熊 翔,何 勇,劉煥煥,劉之恩,田志宏

(長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心,澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點實驗室,湖北 荊州 434025)

多胚現(xiàn)象是在一個胚珠中形成多個胚的現(xiàn)象,常被認(rèn)為是無融合生殖的象征[1]。目前,相關(guān)研究普遍認(rèn)為無融合生殖應(yīng)用于植物育種,可以有效固定優(yōu)良基因組合并保持雜種優(yōu)勢[2-6]。鑒于1925年Rodrigo和1928年Jones報道的水稻一籽多苗,以及1927—1928年Terada發(fā)現(xiàn)水稻一個胚珠中有2個胚囊存在的現(xiàn)象,國內(nèi)外研究人員多認(rèn)為水稻多胚苗的出現(xiàn)可能是無融合生殖的結(jié)果。中國早期水稻無融合生殖研究也一直聚焦于水稻多胚苗的篩選和鑒定,力求能獲得水稻無融合生殖的種質(zhì)資源,并用于水稻育種[7]。2010年,Puri等[8]報道了秈稻品種巴斯馬蒂370基因轉(zhuǎn)化事件中產(chǎn)生的一個高頻、可遺傳的多胚突變體(OsPE),經(jīng)分析發(fā)現(xiàn):該突變體是一個功能獲得性的突變體,多胚苗頻率可達(dá)15%～20%,多胚種子在突變體穗中隨機(jī)分布。繼而,通過Tail-PCR克隆了OsPE的全長cDNA,并將其定為水稻多胚的候選基因。隨后,Paul等[9]對OsPE突變體進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)分析。但是,NCBI檢索卻顯示OsPE為NST1應(yīng)激反應(yīng)蛋白。因此,OsPE基因是否能真正控制水稻多胚的產(chǎn)生,尚待進(jìn)一步研究。

目前,眾多研究表明,RNA選擇性剪接在植物的成花誘導(dǎo)[10]、晝夜節(jié)律(生物鐘)[11-12]和非生物脅迫響應(yīng)[13-16]等生長發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)過程中起著重要的作用。生物信息學(xué)初步分析顯示,OsPE基因在粳稻中存在3種可變剪接體,在秈稻中無可變剪接體。因此,通過分析水稻OsPE基因序列及其可變剪接體,有助于深入研究OsPE基因功能及其調(diào)控水稻多胚產(chǎn)生的分子機(jī)制——OsPE是否能真正控制水稻多胚的產(chǎn)生;或者,OsPE在水稻中存在可變剪接體,在其他剪接體的參與下,共同調(diào)控水稻多胚的產(chǎn)生;或者,OsPE另具功能。

本研究以粳稻品種日本晴和秈稻品種巴斯馬蒂370為研究材料,根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果設(shè)計特異引物,通過RT-PCR及TA克隆技術(shù)對OsPE基因的可變剪接體進(jìn)行鑒定,以確定其可變剪接體的真實存在,并進(jìn)一步利用生物信息學(xué)工具對其編碼蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析及功能預(yù)測,為后續(xù)深入研究該基因在水稻中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

粳稻品種日本晴(Oryzasativassp.Japonica cv.Nipponbare)和秈稻品巴斯馬蒂370(Oryzasativassp.Indica cv.Basmati 370),田間正常栽培管理。pCloneEZ-Blunt TOPO(Clone Smarter)平末端克隆載體,DH10B大腸桿菌菌株均由長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水稻分子生物學(xué)課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 取正常栽培條件下生長的日本晴和巴斯馬蒂370成熟葉片,采用TRIzol法提取RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中稻)說明書合成日本晴和巴斯馬蒂370成熟葉片cDNA第一鏈。

1.2.2OsPE可變剪接體分析及引物設(shè)計 Gramene(http://www.gramene.org/)數(shù)據(jù)庫資料顯示,OsPE基因在粳稻中存在3種可變剪接體,以a～c進(jìn)行區(qū)分(表1);在秈稻中無可變剪接體存在。根據(jù)粳稻中OsPE基因可變剪接體序列特征,利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)設(shè)計特異性引物(表2),由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司武漢分公司合成。

