劉 超,孫天杰,劉 娜,陳 琰,王冬梅

(華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室,河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室,河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071001)

小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)是一種?；詷O強的活體營養(yǎng)型真菌,具有菌種變異快、分布范圍廣、毒性強等特點,其流行年份極易造成小麥(Triticumaestivum)大幅度減產(chǎn),對我國的糧食安全構(gòu)成潛在威脅[1]。因此,深入研究小麥抵御葉銹菌侵染的分子機制,挖掘廣譜的抗葉銹基因,可為培育抗葉銹小麥新品種提供分子水平的借鑒,對于提升小麥抗葉銹能力具有重要意義。

植物在抵御病原菌侵染的過程中,進(jìn)化出了一系列高效的防御機制,例如過敏性反應(yīng)(Hypersensitive response,HR)[2]、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)爆發(fā)[3]、病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)[4]的表達(dá)等。大量研究表明,病程相關(guān)蛋白在植物抵御病原菌侵染時發(fā)揮著重要作用。Jain等[5]根據(jù)PRs的序列相似性和功能聚類劃分了17個PRs家族。

類甜蛋白(Thaumatin-like proteins,TLPs)屬于病程相關(guān)蛋白5(PR5)[6],因與非洲水果竹芋中的甜味蛋白索馬甜(Thaumatin)的結(jié)構(gòu)域相似而被命名。研究發(fā)現(xiàn),TLPs蛋白可限制真菌菌絲發(fā)育,破壞真菌細(xì)胞壁,在寄主植物抵御病原真菌侵染時發(fā)揮著重要作用。Saeidi等[7]通過體外抗真菌活性試驗發(fā)現(xiàn),蒺藜苜蓿中的類甜蛋白MtTLP-1、2、3、4和5可顯著抑制鏈格孢菌的孢子萌發(fā),也可導(dǎo)致鐮刀菌、禾谷鐮孢菌和疫霉菌的菌絲發(fā)育畸形。Jiao等[8]借助掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),純化后的香蕉類甜蛋白BanTLP在體外可破壞青霉菌的細(xì)胞壁,導(dǎo)致青霉菌細(xì)胞滲透壓發(fā)生變化,進(jìn)而加速病原菌的死亡。Wang等[9]的研究發(fā)現(xiàn),小麥類甜蛋白1(TaTLP1)可與小麥病程相關(guān)蛋白1(TaPR1)發(fā)生互作。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)對小麥抗葉銹菌品種TcLr19中的TaTLP1基因進(jìn)行沉默,發(fā)現(xiàn)沉默植株中小麥對葉銹菌的抗性減弱并且H2O2積累降低。與此同時,體外分離純化的TaTLP1蛋白可顯著抑制葉銹菌孢子的萌發(fā)。Zhu等[10]通過分析番茄與疫霉菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選得到了番茄中的2個類甜蛋白基因Solyc08g080660和Solyc08g080670。利用基因編輯技術(shù)在番茄中敲除Solyc08g080660和Solyc08g080670后發(fā)現(xiàn),由疫霉菌引起的番茄晚疫病的發(fā)病程度升高。在番茄中過表達(dá)這2個基因后,病害程度降低。

