王 洋，田喜鳳

藍氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia，簡稱賈第蟲）是一種世界性分布的機會性致病原蟲，主要寄生于人和多種哺乳動物的小腸，引起以腹瀉、腹痛、吸收不良為主要癥狀的藍氏賈第鞭毛蟲?。╣iardiasis，簡稱賈第蟲?。?］。賈第蟲是最早分化出來的真核生物之一，生活史簡單，包括具有感染能力的包囊和致病能力的滋養(yǎng)體。包囊隨污染食物和飲水進入人體，在十二指腸內脫囊形成滋養(yǎng)體，滋養(yǎng)體依賴其鞭毛和腹吸盤游弋并吸附在腸粘膜上，結果減少了腸粘膜的吸收面積，同時造成微絨毛的損傷和萎縮，最終導致營養(yǎng)物質和水分吸收障礙而發(fā)生腹瀉。大部分的賈第蟲感染患者能夠自愈，但部分患者會發(fā)生長期或者反復感染，主要見于兒童和免疫功能受損人群［2－3］。兒童患者可引起貧血和營養(yǎng)不良，導致生長滯緩。若不及時治療，多發(fā)展為慢性，表現為周期性稀便，反復發(fā)作，病程可長達數年。在賈第蟲感染過程中，人體的非特異性和特異性免疫系統(tǒng)均能產生強烈的抗賈第蟲效應，賈第蟲如何對抗人體免疫系統(tǒng)的攻擊，在人體內長期生存一直以來都是一個值得關注的問題。本文將對賈第蟲如何逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)做一綜述。

1 宿主的抗賈第蟲免疫

1．1 非特異性免疫 賈第蟲感染者會表現出不同的癥狀，有些患者會在幾天內恢復，而另一些患者即使在血液和腸腔中存在特異性抗體并且有良好細胞免疫的情況下，仍會出現持續(xù)數年的癥狀。一些非特異性免疫因素可能在賈第蟲的排除方面具有重要的意義。例如，來自未曾感染賈第蟲的正常人的乳汁能夠殺死賈第蟲滋養(yǎng)體，乳汁中的結合膽鹽、不飽和脂肪酸以及游離脂肪酸均有殺滅賈第蟲的效果［4］。而十二指腸和空腸液中的脂解反應也能殺滅賈第蟲［5］。中性粒細胞釋放的防御素以及indolicidin在體外具有抗賈第蟲效果［6］。Li E等發(fā)現肥大細胞通過其分泌的各種細胞因子在早期快速控制賈第蟲感染方面具有重要的作用［7］。包括 TNF－α、IFN－γ、IL－6、IL－12在內的多種細胞因子具有體外抑制殺傷賈第蟲的作用［7］。另一些細胞因子則可以通過激活巨噬細胞間接發(fā)揮殺傷賈第蟲的作用［12］。此外，補體系統(tǒng)能夠通過甘露糖途徑被激活直接發(fā)揮殺傷賈第蟲的作用［13］。另一方面，某些非免疫因素能夠保護寄生蟲免受非特異性免疫損傷，例如腸液中的粘液成分能夠保護賈第蟲滋養(yǎng)體免受脂肪代謝產物的損傷，如果向乳汁中加入腸粘液也能消除乳汁對賈第蟲的殺傷作用［14］。

1．2 特異性免疫 大量的研究表明，宿主的細胞免疫和體液免疫在控制賈第蟲感染中都起了重要的作用。

1．2．1 體液免疫 低免疫球蛋白血癥患者感染賈第蟲后往往遷延不愈，說明抗體在宿主對抗賈第蟲的過程中起著一定的作用。鑒于賈第蟲寄生于腸腔中，不會直接進入體內，有理由相信，能夠分泌到腸腔中的分泌型IgA（sIgA）是發(fā)揮抗賈第蟲體液免疫的主力。sIgA不能激活補體，也不能介導調理吞噬作用，主要通過和賈第蟲結合抑制其粘附發(fā)揮作用。之后的研究顯示，IgA缺陷的小鼠雖然不能完全清除體內的賈第蟲，但能在一定程度上控制賈第蟲的感染，且控制效果較B細胞缺陷的小鼠更好，這說明IgA是控制和清除賈第蟲感染的重要因子，而其它類型抗體在控制賈第蟲感染方面也有一定的作用［15］。血清中的抗賈第蟲抗體對賈第蟲的殺傷作用依賴于補體的存在，含有賈第蟲抗體的人類血清在體外能夠殺滅超過98%的賈第蟲。但加入鈣離子螯合劑EDTA以及56℃0．5h滅活補體后抗血清對賈第蟲失去殺傷力［16］。但是由于賈第蟲寄生在腸道，腸道中無補體存在，且sIgA不能激活補體，因而無法通過上述途徑達到殺滅賈第蟲的效果。藉此考慮補體參與的裂解賈第蟲效應可能在限制賈第蟲入侵組織中起著重要作用［17］。

