宋媛媛 夏輝 趙雁林

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)的耐藥性可以通過表型藥物敏感性試驗(phenotypic drug susceptibility testing,pDST)或基因型藥物敏感性試驗(genotypic drug susceptibility testing,gDST)進行檢測。商品化gDST檢測具有診斷時間更短、易于使用和生物安全風險更低的特點,但目前覆蓋的藥物有限。全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)能夠預測更多藥物耐藥,但當耐藥分子機制還不完全清楚時仍然需要pDST方法進行檢測。

pDST方法繁多,在當前gDST廣泛應用的背景下,部分pDST藥物結果的準確性受到挑戰(zhàn),且因方法間報告結果不一致,導致pDST結果解讀和應用更加復雜。另外,pDST中MTB的耐藥性是基于臨界濃度(critical concentration)判斷其對藥物敏感或耐藥的。臨界濃度是指抗結核藥物在體外能夠抑制99%[吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)為90%]表型野生型(phenotypically wild-type,pWT)MTB菌落生長的最低濃度[1]。先前設定抗結核藥物臨界濃度的方法不同于其他病原菌使用的方法[2-5],一些藥物的準確性和可重復性較差,迫切需要更新臨界濃度,且隨著一些新型藥物如貝達喹啉(bedaquiline,Bdq)、德拉馬尼(delamanid,Dlm)等的出現(xiàn),需要制定針對這些新藥的pDST臨界濃度以便提供耐藥性檢測。鑒于抗結核藥物臨界濃度的復雜性,以及基于現(xiàn)有臨界濃度對于結果解讀的影響,筆者針對我國常用pDST方法、設定pDST臨界濃度方法的歷史及進展、在特定臨界濃度下臨界耐藥[borderline resistant;某些耐藥相關突變菌株最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)分布與pWT MIC分布顯著重疊,即其對應的MIC值接近或低于pDST方法的臨界濃度]對pDST結果的影響進行系統(tǒng)總結,為結核病實驗室技術人員和臨床醫(yī)生合理選擇檢測方法、正確解讀報告檢測結果及加強更新臨界濃度的研究提供借鑒。

一、目前我國常用的MTB pDST方法

(一)固體比例法DST

1963年Canetti等[6]提出了MTB DST比例法,后幾經(jīng)修改,目前基于改良羅氏(L?wenstein-Jensen,L-J)培養(yǎng)基的傳統(tǒng)固體比例法DST是我國最常用的檢測MTB藥物敏感性的方法。該方法在2支相同臨界濃度含藥培養(yǎng)基上分別接種高低2個濃度MTB菌液(最終接種菌量約為10-4mg/支和10-6mg/支),同時接種2支空白對照培養(yǎng)基,通過計算含藥培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長菌落數(shù)量之間的百分比來推斷菌株對藥物的敏感性。當這一比例≥1%時,該菌株被判為耐藥。

(二)液體DST方法

基于分枝桿菌生長指示管(mycobacteria growth indicator tube, MGIT)的快速液體DST方法同樣是基于比例法原理,空白對照培養(yǎng)管MTB接種量為含臨界濃度藥物培養(yǎng)管的1%(PZA為10%)。將稀釋后的工作菌液(最終接種菌量約為5×10-2mg)接種至含藥培養(yǎng)管中,同時將工作菌液稀釋100倍(PZA稀釋10倍)接種到空白對照培養(yǎng)管(最終接種菌量約為5×10-4mg,PZA約為5×10-3mg)中。通過儀器定時監(jiān)測培養(yǎng)管底部發(fā)出的熒光信號來預測細菌生長[7]。當空白對照培養(yǎng)管中的生長單位(growth unit,GU)值達到400時(4～13 d,PZA為4～21 d),儀器自動檢測含藥培養(yǎng)管中的GU值,如果含藥管的GU值<100,將自動判為敏感,如果GU值≥100,判為耐藥[8-9]。