河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室前期工作已經(jīng)證明,小麥中的翻譯控制腫瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)在小麥抵御葉銹菌侵染過程中發(fā)揮正調(diào)控作用[11]。為進(jìn)一步研究TaTCTP的功能機制,借助串聯(lián)親和純化(TAP)和質(zhì)譜(MS)技術(shù)篩選到一個與TaTCTP潛在互作的小麥類甜蛋白TaTLP8,并利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗證實了TaTCTP與TaTLP8之間存在相互作用[12]。在此基礎(chǔ)上,本研究通過構(gòu)建pET28a-TaTLP8-nosp原核表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和Ni-NTA柱純化獲得了純度較好的TaTLP8-nosp重組蛋白,并以其作為抗原注射新西蘭白兔制備了兔源多克隆抗體,使用該抗體利用Western Blotting技術(shù)檢測了TaTLP8蛋白在葉銹菌侵染小麥過程中的表達(dá)量變化,為進(jìn)一步研究TaTLP8在小麥與葉銹菌互作過程中的功能機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料與供試菌株 本試驗所用植物材料為小麥抗葉銹菌近等基因系TcLr26及其輪回親本Thatcher(Tc),葉銹菌生理小種為260,其中TcLr26×260為不親和組合,Tc×260為親和組合。所用原核表達(dá)載體為pET28a,大腸桿菌表達(dá)菌株為BL21(DE3)。以上試驗材料均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 試驗所用Anti-His Mouse抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、T4DNA連接酶和6×Protein Loading Buffer購自全式金生物技術(shù)(北京)有限公司。限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ 與BamH Ⅰ、高保真DNA聚合酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、Ni離子親和瓊脂糖凝膠、脫脂奶粉、IPTG購自生工生物工程(上海)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自諾唯贊生物科技(南京)有限公司。引物合成與基因測序由華大基因科技(北京)有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 TaTLP8生物信息學(xué)分析 根據(jù)前期質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲得的TaTLP8蛋白序列ID為TraesCS4D02G015800.1,使用蛋白家族數(shù)據(jù)庫Pfam和在線分析工具SignalP-6.0對TaTLP8的保守結(jié)構(gòu)域及信號肽進(jìn)行預(yù)測,隨后使用NCBI中Protein Blast功能在大麥(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)等物種中檢索與TaTLP8相似度較高的蛋白序列,并下載相關(guān)序列的FASTA文件,借助MEGA X軟件中ClustalW功能進(jìn)行序列比對,之后利用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹,設(shè)置Bootstrap檢驗次數(shù)為1 000。

1.2.2TaTLP8-nosp原核表達(dá)載體的構(gòu)建 真核蛋白中的信號肽在原核體系中往往難以加工,容易造成目的蛋白不能夠被表達(dá)[13],故本試驗使用去掉信號肽編碼區(qū)段的TaTLP8進(jìn)行原核表達(dá)。以攜帶TaTLP8編碼區(qū)全長的質(zhì)粒為模板[12],利用無信號肽區(qū)段(TaTLP8-nosp)設(shè)計的帶有BamH Ⅰ酶切位點的引物F:ggatccGCGACCTTCACCGTCATCAACA和帶有Hind Ⅲ 酶切位點的引物R:aagcttTCATGGGCAGAAGATGACCTGG擴增目的片段(小寫字母表示酶切位點)。隨后使用T4DNA連接酶連接至pET28a載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株,經(jīng)Kana抗性的培養(yǎng)基篩選陽性單克隆并提取質(zhì)粒,雙酶切驗證,將質(zhì)粒送至華大基因科技(北京)有限公司進(jìn)行測序。構(gòu)建完成的pET28a-TaTLP8-nosp重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中。

1.2.3 TaTLP8-nosp蛋白的誘導(dǎo) 將攜帶pET28a-TaTLP8-nosp重組質(zhì)粒的BL21單克隆菌株培養(yǎng)至OD600約0.4時,分別加入終濃度為0,0.005,0.025,0.050,0.075,0.100,0.125,0.150,0.175 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),以確定IPTG適宜的誘導(dǎo)濃度。吸取1 mL誘導(dǎo)后菌液,9 500 r/min離心1 min收集菌體,使用重蒸水溶解破碎菌體,得到菌體中總蛋白。借助6×Protein Loading Buffer煮沸10 min,進(jìn)行SDS-PAGE檢測。因TaTLP8-nosp重組蛋白中攜帶6×His標(biāo)簽,利用Anti-His一抗進(jìn)行Western Blotting檢測,具體檢測步驟可參考麻楠等[14]的方法。

