龍?jiān)葡?，鐘義惠，吳媛媛，陳湫錦，杜 立，鄭 虹，李胤穎，羅志娟

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 545001）

卵巢早衰（premature ovarian failure POF）是一種以閉經(jīng)、雌激素水平低、促性腺激素水平升高以及40 歲前女性缺少成熟卵泡為特征的疾?。?］。POF 尚無(wú)明確病因，其影響因素可能有遺傳因素、自身免疫系統(tǒng)疾病因素、醫(yī)源性因素、病毒感染因素、環(huán)境因素等［2］。伴隨著社會(huì)生活壓力的逐漸加劇，女性POF 發(fā)病率也逐年升高，約有1%的女性受到該疾病的影響，且發(fā)病人群越來(lái)越趨向年輕化［3］。目前治療手段有限，以激素替代療法為主，激素替代療法副作用較明顯，可能會(huì)增加?jì)D女罹患乳房癌癥、中風(fēng)和膽囊疾病等風(fēng)險(xiǎn)［4］。中醫(yī)藥在此疾病治療上具有較大優(yōu)勢(shì)，且副作用較小。道地通管湯是廣西名中醫(yī)羅志娟教授的臨床驗(yàn)方，由黃芪、桂枝、土茯苓、玄參、三七、大血藤等10 余味中藥組成，具有益氣健脾、清熱利濕、活血化瘀的功效。在前期研究［5］已證實(shí)該方可改善盆腔的血運(yùn)，減輕局部的微循環(huán)障礙，加快修復(fù)受損組織，對(duì)輸卵管性不孕具有明顯療效，且該方治療方式為灌腸，較口服用藥無(wú)胃腸道反應(yīng)。卵巢血管受損，會(huì)導(dǎo)致卵巢血液循環(huán)不佳，引發(fā)卵泡發(fā)育和排卵受損，閉鎖卵泡增多，這可能是POF 發(fā)生的原因之一［6］。本次實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，探究道地通管湯治療卵巢早衰的療效及機(jī)制，為該方劑的后續(xù)拓展開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD 大鼠，雌性，7～8 周齡，體重180～200 g，從湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)入，［質(zhì)量合格編號(hào)：430727211100682662］。于廣西中醫(yī)藥大學(xué)的SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)所購(gòu)大鼠。適應(yīng)性喂養(yǎng)（7 d）后，通過(guò)陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察大鼠兩個(gè)動(dòng)情周期（10 d）的變化情況，從中篩選40 只具有規(guī)律動(dòng)情周期的大鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 道地通管湯組方：土茯苓、玄參、黃芪、桂枝、三七、大血藤等藥物，共186 g，經(jīng)水煎濃縮至生藥量為3.5、7.0 g/mL 的藥液。雷公藤多苷片（湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司、國(guó)藥準(zhǔn)字：Z43020138）補(bǔ)佳樂(lè)（拜耳醫(yī)藥保健有限公司、國(guó)藥準(zhǔn)字：J20171038）以上藥物均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1.1.3 試劑 HE 試劑盒（索萊寶公司、貨號(hào)G1120-100）；FSH 試劑盒、E2 試劑盒、AMH 試劑盒（伊特生命公司，貨號(hào)分別為YT003287-96T、YT003296-96T、YT002952-96T）；Bax 一抗（貨號(hào)AF0120）、Bcl-2 一抗（貨號(hào)AF6139）、VEGF 一抗（貨號(hào)AF5131），抗體均購(gòu)于Affinity 生物公司；DAPI 染色液（博士德公司，貨號(hào)AR1177）；tunel 試劑盒（碧云天公司，紅光，貨號(hào)C1089，綠光，貨號(hào)C1086）。

