張文新 曲守方 李麗莉 孫楠 黃傳峰 黃杰

慢性髓性白血?。╟hronic myelogenous leuke?mia，CML）具有標(biāo)志性的細胞遺傳學(xué)異常t（9；22）（q34；q11）形成的費城染色體（Philadelphia，Ph），在分子水平形成BCR?ABL融合基因［1］。BCR基因有多種斷裂方式，其中主斷裂區(qū)稱為M?bcr，結(jié)合ABL基因后能夠形成BCR?ABLP210 型融合基因，主要包含b3a2（e13a2）和b3a2（e14a2）兩種拼接方式［2］。BCR?ABL 酪氨酸激酶抑制劑（tyro?sine kinase inhibitors，TKI）如伊馬替尼、尼洛替尼和普納替尼等已經(jīng)成為慢性髓性白血病患者的一線治療藥物，提高了CML 患者的生存期［3］。

BCR?ABL融合基因的檢測技術(shù)包括熒光原位雜交法（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription?poly?merase chain reaction，RT?PCR）和數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR）法［4?6］等。雖然國內(nèi)已經(jīng)有多家公司開發(fā)了BCR?ABL融合基因定量檢測試劑盒（熒光PCR 法），但是國家藥品監(jiān)督管理局尚未批準(zhǔn)該類試劑盒上市。本研究使用本院提供的BCR?ABL 定量標(biāo)準(zhǔn)品，評價BCR?ABL融合基因定量檢測試劑盒準(zhǔn)確度、檢出限、重復(fù)性和線性等項目的性能。

1 材料與方法

1.1 研究對象

BCR?ABL 定量標(biāo)準(zhǔn)品：WS1、WS2、WS3、WS4，融合比例分別為：12.359%、1.692%、0.177%和0.015%，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 主要試劑

BCR?ABL1融合基因核酸定量檢測試劑盒（PCR?熒光探針法）（簡稱試劑盒A）和核酸提取或純化試劑，廣州達安基因股份有限公司；BCR?ABL1 P210型融合基因測定試劑盒（熒光RT?PCR 法）（簡稱試劑盒B）和TRIzol Reagent，北京旌準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司；人BCR?ABL融合基因檢測試劑盒（熒光PCR 法）（簡稱試劑盒C）和RNeasy mini kit，邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究（蘇州）有限公司；BCR?ABL P210融合基因定量檢測試劑盒（熒 光RT?PCR 法）（簡稱試劑盒D）和TRIzol Reagent，蘇州云泰生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 主要儀器

熒光定量PCR 儀，型號：ABI 7500，美國賽默飛世爾科技公司；熒光PCR 檢測儀，型號：Bio?Rad CFX96，美國伯樂公司。

1.4 方法

各BCR?ABL融合基因檢測試劑盒按照說明書要求對BCR?ABL 定量標(biāo)準(zhǔn)品進行RNA 提取，并測定濃度和純度。將樣本RNA 和試劑盒的定量標(biāo)準(zhǔn)品分別加入BCR?ABL 反應(yīng)液和ABL 反應(yīng)液，使用熒光定量PCR 儀進行檢測。然后根據(jù)試劑盒定量標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對BCR?ABL 定量標(biāo)準(zhǔn)品（WS1～WS4）進行BCR?ABL 和ABL 拷貝數(shù)的定量及BCR?ABL 與ABL 拷貝數(shù)融合比例的計算分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)品的BCR?ABL融合基因檢測結(jié)果。對準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測2 次，標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)示融合比例和檢測融合比例的值分別取對數(shù)值，然后計算絕對偏差，標(biāo)準(zhǔn)要求絕對偏差不超過±0.5 個對數(shù)數(shù)量級（log）。對于0.01%融合比例的BCR?ABL（P210）融合基因檢測限標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測10 次，標(biāo)準(zhǔn)要求應(yīng)能檢測出陽性。對重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)品檢測，標(biāo)準(zhǔn)要求BCR?ABL 反應(yīng)通道Ct值的變異系數(shù)（CV，%）應(yīng)≤5.0%。按照試劑盒說明書進行操作，將每一濃度標(biāo)準(zhǔn)品進行2 次檢測，計算每一標(biāo)準(zhǔn)品的檢測濃度對數(shù)值的均值，以理論濃度對數(shù)值為xi，檢測的濃度對數(shù)值的均值為yi，進行線性擬合，計算其線性相關(guān)系數(shù)r，標(biāo)準(zhǔn)要求線性相關(guān)系數(shù)︱r︱≥0.980 0。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)品WS2 和WS3 的標(biāo)示融合比例分別為1.692%和0.177%，各試劑盒對WS2 和WS3 的融合比例結(jié)果的絕對偏差在-0.16～0.14 log內(nèi)，滿足-0.5～0.5 log 的標(biāo)準(zhǔn)要求。見圖1、2。