為摸索合適的誘導(dǎo)溫度,根據(jù)上述預(yù)試驗確定的IPTG濃度,分別在20,28,37 ℃溫度條件下誘導(dǎo)TaTLP8-nosp蛋白的表達(dá),使用大腸桿菌蛋白提取液Ⅰ(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl,pH值 8.0)懸浮菌體,經(jīng)超聲破碎(功率130 W,超聲10 s,停止5 s,持續(xù)12 min),在4 ℃條件下9 500 r/min離心20 min分離上清(可溶性蛋白)和沉淀(包涵體)并進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 TaTLP8-nosp蛋白包涵體溶解及蛋白純化 在300 mL包涵體中加入30 mL大腸桿菌蛋白提取液Ⅱ(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、8 mol/L尿素,pH值8.0),超聲處理(條件同1.2.3),使包涵體充分溶解。隨后在4 ℃條件下9 500 r/min離心20 min,取出上清液,倒入提前灌裝好Ni離子親和瓊脂糖凝膠的層析柱中,依靠液體重力使上清液在層析柱中緩慢流出,該過程中目的蛋白可和介質(zhì)結(jié)合。接下來以濃度分別為0,20,50,100,250,500 mmol/L的咪唑流經(jīng)層析柱以競爭結(jié)合位點,洗脫目的蛋白,隨后進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.5 純化蛋白的定量 以不同濃度的牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn),對100 mmol/L咪唑洗脫后的目的蛋白的含量和純度進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R-250染色并拍照記錄。純化蛋白的總量需不小于2 mg且電泳檢測無明顯雜帶。隨后送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心進(jìn)行抗體的制備。

1.2.6 TaTLP8-nosp蛋白多克隆抗體的特異性檢測 多克隆抗體特異性檢測步驟,可參考1.2.4中的方法獲得純化的TaTLP8-nosp重組蛋白,隨后使用植物蛋白提取液(25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、NP-40 1 mL、丙三醇100 mL,pH值 7.0)提取接種葉銹菌后的小麥總蛋白。以制備的Anti-TaTLP8-nosp為一抗,分別在原核誘導(dǎo)TaTLP8-nosp重組蛋白和小麥總蛋白中對Anti-TaTLP8-nosp抗體的特異性進(jìn)行Western Blotting檢測。

1.2.7 Western Blotting檢測在小麥與葉銹菌互作中TaTLP8蛋白的表達(dá)變化 在溫室條件下(光照強度400 W/m2,光照時長14 h/d,溫度20～25 ℃)對培養(yǎng)7日齡的TcLr26和Tc的第一片真葉正面接種葉銹菌生理小種260,接種后分別在0,8,12,48,72,96 h剪取接種葉片,經(jīng)液氮速凍、研磨后使用植物蛋白提取液提取小麥總蛋白。以制備的Anti-TaTLP8-nosp為一抗,利用Western Blotting技術(shù)檢測TaTLP8蛋白在小麥與葉銹菌互作過程中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaTLP8的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

對前期研究中所獲得的TaTLP8基因的序列特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,該基因編碼區(qū)全長為702 bp(圖1-A),編碼233個氨基酸(圖1-B)(小寫字母表示信號肽位置)且N-端含有信號肽(圖1-C)。經(jīng)Pfam數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)TaTLP8含有一個Thaumatin結(jié)構(gòu)域(圖1-D)。通過在NCBI中檢索與TaTLP8蛋白相似度較高的序列,并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明(圖1-E),小麥TaTLP8(TraesCS4D02G015800.1)與大麥HvTLP8同源性較高。

A.TaTLP8基因編碼區(qū)序列;B.TaTLP8蛋白氨基酸序列;C.TaTLP8信號肽預(yù)測;D.TaTLP8保守結(jié)構(gòu)域;E.TaTLP8系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析;F.擴增TaTLP8-nosp片段;G.pET28a-TaTLP8-nosp重組質(zhì)粒酶切驗證。A.TaTLP8 gene coding sequence;B.TaTLP8 protein amino acid sequence;C.TaTLP8 signal peptide prediction;D.TaTLP8 conservative domain;E.TaTLP8 phylogenetic tree analysis;F.Amplification TaTLP8-nosp fragment;G.pET28a-TaTLP8-nosp recombinant plasmid enzyme-cut.

