為1 000 次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢

樣品經(jīng)過涂片鏡檢未發(fā)現(xiàn)有寄生蟲卵或蟲體出現(xiàn)，經(jīng)硫酸鋅溶液漂浮后未見藍(lán)氏賈第蟲包囊。由于藍(lán)氏賈第蟲隱性感染比例較大，鏡檢靈敏度稍差，同時(shí)對樣品基于BG、GDH、TPI位點(diǎn)進(jìn)行了巢式PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行瓊脂糖電泳。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

對20 份DNA 樣品進(jìn)行擴(kuò)增后電泳結(jié)果顯示其中有1 份樣品的BG基因擴(kuò)增結(jié)果為陽性，條帶位置在500 bp 左右（圖1），而GDH和TPI位點(diǎn)均未見目的條帶。該患者為男性，無腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀。本次調(diào)查藍(lán)氏賈第蟲陽性率為5%（1/20）。

圖1 糞樣DNA 基于BG 位點(diǎn)巢式PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 基因型分析

將陽性樣品的第2 輪擴(kuò)增產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司測序，序列經(jīng)DNA Star 拼接后與Genbank數(shù)據(jù)庫比對，鑒定為集聚體E 型，其亞型為E1。

2.4 進(jìn)化發(fā)育分析

將拼接后的序列同參考序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2 所示。本次發(fā)現(xiàn)的E 型集聚體與A 型集聚體發(fā)育距離較近。

圖2 藍(lán)氏賈第蟲系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

3 討論

以腹痛、腹瀉為主要癥狀的藍(lán)氏賈第蟲病可能會導(dǎo)致生長發(fā)育期的兒童營養(yǎng)不良、消瘦甚至發(fā)生慢性胃腸疾病[16]。1 項(xiàng)美國門診兒童腹瀉病因的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)?shù)胤橇〖残愿篂a的兒童賈第蟲感染率達(dá)15%，同時(shí)大量的隱性感染者會將蟲卵帶給家庭成員[17]。藍(lán)氏賈第蟲可能會對腸道消化吸收功能造成持久的不良影響，一些研究表明藍(lán)氏賈第蟲的接觸會使腸上皮的細(xì)胞骨架絨毛蛋白和緊密連接蛋白降解，藍(lán)氏賈第蟲引起的慢性胃腸疾病等后遺癥可能與該上皮屏障的改變有關(guān)[18-20]。對賈第蟲病的預(yù)防與治療，目前尚未有獲批上市的可用于人的疫苗、也沒有特異性治療藥物，常用的治療藥物主要包括甲硝唑、替硝唑、呋喃唑酮等[21]。針對賈第蟲病，預(yù)防是低成本的有效方法。鑒于其傳播特點(diǎn)，保障水源清潔和做好個(gè)人衛(wèi)生是預(yù)防該病的關(guān)鍵。

如今衛(wèi)生條件的逐漸改善對人畜共患寄生蟲病的防控有積極的意義，然而越來越多的集聚體E感染人的報(bào)道表明牛、羊等反芻動物攜帶的病原應(yīng)得到重視[22-23]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對賈第蟲人畜共患的威脅有了更深刻的認(rèn)識[24]。Chen等[25]在中國黑骨山羊中發(fā)現(xiàn)了檢出率高于集聚體E的集聚體A，而且發(fā)現(xiàn)集聚體A 與集聚體E 的核苷酸相似度要高于其他集聚體類型。Fantinatti等[14]在巴西學(xué)齡前兒童中檢測到的44 份賈第蟲陽性樣本中發(fā)現(xiàn)有15 份樣本屬集聚體E。Giangaspero等[26]在意大利中部綿羊中檢測到的賈第蟲類型全部為集聚體A。通過發(fā)育樹的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，本研究所得到的集聚體E 同樣與參考序列中的集聚體A 具有較高的同源性，這很可能意味著人與牛、羊等偶蹄動物互相傳播賈第蟲病的潛力較大。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)人感染E 型藍(lán)氏賈第蟲1 例，且該集聚體與A 型集聚體發(fā)育距離較近。因此，集聚體E 可能存在較大的人畜傳播的風(fēng)險(xiǎn)。在以后的研究中將進(jìn)一步分析牛羊養(yǎng)殖業(yè)工作人員賈第蟲感染情況及集聚體的多樣性，以評估其感染風(fēng)險(xiǎn)。