1．2．2 細胞免疫 T細胞缺陷小鼠不能控制賈第蟲感染并且特異性缺失CD＋4T細胞可以導致慢性賈第蟲感染，說明細胞免疫在抗賈第蟲感染中也起著重要的作用［18］。哺乳動物的腸道中有著豐富的淋巴細胞，主要分布在腸道固有層、集合淋巴小結以及上皮細胞層。這些粘膜淋巴組織的主要成分是各種類型的T細胞。由于從粘膜分離淋巴細胞的技術不夠成熟，早期有關抗賈第蟲細胞免疫的研究采用的都是外周血中分離的淋巴細胞。研究顯示，當采用賈第蟲抗原刺激外周血白細胞時淋巴細胞會發(fā)生明顯的增殖［19］。Singer SM等發(fā)現在抗賈第蟲細胞免疫中發(fā)揮作用的是αβT細胞，其作用方式不依賴B細胞的存在，而γδT細胞在其中根本不起作用［18］。

同時，研究人員也發(fā)現，T細胞對于賈第蟲感染作用的是一把雙刃劍，一方面對賈第蟲的感染具有一定的抑制作用，發(fā)揮作用的細胞主要為CD＋4T細胞；另一方面，增殖的CD＋8T細胞可以造成小腸粘膜細胞刷狀緣微絨毛的破壞以及雙糖酶活性的減弱，導致腸功能紊亂，可能參與賈第蟲病的發(fā)?。?1，20，22］。

2 賈第蟲的免疫逃避機制

2．1 賈第蟲的抗原漂變 表面抗原變異是病原微生物在宿主持續(xù)免疫壓力下維持感染狀態(tài)最重要的免疫逃避機制，參與慢性和反復感染的發(fā)生。賈第蟲的抗原漂變最早是在體外環(huán)境中被發(fā)現的。體外培養(yǎng)的不同種群賈第蟲會分泌不同抗原性的蛋白產物到培養(yǎng)基中，并且識別某種表面分子的特異性單克隆抗體只能和同一種群中個別賈第蟲細胞結合。這些證據都表明賈第蟲在生存過程中其表面抗原分子會發(fā)生改變，也說明賈第蟲在沒有任何免疫壓力的條件下即能發(fā)生抗原漂變［22］。

賈第蟲的抗原漂變在人類以及實驗動物的感染過程中也會發(fā)生。在感染過程中，滋養(yǎng)體的增殖產生不同表面抗原分子的賈第蟲亞群，雖然這些亞群的賈第蟲之后可以被免疫系統(tǒng)識別并消滅，但不斷產生的新表面分子可以防止感染被完全清除，并且在一定時間內某一賈第蟲表面僅表達一種抗原分子。依分離株的不同大約6．5～13．5代賈第蟲表面抗原分子會發(fā)生漂變，產生另一種抗原分子［23］。在抗原轉換過程中可以觀察到單個賈第蟲滋養(yǎng)體細胞上同時表達兩種抗原分子［24］。此時賈第蟲滋養(yǎng)體表面可以同時結合兩種標記單克隆抗體，持續(xù)大約15h，這一過程常常與滋養(yǎng)體向包囊或者包囊向滋養(yǎng)體轉化的過程同時發(fā)生［25］。

賈第蟲的抗原漂變主要依賴其表面的多樣表面蛋白（variant surface protein，VSP）實現的。VSP屬于I型整合膜蛋白，分子量20kD到200kD大小不等，位于賈第蟲表面，厚約18nm，覆蓋了包括鞭毛、腹吸盤、粗面內質網以及外周囊泡在內的整個蟲體。在體外培養(yǎng)中，VSP可以脫落到培養(yǎng)基中。VSP蛋白含高達11%～12%的半胱氨酸，主要分布于VSP的N末端，這些半胱氨酸以CXXC模體（C：半胱氨酸；X：任意氨基酸）形式存在，VSP中沒有游離的巰基存在。VSP的N末端部分可變度最高，是寄生蟲與環(huán)境作用的部分。不同VSP的區(qū)別主要在于N末端CXXC基序的差異。VSP的C末端相當保守，由38個氨基酸殘基構成，約90%的氨基酸殘基在各種VSP是完全相同的，包含一段長約23－25個氨基酸殘基的跨膜區(qū)。C末端的5個氨基酸殘基（CRGKA）位于胞漿中。VSP還包含有一段保守的GGCY基序以及一段或者幾段鋅指結構域。其中GGCY基序通常位于靠近C末端的胞外區(qū)，在某些VSP此段基序則位于N末端。此外，有研究報道VSP存在RING和LIM鋅指結構，存在鋅指結構的蛋白可能具有多種功能，其中之一就是作為轉錄因子，但VSP中鋅指結構的功能、VSP是否與Zn2＋結合并參與VSP空間結構以及生物學活性的維持仍然未知［24］。