1.1.4 儀器設(shè)備 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo，型號(hào)FRESCO 21；ASP300S 型脫水機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；RM2255 型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，微孔板恒溫孵育器，中國(guó)米歐，型號(hào)MT70-2；酶標(biāo)儀，北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)DNM-9602；光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS，型號(hào)BX43；成像系統(tǒng)，日本OLYMPUS；型號(hào)UC90。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 將經(jīng)過(guò)篩選的40 只具有正常動(dòng)情周期的大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分別為空白組、模型組、陽(yáng)性組、道地通管湯高劑量組、道地通管湯中劑量組，共5 組，每組8 只。除空白組大鼠外，其余各組大鼠均予雷公藤多苷片灌胃，劑量為50 mg/kg，連續(xù)14 d，建立卵巢早衰大鼠模型［7］，同時(shí)從造模第4 d 起，每天行陰道脫落細(xì)胞涂片，至造模結(jié)束，若大鼠動(dòng)情周期雜亂無(wú)章或延長(zhǎng)（≥6 d）或長(zhǎng)期停留在某一時(shí)期則認(rèn)為造模成功［8］。

1.2.2 給藥 卵巢早衰大鼠模型建立成功后，給藥量均按前期課題組所用的體表面積折算公式計(jì)算［9］，計(jì)算出各治療組給藥劑量，分別給藥。陽(yáng)性藥組灌胃補(bǔ)佳樂(lè)0.099 mg/kg，道地通管湯高、中劑量組分別灌腸給予道地通管湯1.4 g/100 g、0.7 g/100 g。空白組、模型組大鼠均通過(guò)灌腸給予生理鹽水2 mL/d，連續(xù)給藥28 d。

1.2.3 取材 末次給藥后，予大鼠禁食，次日予異氟烷使大鼠完全麻醉后，行腹主動(dòng)脈取血，分離血清后，分裝到EP 管中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分離出雙側(cè)卵巢，剝離多余的組織，一側(cè)卵巢組織置于-80 ℃冰箱以保存?zhèn)溆?，另一?cè)卵巢組織完全浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定備用切片。

1.2.4 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 將固定完全的卵巢組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片、烤片及HE 染色處理后，在電子顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)各級(jí)卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 血清AMH 水平檢測(cè) ELISA 法檢測(cè)血清AMH 水平。以上操作均按照試劑說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.2.6 卵巢組織中Bax、Bcl-2、VEGF 蛋白表達(dá) 取卵巢組織石蠟樣本，經(jīng)切片、攤片、烤片、脫蠟、抗原修復(fù)、封閉、抗體孵化、DAB 顯色、蘇木素復(fù)染，封片后于顯微鏡下觀察。運(yùn)用Image J 圖像處理軟件，計(jì)算每張圖片的光密度值。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞面積總和占視野面積的百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 TUNEL 染色檢測(cè)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況 取卵巢組織石蠟切片，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色操作，完成染色后觀察組織凋亡情況，細(xì)胞凋亡率=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Graphpad Prism6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及動(dòng)情周期改變

與空白組大鼠相比，造模大鼠在造模期間，毛色晦暗無(wú)光澤，食欲一般，行動(dòng)較緩，對(duì)周圍事物比較敏感，喜倦縮角落，應(yīng)激表現(xiàn)強(qiáng)烈。造模期間，陰道涂片觀察發(fā)現(xiàn)，造模組大鼠動(dòng)情期縮短或消失，間期延長(zhǎng)，多數(shù)處于動(dòng)情前期及間期。大鼠動(dòng)情周期各時(shí)期陰道脫落細(xì)胞圖，見圖1。

圖1 大鼠動(dòng)情周期各時(shí)期陰道脫落細(xì)胞圖（HE，×200）Fig 1 Estrous cycle of rats（HE，×200）

2.2 道地通管湯對(duì)POF 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的變化

與空白組相比，模型組大鼠的卵巢內(nèi)各級(jí)生長(zhǎng)卵泡、黃體數(shù)量減少，閉鎖卵泡的數(shù)量增多，生長(zhǎng)卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞層數(shù)減少、排列紊亂，表現(xiàn)為核固縮，卵巢內(nèi)血管減少；與模型組相比，陽(yáng)性組、道地通管湯高、中劑量組大鼠卵巢內(nèi)各級(jí)生長(zhǎng)卵泡及黃體數(shù)量增多，閉鎖卵泡較少，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞飽滿、排列整齊、發(fā)育良好，卵巢內(nèi)血供較豐富，見圖2。

圖2 給藥后各組大鼠卵巢組織形態(tài)圖（HE，×200）Fig 2 Ovarian tissue morphology of rats in each group after administration（HE，×200）