(三)微量肉湯稀釋平板DST法

微量肉湯稀釋平板法(常被稱為“微孔板法”)[10]是基于微量肉湯稀釋法原理的DST方法,使用96孔微孔板通過倍比稀釋一系列藥物濃度來確定可以抑制99%肉眼可見細菌生長的MIC。每塊微孔板可以同時檢測多種抗結核藥物[11]。除了提供二分類(敏感/耐藥)定性結果外,微孔板法還可以確定菌株對抗結核藥物的耐藥水平(MIC值),為臨床醫(yī)生提供量化的耐藥信息。

二、設定MTB pDST折點方法的歷史及進展

抗菌藥物折點(breakpoint)是用來判斷病原菌對藥物敏感、中介或耐藥的MIC[12],是臨床醫(yī)生選擇抗菌藥物治療病原菌感染的一個重要依據(jù)。在歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)和一些文獻中常被稱為臨床折點(clinical breakpoint)[13-16],但結核病領域的世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)指南中針對莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)設置了一個高于臨界濃度(0.25 μg/ml)的藥物濃度(1.0 μg/ml),也被稱為臨床折點[1],它可以區(qū)分Mfx低濃度耐藥或高濃度耐藥,指導臨床通過增加Mfx劑量克服較低劑量時觀察到的耐藥性。為了避免兩者混淆,本文中統(tǒng)一使用“折點”一詞,對應于以往MTB pDST中的“臨界濃度”一詞,而“臨床折點”特指MTB pDST中Mfx較高的藥物濃度。

(一)既往MTB pDST設定折點的方法

“折點”即“臨界濃度”,臨界濃度是pDST使用某一方法/培養(yǎng)基獲得可解釋結果的標準[17]。設定適宜的臨界濃度可使pDST結果最大程度反映臨床療效,提高二者相關性。當患者MTB菌株在含臨界濃度藥物的培養(yǎng)基上有1%(PZA為10%)及以上菌落生長(產(chǎn)生耐藥),該藥物就不能(或很快不能)用于后續(xù)的抗結核治療。

Canetti[18]首先描述了最初設定臨界濃度的方法:選取至少100株來自于從未接受過治療的新患者的定義為“可能敏感(probable susceptible,PS)菌株”和至少50株來自于接受6個月以上含有相應藥物的治療方案且明顯失敗的患者的定義為“可能耐藥(probable resistant,PR)菌株”,通過比較不同藥物濃度下PS和PR菌株的敏感性累積百分比設定臨界濃度,將能最大程度區(qū)分PS和PR菌株敏感性的濃度設定為該藥物的臨界濃度[19-20]。藥物的臨界濃度隨使用的培養(yǎng)基(檢測方法)不同而變化,這取決于藥物在不同培養(yǎng)基中的活性。使用這種方法設定臨界濃度也存在一定局限性:(1)結核病的標準治療是采用聯(lián)合用藥方式,因此,無法獲得應用單個藥物的臨床療效數(shù)據(jù)[13],造成選取的PR菌株無法明確是哪個(些)藥物耐藥造成患者治療失敗;(2)缺乏藥代動力學/藥效學(pharmacokinetic/pharmacodynamics,PK/PD)數(shù)據(jù)的支持[21];(3)對于PZA來說,它將高達10%的PZA野生型MTB菌株歸類為耐藥[13]。因此,目前MTB pDST使用的臨界濃度是源于臨床實用性和歷史原因提出的[2],在很大程度上是基于共識[13,17,22],缺乏堅實的科學基礎。

(二)新的MTB pDST設定折點的方法

新的MTB pDST設定折點的方法是參考其他病原菌設定折點的方法,結合pWT菌株MIC分布、臨床療效和PK/PD數(shù)據(jù)設定[13-14]。這里的pWT菌株必須是基因型野生型(genoypically wild-type,gWT)菌株。然而需要注意的是,并非所有gWT菌株的基因序列都是相同的,因為可能含有與耐藥無關的基因突變,而這些突變并不改變菌株的MIC值(如gyrAS95T突變不影響氟喹諾酮類藥物的MIC值)[1]。