表1 水稻OsPE基因可能存在的3種可變剪接體Tab.1 Three putative splice variants of rice OsPE gene

表2 OsPE基因可變剪接體擴(kuò)增引物及擴(kuò)增產(chǎn)物信息Tab.2 Information of primers and PCR product in splice variants of OsPE gene

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增及目的片段純化回收 以1.2.1中合成的cDNA為模板,利用Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)高保真酶和表2所列引物對OsPE基因的可變剪接體進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增完成后,取5 μL PCR產(chǎn)物用于1.0%的瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)檢測,通過凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。剩余PCR產(chǎn)物經(jīng)FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)回收后,用于后續(xù)pCloneEZ-Blunt TOPO平末端克隆。

1.2.4 平末端克隆 利用pCloneEZ-Blunt TOPO Cloning Kit(Clone Smarter)試劑盒,將純化的目的片段與pCloneEZ-Blunt TOPO載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B菌株,挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定,陽性克隆送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司武漢分公司測序。

1.2.5OsPE基因可變剪接體表達(dá)分析 以1.2.1中合成的cDNA為模板,表2中所列引物對CDSOsPEaF/OsPEabc-qRTR、OsPEbF/OsPEabc-qRTR和OsPEcF/OsPEabc-qRTR,利用Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)高保真酶進(jìn)行OsPE基因可變剪接體半定量分析,進(jìn)一步利用qPCR驗證半定量分析結(jié)果。

1.2.6 OsPE蛋白進(jìn)化分析及功能預(yù)測 基于上述獲得的OsPE的可變剪接體對應(yīng)的蛋白序列,分別通過NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Gramene(http://www.gramene.org/)數(shù)據(jù)庫檢索OsPE可變剪接體編碼蛋白同源序列,并對檢索結(jié)果進(jìn)行分類匯總和多序列比對分析。根據(jù)查詢到的序列,采用MEGA 7.0對同源序列進(jìn)行蛋白進(jìn)化分析(MJ建模篩選出優(yōu)化模型JTT+G,Bootstrap=1000),并用Evolview(https://www.evolgenius.info/evolview/#/)進(jìn)行美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPE基因可變剪接體及RT-PCR特異引物位置

Gramene(http://www.gramene.org/)數(shù)據(jù)庫資料顯示,OsPE基因在粳稻中存在3種可變剪接體,a～c可變剪接體分別代表了LOC_Os03g13810.1、LOC_Os03g13810.2和LOC_Os03g13810.3。其中a剪接體的mRNA比b剪接體多了8 bp(即AA和CTCCAG);c剪接體的mRNA完整保留了a剪接體的第一內(nèi)含子序列,其CDS序列與a和b剪接體3′端序列完全相同。在秈稻中無可變剪接體存在。根據(jù)這些可變剪接體序列及結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計了RT-PCR擴(kuò)增的特異引物,位置如圖1所示。

圖1 OsPE基因可能存在的3種可變剪接體及引物位置Fig.1 Three putative splice variants of OsPE gene and their specific primer locations

2.2 OsPE基因可變剪接體的RT-PCR擴(kuò)增及克隆

通過RT-PCR引物OsPEabF/OsPEabcR和OsPEcF/OsPEabcR從日本晴和巴斯馬蒂370成熟葉片cDNA中均擴(kuò)增得到預(yù)期條帶(圖2-A),泳道1條帶大小與1 344 bp大小基本一致,初步說明可能包含a和(或)b剪接體;泳道2條帶大小與預(yù)期的1 304 bp大小基本一致,初步說明c剪接體的存在。取泳道1產(chǎn)物為模板,利用CDSOsPEaF/OsPEabcR和CDSOsPEbF/OsPEabcR引物對進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,也獲得了預(yù)期的PCR產(chǎn)物(圖2-B),泳道1為CDSOsPEaF/OsPEabcR引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物,大小與1 251 bp基本一致,初步表明a剪接體的存在,泳道2為CDSOsPEbF/OsPEabcR引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物,大小與1 245 bp基本一致,初步表明b剪接體的存在。