圖1 WS2 和WS3 融合比例的結(jié)果Figure 1 Results of fusion ratio of WS2 and WS3

圖2 WS2 和WS3 融合比例對數(shù)的絕對偏差Figure 2 Absolute deviation for logarithm of fusion ratio of WS2 and WS3

2.2 檢出限

按照各個試劑盒說明書的陽性判斷值進行判讀，結(jié)果顯示各試劑盒對檢測限標(biāo)準(zhǔn)品WS4，均能檢出BCR?ABL融合突變陽性，試劑盒A 中WS4 融合比例檢測結(jié)果平均值為0.027%（BCR?ABL 通道Ct 值≤38 為陽性），試劑盒B 中WS4 融合比例檢測結(jié)果平均值為0.017%（BCR?ABL 通道Ct 值≤40 為陽性），試劑盒C 中WS4 融合比例檢測結(jié)果平均值為0.013%（融合比例≥0.003 2%為陽性），試劑盒D 中WS4 融合比例檢測結(jié)果平均值為0.022%（BCR?ABL 通道Ct 值≤36 為陽性）。WS4 的10 次重復(fù)的融合比例結(jié)果見圖3。

圖3 WS4 融合比例的結(jié)果Figure 3Results of fusion ratio of WS4

2.3 重復(fù)性

結(jié)果顯示對于重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)品WS1 和WS4，各試劑盒BCR?ABL 通道檢測Ct值的變異系數(shù)（CV，%）在0.2%～2.5%范圍內(nèi)，符合CV 不高于5.0%的要求。見圖4。

圖4 重復(fù)性結(jié)果Figure 4Results of repeatability

2.4 線性

結(jié)果顯示各試劑盒的線性相關(guān)系數(shù)|r|在0.9899～1.000 范圍內(nèi)，符合線性的要求。線性擬合曲線見圖5。

圖5 線性擬合曲線Figure 5 Linear fitting curve

3 討論

BCR?ABL的定量檢測必須準(zhǔn)確和穩(wěn)定，才能保證CML 患者療效的準(zhǔn)確評價。不同實驗室由于內(nèi)參基因的選擇、試劑及儀器等各種影響因素，檢測同一樣本BCR?ABL融合基因轉(zhuǎn)錄本水平可能會有差異。2005 年，在國際CML 共識會議上專家們提出了國際標(biāo)準(zhǔn)（international scale，IS）的建議，即通過轉(zhuǎn)換系數(shù)（conversion factor，CF），將各實驗室的BCR?ABL融合基因檢測值均轉(zhuǎn)換為國際標(biāo)準(zhǔn)值BCR?ABLIS［7］。我國北京大學(xué)人民醫(yī)院組織了用于轉(zhuǎn)換國際標(biāo)準(zhǔn)的慢性髓性白血病的BCR?ABL（P210）轉(zhuǎn)錄本水平的轉(zhuǎn)換系數(shù)（CF）的有效性研究工作，對國內(nèi)BCR?ABL 融合基因的檢測進行規(guī)范［8?9］。BCR?ABLIS是CML 分子檢測國際通用語言，能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)師根據(jù)國內(nèi)外CML 治療指南并參考相關(guān)臨床數(shù)據(jù)對CML 患者進行正確的治療。