將一定數(shù)量的pWT菌株MIC分布中的最高MIC值稱為流行病學臨界值(epidemiological cut-off value,ECOFF)[1]。設定ECOFF時[23],需要收集匯總來自多個實驗室使用標準化方法獲得的足夠數(shù)量的pWT菌株MIC值,繪制一個單一峰的高斯分布(正態(tài)分布)圖,即pWT分布,ECOFF對應于通過觀察或統(tǒng)計學方法獲得的pWT分布的最高MIC值(即通常抑制99%的pWT菌株的值),通常寫為Xmg/L(或μg/ml),野生型菌株則寫為≤Xmg/L,非野生型為>Xmg/L。ECOFF以最大限度降低了設置折點的風險,從而將pWT菌株MIC分布區(qū)分出敏感和耐藥。

由于抗結核治療是聯(lián)合用藥,很難獲得單個藥物的臨床療效和PK/PD數(shù)據(jù)。因此,應用其他病原菌設定折點的方法來設定MTB的折點是相對困難的。2004年起一些學者開始使用結核病體外中空纖維系統(tǒng)模型(the hollow fiber system model of tuberculosis)與蒙特卡羅(Monte Carlo)模型相結合進行結核病藥物PK/PD研究[24-26]。通過0～24 h濃度-時間曲線下面積(0-24 area under the concentration-time curve,AUC0-24)與MIC的比值,即AUC0-24/MIC來設定臨界濃度[25,27]。因此,目前MTB折點可能主要基于野生型菌株患者的臨床療效、體外PK/PD模型和MIC分布中的ECOFF設定。這其中ECOFF顯得尤為重要,可以說ECOFF是定義折點的基石[13-14]。

(三)對MTB pDST臨界濃度的修訂進展

目前,MTB pDST有些藥物的臨界濃度值將pWT分布一分為二[13],導致DST的可重復性差;有些臨界濃度值遠高于pWT分布的MIC[13],且缺乏可支持的臨床證據(jù),導致一些耐藥菌株被判為敏感(假敏感);而2018年以前,一些新藥如Bdq、Dlm、氯法齊明(clofazimine,Cfz),WHO尚未推薦臨界濃度[1,28]。因此,既往的MTB pDST的臨界濃度值亟需系統(tǒng)審核和修訂,從而改善MTB pDST的準確性和可重復性[13]。

WHO兩項系統(tǒng)綜述[28-29]利用已發(fā)表的MIC數(shù)據(jù)評估現(xiàn)有臨界濃度是否符合pWT MIC分布上限的ECOFF[2,5],結果發(fā)現(xiàn)目前使用的大多數(shù)藥物-培養(yǎng)基組合的臨界濃度值并不符合pWT MIC分布獲得的ECOFF[4-5]。面對這種情況,WHO在對現(xiàn)有數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)審查的基礎上,2018年[28]對前一版本(2014年[30])推薦的臨界濃度進行了修訂:(1)建立左氧氟沙星(levofloxacin,Lfx)、Mfx、加替沙星(gatifloxacin,Gfx)在L-J培養(yǎng)基上的臨時臨界濃度,建立Gfx在MGIT上的臨時臨界濃度;(2)為盡量減少假敏感結果,將3種二線抗結核藥物的臨界濃度降低至各自的ECOFF,包括:阿米卡星在米氏7H10培養(yǎng)基(Middlebrook 7H10 medium,7H10)中由4 μg/ml降至2 μg/ml,Lfx在MGIT中由2 μg/ml降至1 μg/ml,Mfx在MGIT中由0.5 μg/ml 降至0.25 μg/ml;Mfx在MGIT中臨床折點由2 μg/ml降至1 μg/ml;(3)建立Bdq和Dlm在米氏7H11培養(yǎng)基(Middlebrook 7H11 medium,7H11)和MGIT中的4個臨時臨界濃度,建立Cfz在MGIT中的臨時臨界濃度;(4)由于證據(jù)有限,3個臨界濃度被取消,包括Gfx在7H10上的臨界濃度、卡那霉素在7H11上的臨界濃度,還有迄今為止只能在L-J培養(yǎng)基上做pDST的環(huán)絲氨酸的臨界濃度,意味著目前環(huán)絲氨酸的pDST不夠準確,耐藥患者可能會面臨無效地使用這種藥物并產(chǎn)生嚴重不良反應的風險[28,31]。同時強調(diào),一旦獲得更多數(shù)據(jù),應重新評估這些決定[4,28]。

