趙勝男,高美欣,于朝杭,聶凱悅,王浩然,孟 杰,朱 虹,李 帥

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與林學(xué)院,山東 青島 266109;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東 青島 266109)

大豆是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,富含植物油和蛋白質(zhì),是一種不可或缺的食用和飼用雜糧。我國超過85%的大豆依賴進(jìn)口,主要原因是我國大豆產(chǎn)量低[1]。在耕地面積有限的情況下,提升大豆單產(chǎn)是促進(jìn)大豆生產(chǎn)的有效途徑。通過研究大豆功能基因,利用生物技術(shù)對大豆進(jìn)行定向改造,進(jìn)而提高大豆的單產(chǎn)水平,是提升大豆供給的重要途徑[2]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,越來越多的植物功能基因在生長發(fā)育過程中的作用得到揭示。

KH家族是一類含有KH保守結(jié)構(gòu)域的核酸結(jié)合蛋白,可以結(jié)合DNA或RNA,其KH結(jié)構(gòu)域含有70個保守的氨基酸殘基,廣泛存在于古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物[2-3]。人體中hnRNPK基因是人類發(fā)現(xiàn)的首個KH家族成員[4-5]。KH家族主要通過調(diào)控下游基因的剪接和轉(zhuǎn)錄,參與植物生長發(fā)育過程。在植物中,KH家族在擬南芥中已經(jīng)鑒定,含有30個成員。這些擬南芥KH基因分為3個亞家族,它們分別含有6,9,15個KH成員[6]。擬南芥KH家族多個成員功能已經(jīng)鑒定,主要參與RNA剪接和開花調(diào)控過程。例如,擬南芥KH家族成員AtRCF3(REGULATOR OF CBF GENE EXPRESSION 3)在特定組織中調(diào)控miRNA的生物合成,參與植物生長發(fā)育過程[7]。Atfly(FLOWERING LOCUS Y)突變體表現(xiàn)出開花時間提前的表型,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),AtFLY通過調(diào)控擬南芥MADS-box家族成員AtFLC(FLOWERING LOCUS C)的表達(dá)參與開花過程[8]。AtHEN4(HUA ENHANCER 4)通過調(diào)控AtFLC和AtMAF4(MADS AFFECTING FLOWERING 4)基因表達(dá)抑制擬南芥開花[9-10]。

AtFLK(FLOWERING LOCUS KH DOMAIN)屬KH家族成員,含有3個KH保守區(qū)域,通過自主途徑調(diào)控擬南芥開花時間[11-12]。AtFLK通過抑制AtFLC基因的表達(dá)調(diào)控植株開花時間。與野生型擬南芥相比較,Atflk突變體中正確剪接的AtFLC轉(zhuǎn)錄物高度積累,進(jìn)而導(dǎo)致AtFT(FLOWERING LOCUS T)和AtSOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1)表達(dá)量降低,延遲擬南芥開花時間[13-14]。AtPEP(PEPPER)是AtFLK的同源基因,參與擬南芥開花時間調(diào)控,與AtFLK存在拮抗作用,Atpep突變能夠回復(fù)Atflk突變體表型[15]。此外,AtFLK通過與其他蛋白相互作用,調(diào)控MADS-box家族成員AtAG(AGAMOUS)基因mRNA的加工,參與花形態(tài)的形成過程[16]。菊花CmFLK基因能夠回復(fù)擬南芥Atflk突變體晚花表型,同時CmFLK基因過表達(dá)能夠促進(jìn)擬南芥和菊花植株開花。CmFLK蛋白通過與CmERF110蛋白互作,調(diào)控CmLHY(LATE ELONGATION HYPOCOTYL)、CmGI(GIGANTEA)、CmCO(CONSTANS)和CmTOC1(TIMING OF CAB EXPRESSION 1)等生物鐘相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控菊花開花時間[17]。

大豆開花時間對大豆生產(chǎn)具有很大影響,因而研究大豆開花時間相關(guān)基因功能對于大豆定向改良具有重要意義。FLK基因在植物開花過程中具有重要作用,然而大豆GmFLK基因信息尚不清楚。本研究利用同源比對和聚類分析,克隆大豆GmFLK基因,并對其進(jìn)行亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式分析。該研究的開展將為后續(xù)解析大豆GmFLK參與開花期調(diào)控作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ),同時也為大豆定向遺傳改良提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及生長條件