大約25%的賈第蟲基因組編碼VSP蛋白，第一個vsp基因——TSA417于1990年被克隆并表達。隨著賈第蟲A組 WB克隆、B組GS／M－H7克隆以及E組P15克隆全基因組測序的完成，幾乎所有的VSP蛋白全序列均已獲得。從WB分離株中已鑒定出了303個vsp基因。在這303個vsp基因中，228個序列完整。這些基因成簇分布，分散在賈第蟲的五條染色體上。同大多數其他賈第蟲基因一樣，vsp基因沒有內含子，它們的啟動子相對較短且序列保守性較差，3′非翻譯區(qū)通常比較短，很少超過30個核苷酸。此外，vsp基因通常離端粒較遠，提示vsp基因的重組并不涉及同賈第蟲染色體基因組其它部位的轉位，而這種轉位現象在其它能夠產生抗原漂變的寄生蟲中經常出現。vsp基因的上游序列具有極高的相似性，據此推斷位于賈第蟲基因組中的vsp基因庫通過分離和重組完成vsp基因的重排，這個假設很快得到了證實。采用多克隆抗體鑒定VSP蛋白會產生強烈的交叉反應，一些同源性很高的VSP蛋白甚至可以被同一株單克隆抗體識別［26］。

雖然多個研究小組致力于發(fā)現賈第蟲抗原漂變的分子機制，目前為止，仍然未能解釋清楚這個調節(jié)機制究竟發(fā)生在基因組、轉錄還是轉錄后水平。在僅表達一種VSP的賈第蟲克隆中，只能檢測出一種VSP mRNA，說明盡管存在幾百種vsp基因，但同時僅有一個vsp基因被轉錄，而其他vsp基因處于沉默狀態(tài)。之后的研究顯示所有的vsp基因均被轉錄，但除了表達的那個vsp基因外，其它的mRNA被一種類似RNA干擾的機制降解掉。目前已經在賈第蟲鑒定出幾株microRNA能夠調控VSP的表達，并且推測在賈第蟲的基因組中，可能含有大量的microRNA編碼序列。在抗原漂變發(fā)生過程中，原本的vsp基因轉錄本消失，而另一株vsp基因的mRNA被保留而翻譯形成新的VSP。如果內源性RNA干擾系統(tǒng)參與賈第蟲的抗原多樣性表達，一個單一的vsp轉錄本如何跳過基因沉默機制，在抗原漂變的過程中，不同VSP的mRNA又是以何種機制完成過渡的，這些問題仍然函待解決［27－29］。

2．2 賈第蟲誘導的L－精氨酸（L－Arg）饑餓 在成年哺乳動物中，L－Arg被看做一種半必需氨基酸，大部分的L－Arg可以由L脯氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺合成。在一定生理和病理狀態(tài)下，自身生成的LArg不能滿足機體的需要，還需要食物提供。

L－Arg不僅是合成蛋白質的原料，還可以被不同的酶催化形成多種不同功能的生物活性物質。誘導型一氧化氮合成酶（NOS）是哺乳動物小腸上皮細胞代謝L－Arg最重要的酶，該酶可以催化L－Arg生成L瓜氨酸和NO，其中NO是一種高活性的自由基，參與維持上皮細胞的功能，在抗腫瘤以及先天免疫中起著重要作用。NO還是一種廣譜抗菌劑，可以對抗細菌和致病寄生蟲。除此之外還有許多其他功能，包括神經傳導、調節(jié)粘膜屏障的完整性以及腸道血管張力等［30］。此外，L－Arg在調節(jié)T細胞功能方面還有重要的作用。CD3ζ鏈是T細胞受體（TCR）中負責傳遞信號的部分，其正確組裝和表達對TCR發(fā)揮正常功能起著重要作用。L－Arg缺失能夠削弱抗原刺激后CD3ζ鏈的內化和再表達，并且抑制細胞因子的產生和細胞增殖。CD3ζ鏈信號傳導以及T細胞功能的異?？梢酝ㄟ^補充L－Arg得到恢復［16］。CD3ζ鏈的下調表達和對抗原或者絲裂原反應下調的關系已經在癌癥、慢性感染性疾病以及自身免疫病人中得到證實［32－33］。具體 L－Arg通過何種方式影響CD3ζ鏈的功能仍需進一步研究才能明確。