為制備TaTLP8蛋白的抗體,以攜帶TaTLP8基因編碼區(qū)全長的質(zhì)粒為模板,PCR擴增TaTLP8無信號肽區(qū)段(圖1-F),并對構(gòu)建后的pET28a-TaTLP8-nosp重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證(圖1-G),擴增和酶切后的條帶位置與預(yù)期(624 bp)基本一致,說明pET28a-TaTLP8-nosp原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 TaTLP8-nosp蛋白的表達(dá)分析

為確定合適的IPTG誘導(dǎo)濃度,以不同濃度梯度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),在37 ℃條件下將大腸桿菌培養(yǎng)至OD600約1.0,結(jié)果顯示(圖2-A),IPTG濃度達(dá)到0.100 mmol/L時蛋白表達(dá)量較好。為進(jìn)一步分析目的蛋白的表達(dá)情況,使用IPTG終濃度為0.100 mmol/L,在不同的溫度條件下誘導(dǎo)24 h,經(jīng)超聲處理后并離心分離上清與沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE檢測,發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中,且在28 ℃表達(dá)效果最佳(圖2-B)。以BSA(分子量約為66.45 ku)作陰性對照,借助Western Blotting檢測含His標(biāo)簽的TaTLP8-nosp蛋白,結(jié)果表明(圖2-C),在預(yù)期位置檢測到了明顯的印記信號,說明在上述誘導(dǎo)條件下TaTLP8-nosp重組目的蛋白被正確表達(dá)。

A.不同濃度的IPTG誘導(dǎo)TaTLP8-nosp表達(dá);B.不同溫度誘導(dǎo)TaTLP8-nosp的表達(dá);C.重組蛋白表達(dá)的Western Blotting檢測。A.Different concentrations of IPTG induced of TaTLP8-nosp;B.The expression of TaTLP8-nosp was induced by different temperature;C.Western Blotting detection of recombinant protein expression.

2.3 TaTLP8-nosp蛋白的純化與定量

經(jīng)2.2的誘導(dǎo)條件將TaTLP8-nosp蛋白在大腸桿菌中表達(dá),離心后收集菌體,利用大腸桿菌蛋白提取液Ⅱ溶解菌體并進(jìn)行超聲處理,然后在4 ℃下離心,取上清液。經(jīng)鎳離子親和瓊脂糖凝膠柱層析處理,發(fā)現(xiàn)流經(jīng)層析柱后的上清液中目的蛋白的含量明顯降低(圖3-A),說明TaTLP8-nosp蛋白上的His標(biāo)簽與介質(zhì)結(jié)合良好。隨后用不同濃度的咪唑競爭結(jié)合位點以洗脫目的蛋白,發(fā)現(xiàn)在濃度為100 mmol/L咪唑下洗脫效果最好(圖3-A,箭頭所示)。以不同濃度的BSA作為參考標(biāo)準(zhǔn),判斷目的蛋白純化后的含量。結(jié)果顯示(圖3-B),目的蛋白的純化量大于2 mg且泳道中無明顯雜帶,滿足制備抗體的要求。

A.TaTLP8-nosp蛋白純化;B.TaTLP8-nosp蛋白定量分析。A.Purification of TaTLP8-nosp protein;B.Quantitative analysis of TaTLP8-nosp protein.

2.4 TaTLP8-nosp抗體的特異性檢測

為分析TaTLP8-nosp多克隆抗體對重組蛋白結(jié)合的特異性,以TaTLP8-nosp多克隆抗體作一抗,進(jìn)行Western Blotting檢測。結(jié)果顯示(圖4-A),在抗體按照1∶12 000倍稀釋時,可檢測到明顯印記信號,而BSA中未檢測到信號。為進(jìn)一步驗證TaTLP8-nosp多克隆抗體在小麥中與TaTLP8結(jié)合的特異性,對從TcLr26葉片中提取的總蛋白進(jìn)行Western Blotting分析。結(jié)果顯示(圖4-B),當(dāng)抗體按照1∶2 000倍稀釋時,在小麥總蛋白中可檢測到TaTLP8的雜交信號,而BSA中沒有出現(xiàn)雜交信號。說明制備的多克隆抗體能夠特異識別小麥中的TaTLP8蛋白。

A.抗體對重組蛋白的特異性檢測;B.抗體對小麥總蛋白中TaTLP8的特異性檢測。A.Specific detection of antibody against recombinant protein;B.Specific detection of antibodies against TaTLP8 in wheat total proteins.