試驗過程中選取的材料為大豆Williams 82(用于基因克隆及表達(dá)分析)和本氏煙草(用于亞細(xì)胞定位分析)。本氏煙草在培養(yǎng)室中培養(yǎng),光照時長16 h,黑暗時長8 h;光照時的溫度為22 ℃,黑暗時的溫度為20 ℃,濕度60%。大豆長日照生長條件為:光照時長16 h,黑暗時長8 h;光照時的溫度為25 ℃,黑暗時的溫度為25 ℃;短日照生長條件為:光照時長8 h,黑暗時長16 h,光照時的溫度為25 ℃,黑暗時的溫度為25 ℃。取生長20 d的Williams 82為試驗材料,從光照開啟后開始取樣,每隔4 h取1次,共取6次,每次取3個生物學(xué)重復(fù),用于基因表達(dá)分析。利用在山東青島大田中生長50 d的大豆植株,取花、葉、根、種子和莖等組織,用于分析目的基因表達(dá),每個樣品取3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 GmFLK基因生物信息學(xué)分析

利用擬南芥AtFLK(At3g04610)蛋白氨基酸序列,在Phytozome13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)網(wǎng)站上查找其同源關(guān)系最近的大豆基因,即GmFLK基因。從Phytozome13網(wǎng)站獲得GmFLK基因非編碼區(qū)、外顯子和內(nèi)含子序列,利用GSDS軟件(http://gsds.gao-lab.org/)分析GmFLK基因結(jié)構(gòu)[18]。為鑒定大豆GmFLK蛋白理化性質(zhì),利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)中ProtScale和ProtParam工具分析GmFLK蛋白氨基酸的理化性質(zhì)。利用NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Conserved Domains,選擇CD Search,輸入GmFLK氨基酸序列預(yù)測GmFLK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。為研究GmFLK蛋白結(jié)構(gòu),分別利用PSIPRED軟件和AIphaFold2軟件(https://alphafold.ebi.ac.uk/)預(yù)測GmFLK蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)[19-21]。

1.3 啟動子區(qū)域順式作用元件分析

為鑒定大豆GmFLK基因啟動子區(qū)域順式作用元件,從Phytozome13網(wǎng)站獲得GmFLK基因起始密碼子ATG上游2 000 bp區(qū)域堿基序列;然后利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)軟件對啟動子區(qū)域堿基序列進(jìn)行分析[22];最后根據(jù)其種類、位置、數(shù)量、序列和功能將其分別列出。

1.4 進(jìn)化樹分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中輸入擬南芥AtFLK氨基酸序列,查詢其在擬南芥、水稻、苜蓿、大豆、花生等植物中的同源蛋白,下載氨基酸序列。在分析親緣關(guān)系過程中,利用MEGA 7.0 軟件分析這些同源基因氨基酸序列,根據(jù)鄰接法(Neighbor-joining method)及默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[23]。

1.5 大豆GmFLK基因克隆及載體構(gòu)建

根據(jù)GmFLK基因CDS序列,設(shè)計無縫組裝引物用于擴(kuò)增目的基因(表1)。以大豆葉片cDNA為模板,構(gòu)建30 μL PCR擴(kuò)增體系,克隆GmFLK基因。PCR所用的高保真酶為擎科生物的2×T5 SUPER PCR MIX(COLONY),PCR擴(kuò)增程序如下:預(yù)變性95 ℃ 3 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共32個循環(huán);72 ℃延伸5 min。通過電泳得到擴(kuò)增的GmFLK基因片段,然后進(jìn)行產(chǎn)物純化。利用SacⅠ和BamHⅠ切割pCAMBIA1300(GFP)載體,得到線性載體。將純化的GmFLK基因片段和載體片段進(jìn)行無縫組裝,體系如下:取GmFLK基因片段1 μL,pCAMBIA1300線性載體4 μL,擎科生物-TreliefTMSoSoo Clonking Kit Ver 5 μL,后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用涂布器將大腸桿菌涂布在LB培養(yǎng)基上(含卡那霉素),在37 ℃下培養(yǎng)15 h左右。挑取單菌落,在37 ℃搖床上培養(yǎng)。5 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定,將陽性克隆進(jìn)行測序,測序成功后提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。步驟簡述如下:取1 μL質(zhì)粒加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞中,慢慢混合,低溫處理 5 min后液氮速凍5 min,迅速轉(zhuǎn)入37 ℃水浴5 min,然后加入1 mL YEP液體培養(yǎng)基,在28 ℃下輕輕搖動5 h,5 000 r/min離心2 min,倒去大部分上清液,重懸菌體,涂布在YEP固體培養(yǎng)基上,28 ℃倒置培養(yǎng)48 h后挑取單菌落,28 ℃振蕩培養(yǎng)5 h后利用菌液進(jìn)行PCR,將陽性克隆用于后續(xù)試驗。