WHO還在2021年[29]根據(jù)系統(tǒng)綜述的數(shù)據(jù),將利福平(rifampicin,RFP)在7H10和MGIT中的臨界濃度由1 μg/ml降至暫定ECOFF 0.5 μg/ml。事實上半個多世紀以來7H10培養(yǎng)基的RFP臨界濃度是ECOFF的2倍[32],導致一些RFP臨界耐藥的患者分離株因使用過高的臨界濃度值而被判定為對RFP敏感,仍然按RFP敏感患者的標準劑量(10 mg·kg-1·d-1)給予治療[29,32],這無疑增加了治療失敗和對其他藥物產(chǎn)生耐藥的可能性[16,29,32-34]。但目前RFP在L-J培養(yǎng)基中的臨界濃度依然保持40 μg/ml不變,因為還沒有足夠的MIC數(shù)據(jù)來評估羅氏培養(yǎng)基中pWT MIC分布[32]。我國目前常用MTB pDST方法各藥物最新折點匯總見表1。

表1 我國常用結核分枝桿菌表型藥物敏感性試驗方法各藥物折點匯總

三、在特定臨界濃度下臨界耐藥對pDST結果的影響

(一)臨界耐藥對pDST結果的影響

如前所述,通過更加科學的方法和研究建立抗結核藥物DST的臨界濃度值后可以解決大部分pDST的準確性和可重復性問題,但“臨界耐藥”菌株仍可能存在一些問題,給實驗室技術人員和臨床醫(yī)生造成困擾,如:(1)pDST結果與gDST結果不一致;(2)pDST結果與臨床療效不一致;(3)結果的不確定性,很難報告耐藥/敏感等。

“臨界耐藥”過去也被稱為“低水平耐藥”,WHO在2022年[10]正式命名為“臨界耐藥”,指有些耐藥基因突變與MIC的低增長相關,導致具有這些突變的耐藥株MIC分布與pWT MIC分布顯著重疊,依據(jù)臨界濃度值進行簡單的敏感或耐藥的二分類結果很難區(qū)分這種重疊,增加了敏感或耐藥錯誤分類的可能性,并導致pDST結果的可重復性差。還會出現(xiàn)同一分離株pDST敏感而gDST耐藥的情況,使某些藥物的耐藥相關突變不能通過當前的pDST方法得到可靠的確認,對gDST方法的設計和解釋產(chǎn)生不利影響[32-33,36],為臨床結果應用帶來復雜性。

如乙胺丁醇(ethambutol,EMB),目前設置的臨界濃度與耐藥相關突變(embB306突變[37-38])菌株的MIC值非常接近,這可能是EMB檢測重復性差的主要原因?？紤]到重復性不好,2018年WHO不再建議做EMB的簡單劃分敏感或耐藥的二分類pDST,相反MIC結果比二分類pDST結果更有用,它能將具有耐藥突變的菌株分辨出來,給出準確的耐藥結果,gDST(測序)可能比pDST更可靠,這還需要更多的證據(jù)支持[1]。