A:M.DL2000 DNA Marker,1.引物OsPEabF/OsPEabcR擴(kuò)增產(chǎn)物,2.引物OsPEbF/OsPEabcR擴(kuò)增產(chǎn)物;B:M.DL2000 DNA Marker,1.引物CDSOsPEaF/OsPEabcR擴(kuò)增產(chǎn)物,2.引物CDSOsPEbF/OsPEabcR擴(kuò)增產(chǎn)物。A:M.DL2000 DNA Marker,1.Amplification product of primers OsPEabF/OsPEabcR, 2.Amplication product of primers OsPEcF/OsPEabcR;B:M.DL2000 DNA Marker, 1.Amplification product of primers CDSOsPEaF/OsPEabcR, 2.Amplification product of primers CDSOsPEcF/OsPEabcR.

為進(jìn)一步確認(rèn)OsPE基因可變剪接體的真實存在,將上述CDSOsPEaF/OsPEabcR、CDSOsPEbF/OsPEabcR和OsPEcF/OsPEabcR引物對的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收,TA克隆后挑取陽性克隆測序驗證。序列比對結(jié)果顯示,從日本晴和巴斯馬蒂370成熟葉片cDNA中擴(kuò)增得到的片段與OsPE各剪接異構(gòu)體序列完全一致(圖3-A—C),這表明,OsPE的3種可變剪接體在粳稻中是真實存在的,OsPEc剪接體在秈稻中也真實存在,OsPEa和OsPEb是在秈稻中鑒定到的2種新剪接體。綜上所述,在水稻中成功鑒定到OsPE的3種可變剪接體。

圖3 OsPE基因可變剪接體序列比對結(jié)果Fig.3 Sequence alignment results of OsPE gene splice variants

2.3 OsPE基因可變剪接體表達(dá)趨勢分析

為了研究OsPE的生物學(xué)功能,選擇日本晴和巴斯馬蒂370成熟葉片,通過半定量分析和qPCR對OsPE不同可變剪接體進(jìn)行了表達(dá)趨勢分析。結(jié)果表明,OsPE各剪接體在正常生長條件下的日本晴和巴斯馬蒂370成熟葉片中存在表達(dá)差異,依次為OsPEc>OsPEa>OsPEb,但表達(dá)趨勢相同(圖4)。這一結(jié)果表明,OsPEc剪接體在OsPE基因功能發(fā)揮中可能占主導(dǎo)。

1,2,3.OsPEa、OsPEb和OsPEc可變剪接體。數(shù)據(jù)以3次生物學(xué)重復(fù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不同小寫字母表示OsPE各可變剪接體在0.05水平上有顯著差異(n=3,鄧肯檢驗)。1,2,3 .OsPEa,OsPEb, and OsPEc variable splices,respectively.The data were expressed as the mean±standard deviation of three biological replicates. Different lowercase letters indicated that there was a significant difference at 0.05 level among the variable splices of OsPE(n=3, Duncan test).

2.4 OsPE同源蛋白進(jìn)化分析及功能預(yù)測

分別通過NCBI和Gramene數(shù)據(jù)庫對鑒定到的OsPE基因可變剪接體進(jìn)行植物同源蛋白檢索。檢索結(jié)果涉及了雙子葉植物野生煙草(Nicotianaattenuata)和擬南芥(Arabidopsisthaliana),單子葉植物大麥(Hordeumvulgare)、短藥野生稻(Oryzabrachyantha)、秈稻(OryzasativaIndicaGroup)、粳稻(OryzasativaJaponicaGroup)、疣粒稻(Oryza meyerianavar.granulata)、黍(Panicum hallii)、柳枝稷(Panicum virgatum)、粟(Setaria italica)、狗尾草(Setaria viridis)、高粱(Sorghum bicolor)、普通小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)和沼生菰(Zizania palustris)共15個物種的44個同源蛋白。同源蛋白進(jìn)化樹顯示,OsPE在雙子葉植物和單子葉植物中存在不同的進(jìn)化路線,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5-A)。在單子葉植物中,OsPE僅在禾本科植物中存在同源蛋白,稻屬植物表現(xiàn)出與其他屬植物不同的進(jìn)化路線,在稻屬植物中高度保守(除短花藥野生稻外),蛋白序列一致性均高達(dá)99%以上(圖5-A)。同源蛋白比對匯總結(jié)果顯示,OsPE無典型保守結(jié)構(gòu)域,檢索到的同源蛋白大部分無功能注釋,有功能注釋的同源蛋白主要行使抗逆響應(yīng)、細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡等功能(圖5-B)。綜合同源蛋白比對和進(jìn)化樹分析結(jié)果來看,OsPE在禾本科,尤其是稻屬植物中高度保守,是稻屬植物所特有的一個功能基因,有待于進(jìn)一步研究該基因是否參與調(diào)控水稻抗逆響應(yīng)、細(xì)胞分裂及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能,而不是調(diào)控水稻多胚產(chǎn)生。