1.6 GmFLK蛋白亞細(xì)胞定位分析

利用含有表達(dá)載體農(nóng)桿菌菌液,注射生長28 d的本氏煙草,在煙草中進(jìn)行GmFLK蛋白亞細(xì)胞定位分析[24]。過程簡述如下:取YEP固體培養(yǎng)基中3個直徑約2 mm的菌落接種到含有10 mL AB medium液體培養(yǎng)基中(含100 μm 乙酰丁香酮),28 ℃過夜培養(yǎng),4 000 r/min離心15 min收集菌體。用10 mL 1/2 MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含100 μm乙酰丁香酮)重懸清洗,重復(fù)2次,最后將菌液OD600值調(diào)整至0.8左右。將菌液裝入5 mL注射器內(nèi),從煙草下表皮進(jìn)行注射,以pCAMBIA1300空載體代替GmFLK表達(dá)載體的菌液作為對照。黑暗培養(yǎng)48 h后,利用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光在煙草葉片細(xì)胞中的分布情況。

1.7 大豆GmFLK基因表達(dá)分析

提取在不同光周期條件下生長大豆葉片以及大田中收獲的大豆不同組織的RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,進(jìn)行實時熒光定量PCR,具體步驟如下:將取好的樣品放入預(yù)冷的研缽內(nèi)磨為粉末狀,加入裂解液進(jìn)行離心。向裂解液中添加無水乙醇,轉(zhuǎn)移至Plant RNA Mini Column后離心,棄濾液。再依次添加600 μL Buffer RWA 、750 μL Buffer RWB,12 000 r/min離心后去除濾液。重復(fù)添加750 μL Buffer RWB,12 000 r/min離心1 min后棄濾液,將Plant RNA Mini Column的吸附柱轉(zhuǎn)移于2 mL Collection Tube上,12 000 r/min離心2 min后將Plant RNA Mini Column放置在新的RNase Free Tube,加入RNase Free Water靜置5 min后離心得到RNA,去除基因組DNA,得到反應(yīng)液。構(gòu)建20 μL反轉(zhuǎn)錄體系,反應(yīng)液10 μL,5×EvoM-MLV RT Reaction Mix 4 μL,RNase free water 6 μL。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA,進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。運(yùn)用熒光定量PCR儀器(QuantStudioTM5 System)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。構(gòu)建10 μL的反應(yīng)體系,ZXSYBR?Green Pro TaqHS Premix(ROX Plus)5 μL,大豆Williams 82不同時間段的cDNA 0.5 μL,上下游引物分別為0.5 μL,RNase free water 3.5 μL。擴(kuò)增程序為:保溫階段溫度設(shè)定為95 ℃,時間為30 s,PCR階段溫度設(shè)定為95 ℃,5 s和60 ℃,30 s,共40個循環(huán)。最后利用大豆基因GmCons4作為內(nèi)參[25],采用2-ΔΔCt計算GmFLK基因表達(dá)量。實時熒光定量PCR引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmFLK生物信息學(xué)分析

為克隆大豆GmFLK基因,利用擬南芥AtFLK氨基酸序列,在Phytozome13網(wǎng)站上通過同源比對查詢大豆同源蛋白,獲得AtFLK同源基因Glyma.19g246200,將其命名為GmFLK。GmFLK屬于KH-I亞家族,含有保守的KH domain(圖1-A)。GmFLK基因全長6 806 bp,編碼區(qū)域為1 341 bp,含有6個外顯子,5個內(nèi)含子(圖1-B)。編碼446個氨基酸,分子量大小為47.031 ku,等電點(diǎn)為5.46,為酸性蛋白。GmFLK蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為43.87,其分子式為C2072H3258N580O645S13,蛋白質(zhì)脂溶性指數(shù)為78.09。利用ProtScale軟件分析GmFLK氨基酸序列,結(jié)果表明,GmFLK蛋白為親水性蛋白,其第9個位點(diǎn)親水性最好,數(shù)值為-2.222,第340個位點(diǎn)疏水性最好,數(shù)值為1.611。為進(jìn)一步了解GmFLK蛋白結(jié)構(gòu),對其二級和三維結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明,GmFLK蛋白主要由3種結(jié)構(gòu)組成:α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲(圖2-A),它們在GmFLK蛋白中所占比例分別為:24.44%,14.80%和60.76%。利用AlphaFold2軟件預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,GmFLK蛋白的三維結(jié)構(gòu)所含α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲數(shù)量與二級結(jié)構(gòu)吻合(圖2-B)。