在單細胞生物中，營養(yǎng)耗竭戰(zhàn)術常被用來遏制消耗營養(yǎng)物質細胞的增殖。L－Arg在賈第蟲生長的早期和大多數增殖階段作為偏愛營養(yǎng)物質。賈第蟲利用精氨酸雙水解酶（ADH）途徑水解L－Arg作為能量的來源。這個途徑包括3個酶促反應步驟，涉及精氨酸脫亞氨酶（ADI），鳥氨酸氨甲酰轉移酶（OTC），以及氨基甲酸鹽激酶（CK），同時伴有ATP的生成。ADI和CK兩種酶在真核生物非常稀有，在高等動物中不存在。盡管1分子L－Arg僅能生成1分子ATP，但是賈第蟲利用這條途徑能夠較糖酵解途徑更快的獲得ATP。

L－Arg被NOS催化生成NO。小腸上皮細胞生成的NO能夠抑制賈第蟲生長、成囊以及脫囊。賈第蟲通過消耗腸道中的L－Arg，一方面抑制小腸上皮細胞的正常發(fā)育［34］，另一方面間接抑制上皮細胞生成NO，而小腸細胞中NO的水平對于調控水平的吸收和分泌具有重要意義，提示這可能與賈第蟲病的腹瀉癥狀相關［35］。賈第蟲和上皮細胞都有一套高效的L－Arg運輸系統(tǒng)，但賈第蟲的L－Arg運輸能力比上皮細胞強10－20倍。因此賈第蟲比宿主更高效的利用L－Arg。在賈第蟲中，L－Arg與瓜氨酸對向跨膜運輸，因此，賈第蟲對L－Arg代謝可以通過產生和輸出瓜氨酸而有效地促進自身的吸收。并且，瓜氨酸可以競爭性抑制上皮細胞對LArg的吸收，從而進一步抑制 NO 的生成［36］。Ringqvist E等人的研究顯示在體外，賈第蟲與腸上皮細胞接觸過程中，ADI、烯醇酶以及OTC可以被賈第蟲釋放到培養(yǎng)基中，直接降解環(huán)境中的L－Arg，進一步消耗用于生產NO的游離L－Arg［36］。除了非特異性免疫，賈第蟲還可以誘導宿主特異性免疫應答的發(fā)生。在多種細菌和其他寄生蟲實驗中發(fā)現，細胞環(huán)境中的L－Arg的耗盡可以導致T細胞反應性降低。盡管在賈第蟲病中還未有相關的研究，但有理由相信，賈第蟲可能通過ADI高效消耗LArg干擾TCR的功能，從而抑制T細胞產生特異性的、強烈的抗賈第蟲免疫反應。有關CD3ζ鏈動物模型中的研究將會闡明賈第蟲抑制T細胞免疫的分子機制。

再者，賈第蟲也能夠利用ADI逃避宿主的體液免疫反應。研究表明多種VSP蛋白的胞漿內C末端都是瓜氨酸化的。瓜氨酸是一種非標準氨基酸，自然界沒有能夠攜帶瓜氨酸的tRNA，蛋白中瓜氨酸都是翻譯后修飾的結果，在賈第蟲中，這一修飾作用有ADI行使。最近的研究顯示，抑制VSP的瓜氨酸化可以抑制VSP造成的抗原漂變，提高特異性抗體的殺傷能力，而高表達ADI能夠提高蟲體的抗原漂變能力，其具體機制仍有待進一步研究［37］。

此外，賈第蟲還可能通過其他一些途徑抑制宿主的免疫反應，例如，將賈第蟲與骨髓樹突細胞共培養(yǎng)可以抑制樹突細胞釋放IL－6、IL－10、IL－12等具有免疫調節(jié)功能的細胞因子，但其具體機制仍不清楚［10］。

綜上所述，賈第蟲的免疫逃避涉及多種復雜的機制，其中部分機制仍未十分明了，例如賈第蟲抗原漂變的調節(jié)機制、L－Arg饑餓對特異性免疫的影響機制等。并且，目前很多抗賈第蟲免疫的研究都是在血液免疫環(huán)境中進行的，例如補體、IgG、骨髓樹突細胞等作用的研究，這些物質通常并不存在于腸道中，真正腸道環(huán)境中的抗賈第蟲免疫機制及賈第蟲逃逸機制仍有待進一步的研究。作為腸道寄生蟲和寄生性原蟲的代表，對其免疫逃避機制的更深入研究，對于抗賈第蟲治療乃至其它腸道寄生蟲的治療方法提供十分重要的依據。

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