A.不同物種OsPE基因同源蛋白進(jìn)化樹;B.不同物種OsPE基因同源蛋白功能預(yù)測。A.Evolution tree of OsPE gene homologous proteins in different species; B.Functional prediction of OsPE gene homologous proteins in different species.

3 結(jié)論與討論

雖然Puri等[8]通過秈稻品種巴斯馬蒂370基因轉(zhuǎn)化事件中產(chǎn)生的多胚突變體(OsPE)研究將OsPE定為水稻多胚的候選基因,Paul等[9]也對OsPE突變體進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)分析,但OsPE基因的后續(xù)功能驗證未見報道,而且生物信息學(xué)初步分析顯示:OsPE基因在粳稻中存在3種可變剪接體,在秈稻中無可變剪接體,NCBI檢索顯示其為NST1應(yīng)激反應(yīng)蛋白。本研究選取來源于15個物種的44個同源蛋白,基于蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,對水稻OsPE基因編碼蛋白進(jìn)行了進(jìn)化分析及功能預(yù)測,發(fā)現(xiàn)OsPE蛋白在禾本科,尤其是稻屬中高度保守(蛋白序列一致性普遍高于99%),有功能注釋的同源蛋白與調(diào)控抗逆響應(yīng)、細(xì)胞分裂及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能相關(guān),而不調(diào)控多胚產(chǎn)生。因此,OsPE基因是否能真正控制水稻多胚的產(chǎn)生,尚待商榷,有待進(jìn)一步研究證明。

目前,眾多研究表明,植物和動物甚至人,盡管在形態(tài)和生理上有顯著差異,選擇性剪接作為以多種方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種基因調(diào)控機(jī)制,普遍存在于包括植物和人在內(nèi)的所有多細(xì)胞真核生物中[17-20]。選擇性剪接在植物的光形態(tài)建成[21]、成花誘導(dǎo)[10]、晝夜節(jié)律(生物鐘)[11-12]和非生物脅迫響應(yīng)[13-16]等生長發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)過程中起著重要的作用。本研究利用RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)合TA克隆及測序驗證,在粳稻品種日本晴中鑒定到了OsPE基因3種可變剪接體的真實存在,在秈稻品種巴斯馬蒂370中鑒定到2種新的可變剪接體。在對正常生長條件下的供試材料成熟葉片進(jìn)行半定量及qPCR分析時,發(fā)現(xiàn)OsPE基因可變剪接體存在表達(dá)差異,依次為OsPEc>OsPEa>OsPEb,且該基因在不同水稻品種中存在相同的表達(dá)趨勢。所以,是否由于OsPE在水稻中存在可變剪接體,在其他剪接體的參與下,共同調(diào)控水稻多胚的產(chǎn)生,有待進(jìn)一步研究,以挖掘其可能調(diào)控水稻多胚產(chǎn)生的分子機(jī)制。

綜上所述,水稻多胚候選基因OsPE可變剪接體的鑒定結(jié)果將為進(jìn)一步研究水稻OsPE基因的真實生物學(xué)功能或其可能調(diào)控水稻多胚產(chǎn)生的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),為后續(xù)的試驗研究提供必要的理論依據(jù)。