圖1 GmFLK基因保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

圖2 GmFLK蛋白二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2 GmFLK親緣關(guān)系分析

為鑒定GmFLK親緣關(guān)系,利用擬南芥AtFLK氨基酸序列查詢水稻、苜蓿、花生和玉米等植物中同源蛋白,獲得其親緣關(guān)系較近蛋白用于進(jìn)化樹分析,分別為:擬南芥At3g04610、At4g26000、At5g15270、At1g51580,大豆Glyma.03g248200、Glyma.19g162000、Glyma.10g033900,水稻Os03g42900、Os12g40560、Os10g41440、Os10g27470,苜蓿Medtr1g070380、Medtr7g115340、Medtr4g127380、Medtr2g038020,花生ArahyUPVY9X、ArahyQL2VNI、ArahyNIEN0T、Arahy-E4TWYF,玉米Zm00001d013712T009、Zm00001-d013712T004、Zm00001d030968T006。利用MEGA 7.0軟件分析這些蛋白的氨基酸序列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。由系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出,與大豆GmFLK同源關(guān)系最相近的是大豆Glyma.03g248200,且Glyma.03g248200與擬南芥AtFLK氨基酸序列相似性為51.51%。其次為苜蓿Medtr7g115340和花生ArahyUPVY9X、ArahyQL2VNI(圖3)。為鑒定GmFLK與其同源蛋白的相似性,將GmFLK與其同源關(guān)系較近的蛋白進(jìn)行比對分析,包括擬南芥At3g04610、大豆Glyma.03g248200、苜蓿Medtr7g115340和花生ArahyUPVY9X、ArahyQL2VNI,結(jié)果顯示,它們的相似性分別為52.22%,96.41%,80.89%,75.81%和76.63%(圖4)。

圖3 GmFLK系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖4 GmFLK蛋白及其同源蛋白序列比對

2.3 GmFLK啟動子順式作用元件分析

為解析GmFLK基因的潛在功能,對其啟動子區(qū)域順式作用元件進(jìn)行分析。共發(fā)現(xiàn)10類順式作用元件,分別為ARE、TGACG-motif、CAAT-box、TATA-box、Box 4、GATA-motif、GT1-motif、I-box、Sp1、circadian(表2)。這些順式作用元件按照其功能,主要可以分為3大類,分別為逆境相關(guān)元件(對厭氧誘導(dǎo)順式作用元件、參與MeJA響應(yīng)的順式作用調(diào)控元件)、啟動子基本元件(啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域常見的順式作用元件、核心啟動子元素在轉(zhuǎn)錄開始的-30左右)、光反應(yīng)相關(guān)元件(參與光響應(yīng)的保守DNA模塊的一部分、光響應(yīng)元件的一部分、光敏元件、參與晝夜節(jié)律控制的順式作用調(diào)節(jié)元件)。這三類元件含有的數(shù)量分別為3,42,10個(表2)。在上述10類順式作用元件中,有6類與光反應(yīng)有關(guān),分別為Box 4、GATA-motif、GT1-motif、I-box、Sp1和circadian,因而推測GmFLK基因可能參與生物鐘或光反應(yīng)相關(guān)途徑。

表2 GmFLK啟動子區(qū)域順式作用元件分析

2.4 GmFLK基因表達(dá)分析

為研究GmFLK基因表達(dá)模式,利用實時熒光定量PCR分析GmFLK基因在不同組織表達(dá)(圖5-A)。結(jié)果表明,GmFLK基因在花、葉、根、種子、莖組織中均有表達(dá),但表達(dá)量有所不同。GmFLK基因在大豆葉和種子中表達(dá)量相對較高,在花中表達(dá)量相對較低。因而推測GmFLK可能在不同組織中具有不同的功能。由于GmFLK啟動子區(qū)域含有多個光反應(yīng)元件,因而對GmFLK基因在不同光周期條件下一天不同時間點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行分析。對生長在長短日照的大豆葉片進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)GmFLK基因在長日照和短日照條件下表達(dá)沒有明顯差異,表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。然而GmFLK在一天中不同時間點(diǎn)表達(dá)量不完全相同,在光照4 h表達(dá)量最低,在光照0,12 h時表達(dá)量較高,因而推測GmFLK可能參與生物鐘相關(guān)功能途徑(圖5-B)。