2009 年，世界衛(wèi)生組織（World Health Organi?zation，WHO）提供了“第一代BCR?ABLmRNA 的國際遺傳定量標(biāo)準(zhǔn)品”（NIBSC code：09/138），由凍干的K562 和HL?60 細胞混合制成，用于BCR?ABL主要型（e13a2 和e14a2）的國際標(biāo)準(zhǔn)（IS）校準(zhǔn)［10?11］。BCR?ABL融合基因定量檢測試劑盒（熒光PCR 法），具有靈敏、特異以及準(zhǔn)確定量的特點，通過分別檢測BCR?ABL和ABL基因，然后利用試劑盒工作標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量各自的拷貝數(shù)，計算出樣本的BCR?ABLmRNA 水平：（BCR?ABL copies/ABL copies）×100%，并獲得樣本的BCR?ABLIS=（BCR?ABL 拷貝數(shù)/ABL 拷貝數(shù)）*100*轉(zhuǎn)化系數(shù)（CF）。本研究使用的4 個BCR?ABL融合基因定量檢測試劑盒（熒光PCR 法），只有1個試劑盒提供了轉(zhuǎn)化系數(shù)（CF），說明BCR?ABL融合基因的標(biāo)準(zhǔn)化檢測還需要規(guī)范。

中國食品藥品檢定研究院提供的BCR?ABL定量標(biāo)準(zhǔn)品溯源至WHO 國際定量標(biāo)準(zhǔn)品（NIBSC code：09/138），WS1～WS4 的融合比例分別為12.359%、1.692%、0.177%和0.015%，在定量檢測試劑盒的線性區(qū)間內(nèi)，用于評價定量試劑盒的準(zhǔn)確度、檢出限和重復(fù)性的性能。MR4.0［BCR?ABL≤0.01%（IS）］和MR4.5［BCR?ABL≤0.003 2%（IS）］是在主要分子學(xué)反應(yīng)（major molecular response，MMR）基礎(chǔ)上所追求的深層分子學(xué)反應(yīng)（deep mo?lecular response，DMR），是實現(xiàn)無治療緩解的前提。根據(jù)我國BCR?ABL融合基因定量檢測試劑盒的產(chǎn)品特點和臨床應(yīng)用需要，本研究將融合比例不高于0.01%的樣品作為試劑盒的檢出限，要求應(yīng)能檢測相應(yīng)的融合基因陽性。體外診斷試劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的要求應(yīng)不低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，為了推動BCR?ABL融合基因檢測技術(shù)的發(fā)展，鼓勵生產(chǎn)企業(yè)提高產(chǎn)品的檢出限要求，可將融合比例提高至不高于0.003 2%。研究結(jié)果表明對BCR?ABL 定量標(biāo)準(zhǔn)品，各試劑盒均能準(zhǔn)確檢出相應(yīng)的融合基因突變，且融合比例滿足了定量標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確度和檢出限要求，BCR?ABL 檢測通道Ct值的變異系數(shù)（CV，%）均不高于5.0%，各試劑盒的線性相關(guān)系數(shù)|r|均不低于0.980 0。本研究評價的BCR?ABL融合基因定量檢測試劑盒（熒光PCR 法），其性能不僅滿足了《斷裂點簇集區(qū)艾貝爾遜白血病病毒（BCR?ABL）融合基因檢測試劑盒》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求，也為臨床檢測提供了有力的技術(shù)支撐作用，為產(chǎn)品的注冊上市和監(jiān)督評價工作提供技術(shù)指導(dǎo)作用［11］。