對于RFP,2021年WHO在系統(tǒng)綜述[29]中顯示6個RFP耐藥決定區(qū)域(RFP resistance-determining region,RRDR)突變(L430P,D435Y,H445L,H445N,H445S和L452P)和1個非RRDR突變(I491F)引起耐藥的菌株的MIC分布與pWT菌株MIC分布重疊[39],表現(xiàn)出RFP臨界耐藥,這些耐藥類型在使用臨界濃度值為1 μg/ml的MGIT 960系統(tǒng)中很大一部分被檢測為敏感[4]。因為在較高臨界濃度(1 μg/ml)下檢測,可能會遺漏臨界耐藥,此時通過獲得具體MIC值和(或)測序突變位點(rpoB)有助于檢測臨界耐藥。雖然證據(jù)有限,但依據(jù)RFP的PK/PD數(shù)據(jù)及這7個rpoB突變的有限臨床療效數(shù)據(jù)(治療效果不好,失敗或復發(fā)),WHO在2021年建議將這7個突變類型視為與目前標準劑量RFP(10 mg·kg-1·d-1)治療具有臨床相關性,同時也強調(diào)必須根據(jù)新的證據(jù)對這一建議進行重新評估[29]。因此,2018年WHO推薦采用一種綜合判讀方法,以確保不遺漏rpoB臨界耐藥突變,即如果分離株經(jīng)pDST檢測為耐藥,或基因型方法確認具有已知的耐藥相關突變,均認為該分離株對RFP耐藥[29,32-33,39]。然而,對于除RFP外的其他藥物,如何在常規(guī)臨床治療中解決表型和基因型結果不一致的情況也需要有清晰易行的指導[39]。同時,還提出對于這些RFP臨界耐藥患者是否能夠通過提高RFP劑量改善療效需要更多的證據(jù)支持[29]。

Mfx的gyrA一些突變(如A90V,D94A等)的MIC分布接近臨界濃度,導致具有此類突變的菌株pDST結果的可重復性差,與gDST的結果一致性較低[28,40];PZA的pncA也存在2個突變(T47A和I31T)的MIC分布接近臨界濃度[41-44],導致其結果可重復性較差[45-46]。目前,MGIT液體法是WHO推薦的唯一一種PZA DST方法,盡管這種方法存在較高假耐藥的情況[45,47]。相對于pDST通過DNA測序檢測pncA突變是更可靠的方法[1],盡管pncA外的其他基因突變也可能使PZA耐藥[48]。

(二)對于臨界耐藥問題的解決方案

針對臨界耐藥問題,EUCAST在2018年12月引入了技術不確定區(qū)域(area of technical uncertainty,ATU)的概念,用于提示實驗室結果存在不確定性,向臨床醫(yī)生報告結果之前需要解決這一問題[49]。ATU通常由一個MIC值定義[10],它不作為結果報告的一部分。目前可用于RFP臨界耐藥的情況(MIC=1 μg/ml對應于ATU),當MIC≤0.5 μg/ml,報告為敏感; MIC>1 μg/ml,報告為耐藥;MIC=1 μg/ml,提示實驗室結果不確定[32]。因為由于MIC分布的重疊(僅適用于臨界耐藥情況,但不適用于高水平耐藥情況),基于一次MIC結果不能明確將所檢測的菌株歸類為敏感或耐藥。當遇到這種情況可以通過gDST確定耐藥突變類型或本地此類型MIC菌株的流行病學資料協(xié)助解決。當無法解決時,需要告知臨床醫(yī)生結果存在的問題。也有學者建議將MIC=100 μg/ml作為PZA的ATU,即MIC≤50 μg/ml報告為敏感,MIC=100 μg/ml 對應于ATU,MIC>100 μg/ml報告為耐藥[43]。