A.GmFLK基因在不同組織表達(dá)分析;B.GmFLK基因在不同光周期條件下表達(dá)分析:0～20為光照開啟后取樣時間,LD.長日照,SD.短日照。A.The expression of GmFLK gene in different tissues;B.The expression of GmFLK gene throughout the day under different photoperiod conditions:0—20 indicate the time after lights on,LD.Long day condition,SD.Short day condition.

2.5 GmFLK亞細(xì)胞定位分析

為分析GmFLK亞細(xì)胞定位,利用GmFLK基因序列設(shè)計引物,以大豆Williams 82材料cDNA為模板,擴(kuò)增GmFLK基因,并利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(表1、圖6-A)。擴(kuò)增片段測序后與大豆基因組數(shù)據(jù)庫中GmFLK的CDS序列進(jìn)行比對,序列完全一致,利用該片段進(jìn)行后續(xù)載體構(gòu)建。為構(gòu)建35S∷GmFLK∶GFP載體,利用限制性內(nèi)切酶切割目的載體(圖6-B),然后與GmFLK片段連接。轉(zhuǎn)入大腸桿菌,并進(jìn)行菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定(圖6-C、D),經(jīng)測序后確認(rèn)載體構(gòu)建成功(圖7)。

A.GmFLK基因PCR擴(kuò)增電泳圖:M.DL2000 Marker,1—4.GmFLK基因CDS片段擴(kuò)增,約1 300 bp;B.pCAMBIA1300空載體和GmFLK表達(dá)載體經(jīng)Sac Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切:M.DL10000 Marker,1.pCAMBIA1300未酶切質(zhì)粒,2.pCAMBIA1300經(jīng)Sac Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切后的線性質(zhì)粒,3.GmFLK表達(dá)載體未酶切質(zhì)粒,4.GmFLK表達(dá)載體經(jīng)Sac Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切后的線性質(zhì)粒;C.GmFLK表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌:M.DL2000 Marker,1.陽性對照,2.陰性對照,3—6.單克隆菌液PCR;D.GmFLK表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌:M.DL2000 Marker,1.陽性對照,2.陰性對照,3—6.單克隆菌液PCR。A.Amplification of GmFLK gene:M.DL2000 Marker,1—4.Amplification of GmFLK CDS fragment,approximately 1 300 bp;B.pCAMBIA1300 and GmFLK expression vector plasmid digested using SacⅠand BamHⅠ:M.DL10000 Marker,1.pCAMBIA1300 plasmid,2.pCAMBIA1300 plasmid digested using SacⅠand BamHⅠ,3.GmFLK expression vector,4.GmFLK expression vector digested using SacⅠ and BamHⅠ;C.Transformation of GmFLK gene into Escherichia coli:M.DL2000 Marker,1.Positive control,2.Negative control,3—6.PCR of clones;D.Transformation of GmFLK gene into Agrobacterium tumefaciens:M.DL2000 Marker,1.Positive control,2.Negative control,3—6.PCR of clones.

圖7 GmFLK基因亞細(xì)胞定位載體模式圖

將測序正確的GmFLK基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101,進(jìn)行菌液PCR(圖6-D),結(jié)果表明,GmFLK基因已成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。為檢測GmFLK蛋白亞細(xì)胞定位情況,將其注入本氏煙葉片中,以pCAMBIA1300空載體作為對照。使用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光在煙草細(xì)胞中的分布情況。結(jié)果表明,pCAMBIA1300空載體的綠色熒光信號在煙草細(xì)胞各個部位都有表達(dá),包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。在注射 pCAMBIA1300-GmFLK載體葉片細(xì)胞中,綠色熒光的分布于空載體十分相似,因而推測GmFLK蛋白也在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中均有表達(dá)(圖8)。

