管文華 呂琳 陳晴 黎志浩 李唐

阿司匹林為預(yù)防不穩(wěn)定心絞痛及多種不良心血管事件的經(jīng)典抗血小板藥物，大量研究表明阿司匹林抗血小板作用存在個體化差異，一部分服用阿司匹林的患者依然發(fā)生復(fù)發(fā)性血栓等不良心血管事件，專業(yè)術(shù)語稱之為阿司匹林抵抗（Aspirin resistance，AR）［1］。王林等［2］研究表明血小板膜糖蛋白Ⅲa（Platelet glycoprotein Ⅲa，GPⅢa）突變增加阿司匹林抵抗風(fēng)險。血小板內(nèi)皮聚集受體1（Platelet endothelial aggregation receptor?1，PEAR1）的rs1204133 基因位點已被確定為阿司匹林抗血小板治療響應(yīng)的血小板聚集的遺傳決定因素［3］。研究表明前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1（Prostaglandin ? endoperoxide synthase1，PTGS1）rs10306114 位點以及谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶P1（Gluta?thione S transferase P1，GSTP1）rs1695 基因位點與服用阿司匹林后上消化道出血（Upper gastrointesti?nal bleeding，UGIB）風(fēng)險增加有關(guān)［4?5］。通過檢測與阿司匹林抵抗密切相關(guān)基因的基因多態(tài)性，輔助阿司匹林合理用藥，能夠有效降低不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究對廣東地區(qū)2 985 例漢族樣本阿司匹林抵抗相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性位點（single nucleotide polymorphisms，SNPs）進(jìn)行基因分型及相關(guān)性分析，以期揭示阿司匹林抵抗相關(guān)基因位點在廣東漢族人群中的變異情況，助力阿司匹林個性化用藥與治療監(jiān)測，改善患者預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

分析2019 年1 月至2022 年4 月于廣州達(dá)安臨床檢驗中心實驗室進(jìn)行GPⅢa、PEAR1、PTGS1、GSTP1基因檢測的樣本，選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)且資料完整的樣本共2 985 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①來自廣東各個地區(qū)且久居廣東；②均為漢族人群；③基本信息完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期有外科大手術(shù)史、活動性出血者；②有嚴(yán)重消化性潰瘍或消化系統(tǒng)疾病者；③有嚴(yán)重肝腎功能損害者④有惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病者。本研究通過本機構(gòu)倫理委員會批準(zhǔn)，在患者或家屬簽署相關(guān)知情同意書的情況下進(jìn)行。

1.2 主要試劑和儀器

血液基因組提取試劑，購自廣州達(dá)安基因股份有限公司。GPⅢa、PEAR1、PTGS1、GSTP1基因檢測試劑盒，購自武漢思瑞貝斯生物科技有限公司。臺式高速冷凍離心機（型號：D3024R）購自北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司，超微量核酸分析儀（型號：NANO?300）購自杭州奧盛儀器有限公司，實時熒光定量PCR 儀（型號：ABI7500）購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1GPⅢa、PEAR1、PTGS1和GSTP1基因檢測

采集患者靜脈血2 mL（EDTA 抗凝，4℃保存），使用血液基因組DNA 提取試劑盒提取血液DNA，采用熒光定量PCR 技術(shù)對GPⅢa、PEAR1、PTGS1和GSTP1基因的SNP 位點進(jìn)行基因分型。參考GnomAD 數(shù)據(jù)庫［6］和WBBC 數(shù)據(jù)庫［7］的基因型分布信息和人群頻率信息，比較不同地區(qū)人群基因多態(tài)性。參考徐海寧等［8］的研究，年齡以60 歲為分界點，分成兩組，比較不同年齡之間等位基因分布情況。

1.3.2 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Pearson Chi?Square 方法驗證基因型，所有統(tǒng)計分析均利用python（v3.8.10）完成，計數(shù)資料采用n（%）表示，卡方檢驗不同組別等位基因分布情況，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

納入數(shù)據(jù)共2 985 例，年齡分布在16～96 歲之間，平均年齡（62.5±10.9）歲，年齡<60 歲人群共1 158 例，年齡≥60 歲人群共1 827 例；其中男2 050 例（68.7%），平均年齡（61.6±10.8）歲，女935例（31.3%），平均年齡（64.4±10.8）歲。

2.2 GPⅢa、PEAR1、PTGS1、GSTP1 基因多態(tài)性

2.2.1GPⅢa、PEAR1、PTGS1、GSTP1基因型及等位基因頻率分布情況

統(tǒng) 計2 985 例樣本，GPⅢa基 因rs5918位 點、PEAR1基因rs12041331 位點、PTGS1基因rs10306114 位點、GSTP1基因rs1695 位點的基因型分布和等位基因頻率均通過Hardy?Weinberg 平衡驗證（P>0.05）。見表1。

表1 基因位點的基因型分布［n（%）］Table 1 The genotype distribution of different gene sites［n（%）］

2.2.2 不同地區(qū)人群GPⅢa、PEAR1、PTGS1、GSTP1基因多態(tài)性比較

比較中國人群與其他地區(qū)人群GPⅢa、PEAR1、PTGS1和GSTP1基因的遺傳差異，rs5918位點、rs12041331 位點、rs10306114 位點、rs1695 位點等位基因頻率在不同地區(qū)（中國、歐洲、非洲、南亞、拉丁美洲、東亞）人群中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同地區(qū)人群基因型分布頻率Table 2 The genotype distribution of frequency in different regions