同時,EUCAST還將DST結果報告更新為三類[50],分別為敏感、中介、 耐藥,并于2019年1月1日生效。具體含義如下:敏感—標準給藥方案時敏感(susceptible,standard dosing regimen):當使用藥物的標準給藥方案治療成功率很高時,定義為“敏感”;中介—提高藥物暴露量時敏感(susceptible, increased exposure):通過調(diào)整給藥方案或感染部位的藥物濃度提高藥物暴露量,治療成功率很高時,定義為“中介”;耐藥—即使提高藥物暴露量,治療失敗的可能性依舊很高時,定義為“耐藥”。藥物暴露量是通過調(diào)整抗菌藥物給藥方式、劑量、給藥間隔、輸注時間及分布和排泄來影響感染部位的病原菌,用AUC來表示[51]。這一報告方式是針對所有病原菌制定的,在結核病領域,比較適合Mfx在MGIT中的結果報告,當?shù)蜐舛?0.25 μg/ml)耐藥,高濃度(1 μg/ml)敏感時,更符合報告“中介”,可通過增加藥物劑量(用800 mg/d的Mfx)來治療。盡管RFP[29]、INH(inhA基因突變)[52-54]、PZA也發(fā)現(xiàn)了低水平耐藥情況[41-44],WHO在2022年僅提出對于INH低水平耐藥使用高劑量INH治療可能有效[31,52],還沒有確定是否可以通過提高RFP和PZA藥物劑量來達到良好治療效果。根據(jù)最近的臨床試驗,增加RFP的劑量是有希望的[55-57]。提高PZA藥物劑量可能彌補低水平耐藥情況[4,14,43],相信不久的將來隨著研究不斷深入,這一問題會得到更明確的解決。

美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)為解決此類問題,也將DST結果定義為“敏感”“中介”“耐藥”[12],但這里的“中介”與EUCAST含義有所不同,指的是不確定(inconclusive)結果,這個“中介”僅僅是針對微孔板法中EMB設置的,其他藥物并沒有“中介”這個分類。當EMB的MIC≤2 μg/ml,報告為敏感;MIC≥8 μg/ml,報告為耐藥;MIC=4 μg/ml,結果不確定。當報告不確定結果時,可以使用MGIT方法或基因型方法重復檢測確定敏感或耐藥。這個不確定的類別基本對應于ATU。

但對于ATU至今尚無統(tǒng)一的觀點或結論,因此,WHO還沒有批準ATU的正式使用,主要是為減少對一些病原菌由于MIC分布重疊而產(chǎn)生的重大檢測誤差[29,49,58-59],但2022年WHO在文件中也提到使用微孔板法時,一些藥物可能需要ATU來解釋[10]。

筆者建議對于臨界耐藥分子機制明確的藥物,可以應用測序或檢測具體位點的商品化試劑盒獲得臨界耐藥結果,也可用MIC方法獲得具體MIC值明確是否為臨界耐藥。對于臨界耐藥機制不明確的藥物,需要利用MIC方法獲得更多菌株的MIC分布,結合基因型結果和臨床療效,從而了解臨界耐藥的表型和基因型表現(xiàn)。且對于臨界耐藥問題,需要更多地結合用藥和血藥濃度等綜合解讀,但在我國尚缺乏統(tǒng)一及明確的解決方案,需要進行更多研究。

四、展望

MTB pDST仍是實驗室耐藥性檢測的重要方法,也有助于其他基因型方法的研究。臨界濃度對于pDST結果的準確性至關重要,因而需要采用更加科學的設定折點方法。未來應著重對DST結果不穩(wěn)定的藥物及新藥開展更多的關于臨界濃度的研究,設定合理的折點,同時對臨界耐藥問題探索適宜的解決方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻宋媛媛:醞釀和設計實驗、實施研究、起草文章、行政/技術/材料支持;夏輝:醞釀和設計實驗、實施研究、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、行政/技術/材料支持、指導;趙雁林:獲取研究經(jīng)費、指導、支持性貢獻