圖8 GmFLK蛋白亞細(xì)胞定位分析

3 結(jié)論與討論

大豆基因組在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了2次全基因組復(fù)制,產(chǎn)生多個復(fù)制基因,其功能在植物生長發(fā)育過程可能具有冗余[26-27]。進(jìn)化樹分析顯示,GmFLK、Glyma.03g248200與擬南芥AtFLK位于同一進(jìn)化分枝,均為擬南芥AtFLK同源蛋白,且GmFLK、Glyma.03g248200與擬南芥AtFLK氨基酸序列相似性分別為52.22%,51.51%。因而大豆GmFLK、Glyma.03g248200可能與擬南芥AtFLK基因具有相似的功能,參與植物開花調(diào)控過程。大豆GmFLK與Glyma.03g248200相似性為96.41%,且在大豆中同源關(guān)系最近,因而GmFLK與Glyma.03g248200可能來源于同一個祖先,在功能上具有一定的冗余。

蛋白亞細(xì)胞定位對蛋白功能具有重要的作用。FLK蛋白主要參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,如細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄、剪接調(diào)控,同時也能參與細(xì)胞質(zhì)中少量RNA的修飾調(diào)控作用[11,17]。前人研究結(jié)果顯示,擬南芥AtFLK和菊花CmFLK蛋白也是主要定位在細(xì)胞核中,同時在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá),可能與其功能存在密切關(guān)系[11-12,17]。研究發(fā)現(xiàn),GmFLK蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá),但是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中也有表達(dá)。表明大豆GmFLK蛋白與其他物種中的FLK蛋白的定位結(jié)果相似,推測它們可能具有相類似的功能。

順式作用元件是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn),在植物基因表達(dá)過程中具有非常重要的作用[28]。此外,基因表達(dá)除受順式作用元件調(diào)控外,還會受到表觀遺傳學(xué)等多種因素調(diào)控[29]。菊花CmFLK能夠促進(jìn)擬南芥和菊花植株開花,并且生物鐘相關(guān)基因在CmFLK轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)發(fā)生改變,因而CmFLK在生物鐘反應(yīng)過程中具有重要的作用[17]。擬南芥AtFLK基因在擬南芥中調(diào)控途徑逐漸解析,其主要通過2個途徑調(diào)控AtFLC基因表達(dá)。首先擬南芥AtFLK基因可能通過結(jié)合AtFLC基因mRNA調(diào)控AtFLC的表達(dá),參與自主途徑調(diào)控開花時間;其次AtFLK可能通過促進(jìn)AtTGA7(TGACG-binding family 7)調(diào)控AtFLC基因表達(dá)[14,30-31]。GmFLK啟動子區(qū)域含有多種生物鐘和光反應(yīng)相關(guān)作用元件,并且GmFLK基因在不同時間點(diǎn)表達(dá)不同,因而GmFLK基因在生物鐘反應(yīng)過程中具有重要的作用。與擬南芥類似,大豆中GmFLK基因也可能通過調(diào)控GmFLC和GmTAG7等基因的表達(dá),參與大豆自主途徑調(diào)控開花時間。然而GmFLK基因在長日照和短日照條件下表達(dá)相似,因而GmFLK可能不參與光周期反應(yīng)過程。此外,擬南芥AtFLK除參與調(diào)控開花時間外,還參與抗病過程。擬南芥Atflk突變體表現(xiàn)為對細(xì)菌病原體丁香假單胞菌抗性降低,對壞死性真菌病原體灰霉病的抗性增加[32]。GmFLK啟動子區(qū)域除生物鐘、光反應(yīng)和啟動子固有元件外還含有逆境相關(guān)元件,因此,GmFLK是否還具有其他功能需要進(jìn)一步研究。

植物功能基因在生長發(fā)育過程中具有重要的作用,鑒定和解析植物功能基因作用機(jī)制,對于定向改造植物具有重要意義。本研究從大豆中克隆了一個KH家族成員編碼基因。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,該蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中具有表達(dá)。進(jìn)化分析表明,GmFLK為擬南芥AtFLK的同源蛋白,推測它們可能具有類似的功能。啟動子元件分析發(fā)現(xiàn),GmFLK基因啟動子中包含了多種與光反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。表達(dá)分析結(jié)果顯示,GmFLK在不同組織器官中具有表達(dá),但表達(dá)水平有差異。同時GmFLK基因在長日照和短日照條件下表達(dá)模式相似,但在一天中不同時間點(diǎn)表達(dá)量不完全相同。由此推測,該基因可能參與生物鐘反應(yīng)過程。本研究為深入研究GmFLK基因調(diào)控開花期相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。