2.5 小麥與葉銹菌互作過程中TaTLP8蛋白的表達(dá)變化

為研究TaTLP8蛋白在小麥與葉銹菌不同親和性互作過程中的表達(dá)變化情況,在TcLr26和Tc接種葉銹菌生理小種260后不同時間取接種葉片并提取總蛋白,以經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色檢測的小麥大亞基(Rubisco)的含量作為上樣量標(biāo)準(zhǔn),利用上述研究中制備的多克隆抗體作為一抗,進(jìn)行Western Blotting檢測。結(jié)果顯示(圖5),不親和組合(TcLr26×260)中,從接種后8～96 h TaTLP8蛋白的表達(dá)量呈逐漸上升趨勢;而親和組合(Tc×260)中,在接種后0～12 h幾乎未檢測到該蛋白的表達(dá),在48 h后檢測到TaTLP8蛋白的表達(dá),隨后表達(dá)量趨于下降。以上結(jié)果表明,在小麥與葉銹菌互作過程中TaTLP8響應(yīng)葉銹菌的侵染,其表達(dá)量在2種組合中存在明顯差異,表明該蛋白可能與小麥對葉銹菌侵染的抵抗密切相關(guān)。

圖5 TaTLP8蛋白在葉銹菌侵染小麥過程中的表達(dá)變化Fig.5 Expression changes of TaTLP8 protein during Puccinia triticina infect wheat

3 結(jié)論與討論

TLPs是一個龐大而復(fù)雜的蛋白家族,在植物中廣泛存在并與宿主的防御反應(yīng)和發(fā)育過程有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),TLPs與植物抵抗多種病原真菌和昆蟲等生物脅迫方面具有重要作用[7-10,15-16]。除此之外,TLPs與植物抵御干旱、NaCl、重金屬、寒冷等非生物脅迫方面密切相關(guān)且往往發(fā)揮著積極作用[17-20]。經(jīng)對TLPs的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)TLPs一般是由3個保守結(jié)構(gòu)域組成,結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ間組成“V”形酸性裂縫,可能與TLPs參與生物/非生物脅迫、葡聚糖酶活性、潛在過敏源、誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡等生物學(xué)功能相關(guān)[21]。因此,深入研究TLPs在植物抵御逆境脅迫過程中的表達(dá)模式,有利于人們進(jìn)一步了解其在植物抗病過程中的功能及分子機制。

由于大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)具有試驗周期短、成本低、重組蛋白表達(dá)量大等特點被廣泛應(yīng)用。本研究中使用原核表達(dá)載體pET28a,該載體中含有改造λ噬菌體的T7啟動子,并在下游插入lac操縱子可嚴(yán)格控制重組蛋白的表達(dá)[22]。為在蛋白水平探究TaTLP8在小麥與葉銹菌互作過程中的表達(dá)變化,TaTLP8特異抗體的制備是必不可少的。本試驗首先借助原核表達(dá)技術(shù)獲得了大量的TaTLP8-nosp重組蛋白,但該蛋白主要以包涵體形式存在,為獲得純度較高的蛋白,參考相關(guān)文獻(xiàn)利用濃度為8 mmol/L的尿素使包涵體溶解[23],并根據(jù)該融合蛋白的6×His標(biāo)簽特性,經(jīng)Ni離子親和瓊脂糖凝膠柱層析純化后獲得了純度較高的重組蛋白,并以Anti-His為一抗,利用Western Blotting技術(shù)檢測了TaTLP8-nosp重組蛋白表達(dá)的正確性。將純化后的重組蛋白注射新西蘭大白兔獲得了TaTLP8-nosp的兔源多克隆抗體,且證明了該抗體的特異性較好。該抗體可在下一步應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)(Immune electron microscopy,IEM)研究TaTLP8在小麥中的定位情況,以及利用抗原-抗體特異結(jié)合原理篩選TaTLP8的互作蛋白并對其作用機制作深入研究,為人們進(jìn)一步了解TLPs提供借鑒,為全面闡釋小麥抵抗葉銹菌的分子機理奠定基礎(chǔ)。