2.2.3GPⅢa、PEAR1、PTGS1、GSTP1基因多態(tài)性與性別的相關(guān)性分析

不同性別rs5918 位點PLA2 等位基因攜帶比例、rs12041331 位點A 等位基因攜帶比例以及rs10306114 位點、rs1695 位點G 等位基因攜帶比例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 不同性別之間等位基因分布情況［n（%）］Table 3 The allele distribution between different sex groups［n（%）］

2.2.4GPⅢa、PEAR1、PTGS1、GSTP1基因多態(tài)性與年齡的相關(guān)性分析

在年齡<60 歲組和年齡≥60 歲組之間，GPⅢa、PEAR1、PTGS1基因型和等位基因頻率的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），GSTP1基因rs1695 位點年齡<60 歲組的G 等位基因頻率顯著高于年齡≥60 歲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

表4 不同年齡之間等位基因分布情況［n（%）］Table 4 The allele distribution between different age groups［n（%）］

3 討論

多項藥物遺傳學(xué)研究表明，阿司匹林反應(yīng)與遺傳因素息息相關(guān)，存在個體差異性，可能導(dǎo)致不良心腦血管事件的發(fā)生［1］。然而國內(nèi)外對阿司匹林抵抗相關(guān)基因的研究僅有少量報道，例如申利娜等［9］的研究結(jié)果表明PEAR1基因純合突變增加服用阿司匹林后缺血性腦卒中復(fù)發(fā)的風(fēng)險，且不同民族、不同地區(qū)人群的基因多態(tài)性情況并不一致［10］。因此，本研究選取與阿司匹林抵抗密切相關(guān)的基因變異位點，分析rs5918（GPⅢa）位點、rs12041331（PEAR1）位點、rs10306114（PTGS1）位點、rs1695（GSTP1）位點在廣東地區(qū)漢族人群中的分布情況并進(jìn)行相關(guān)性研究，旨在更全面評估阿司匹林用藥情況，有效預(yù)防不良藥物反應(yīng)的發(fā)生。

研究結(jié)果通過Hardy?Weinberg 平衡驗證，說明所選樣本具有群體代表性。結(jié)合本研究的分析數(shù)據(jù)，與GnomAD 數(shù)據(jù)庫［6］、WBBC 數(shù)據(jù)庫［7］的等位基因分布信息以及國內(nèi)外研究比較，rs5918 位點在南亞、歐洲［11］和非洲、拉丁美洲人群中屬于正常突變（MAF≥0.05）［12］，在東亞人群中屬于低頻突變（0.005≤MAF≤0.05），rs5918（GPⅢa）位點PLA2 等位基因頻率為0.39%，與馬國重等［13］的研究極為相似，說明該位點突變頻率在漢族人群中普遍偏低且不同地區(qū)差異明顯，可能受不同地區(qū)人群免疫反應(yīng)、氣候（紫外線輻射等）和飲食等因素驅(qū)動。rs12041331（PEAR1）位點A 等位基因頻率為42.55%，略高于上海地區(qū)（38.25%）［14］和廈門地區(qū)（40.76%）［15］、河南地區(qū)（35.22%）［16］，表明該基因突變在中國華東地區(qū)、華中地區(qū)人群中更為少見。rs10306114（PTGS1）位點在嶺南人群［7］中沒有檢測到個體攜帶，本研究檢測到3 個攜帶GA 基因型的個體，G 等位基因頻率是0.05%，更新了廣東地區(qū)漢族人群rs10306114（PTGS1）位點變異檢測結(jié)果，此外該位點突變在非洲、歐洲、拉丁美洲人群中較為常見［6］。rs1695（GSTP1）位點G 等位基因發(fā)生頻率為17.52%，略低于北京地區(qū)（18.7%）［17］和新疆地區(qū)（25%）［18］，非洲（44.77%）、拉丁美洲（51.75%）人群攜帶頻率明顯增加?？偠灾瑥V東省處于亞熱帶地區(qū)，位于中國最南部，漢族人口占全省人口的絕大多數(shù)，漢族人口分布與中國其他地區(qū)相似，由此廣東地區(qū)漢族人群GPⅢa、PEAR1、PTGS1、GSTP1基因多態(tài)性分布結(jié)果與中國其他地區(qū)的研究報告基本一致，與南亞、歐洲和非洲、拉丁美洲人群差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且GPⅢa基因位點不同地區(qū)分布情況差異十分明顯，表現(xiàn)出人群地域差異，暗示其有可能是高度分化、地區(qū)適應(yīng)強的基因位點。不同性別之間rs5918 位點、rs12041331 位點、rs10306114位點、rs1695 位點的等位基因攜帶比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明阿司匹林抵抗相關(guān)基因的基因多態(tài)性不受性別因素的影響。rs1695 位點年齡<60 歲組的基因陽性率（34.11%）顯著高于年齡≥60 歲組（30.60%），攜帶G 等位基因與阿司匹林抵抗顯著相關(guān)且增加服用阿司匹林后消化道出血風(fēng)險［5］，其他三個位點在不同年齡組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。對于rs1695 位點，年齡可能是影響廣東地區(qū)漢族人群阿司匹林藥效反應(yīng)性的風(fēng)險因素。

綜上所述，本研究比較了廣東地區(qū)人群和其他地區(qū)人群阿司匹林抵抗相關(guān)基因的基因變異情況，并進(jìn)行了年齡、性別相關(guān)性分析，有效地補充了廣東地區(qū)漢族人群阿司匹林藥物基因組學(xué)的遺傳性研究，對阿司匹林抗血小板精準(zhǔn)用藥有一定的參考價值。