2.3 道地通管湯對(duì)POF 大鼠血清AMH 的影響

與空白組相比，各組AMH 值均顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，治療組AMH 均有不同程度上調(diào)，尤以道地通管湯高劑量組上調(diào)最為顯著（P＜0.01），模型組與陽(yáng)性組、中藥中劑量組之間比較無(wú)差異（P＞0.05），見表1。

表1 道地通管湯對(duì)POF 大鼠血清AMH 的影響（n=8，±s）Tab 1 Effect of Daodi Tongguan Decoction on serum AMH of POF rats（n=8，±s）

表1 道地通管湯對(duì)POF 大鼠血清AMH 的影響（n=8，±s）Tab 1 Effect of Daodi Tongguan Decoction on serum AMH of POF rats（n=8，±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01;與模型組比較，##P＜0.01。

AMH(pg/mL)組別4 261±513.4 2 731±568.7**3 146±328.0**3 582±483.5**##3 023±344.2**27.04空白組模型組陽(yáng)性組道地通管湯高劑量組道地通管湯中劑量組F

2.4 道地通管湯對(duì)POF 大鼠卵巢組織VEGF、Bax及bcl-2 蛋白表達(dá)的影響

Bax、Bcl-2、VEGF 均表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞、各級(jí)卵泡和黃體細(xì)胞中。與空白組相比，模型組中Bax 蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01），Bcl-2、VEGF 蛋白表達(dá)減弱（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性組、道地通管湯高劑量組Bax 蛋白表達(dá)減弱（P＜0.01，P＜0.05），道地通管湯高劑量組Bcl-2 和VEGF 蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 道地通管湯對(duì)POF 大鼠卵巢組織的VEGF、Bax 及bcl-2 蛋白表達(dá)平均積分吸光度的影響（n=8，±s）Tab 2 Effect of Daodi Tongguan Tang on the average integrated absorbance of VEGF，Bax，and Bcl-2 protein expression in ovarian tissue of POF rats（n=8，±s）

表2 道地通管湯對(duì)POF 大鼠卵巢組織的VEGF、Bax 及bcl-2 蛋白表達(dá)平均積分吸光度的影響（n=8，±s）Tab 2 Effect of Daodi Tongguan Tang on the average integrated absorbance of VEGF，Bax，and Bcl-2 protein expression in ovarian tissue of POF rats（n=8，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

VEGF 蛋白組別Bax 蛋白Bcl-2 蛋白0.214 7±0.065 69 0.044 37±0.000 479 7*0.119 5±0.010 69 0.175 2±0.025 17#0.084 14±0.009 147 9.098空白組模型組陽(yáng)性組道地通管湯高劑量組道地通管湯中劑量組F 0.052 93±0.007 044 0.494 1±0.026 22**0.021 75±0.014 91##0.130 4±0.129 2#0.215 7±0.090 06 13.93 0.203 2±0.051 51 0.001 211±0.000 136 9**0.087 92±0.024 83*0.144 7±0.009 818#0.0247 2±0.003 614**20.65

圖3 道地通管湯對(duì)POF 大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、VEGF 蛋白的影響（免疫組化，×200）Fig 3 Effect of Daodi Tongguan Decoction on Bax，Bcl-2，VEGF protein in ovarian tissue of POF rats （IHC，×200）

2.5 道地通管湯對(duì)POF 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響

與空白組相比，模型組大鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，道地通管湯高劑量組和陽(yáng)性組卵泡的顆粒細(xì)胞凋亡水平降低（P＜0.05），道地通管湯中劑量組卵泡顆粒細(xì)胞凋亡水平減低，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖4、表3。

表3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group（n=8，±s）

表3 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group（n=8，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05。

凋亡率/%3.6±1.140 54±16.32**27.2±9.550*#31.4±13.13**#38.8±10.66**13.13組別空白組模型組陽(yáng)性組道地通管湯高劑量組道地通管湯中劑量組F

圖4 道地通管湯對(duì)POF 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響（tunel 染色，×200）Fig 4 Effect of Daodi Tongguan Decoction on apoptosis of ovarian granulosa cells in POF rats （tunel staining，×200）

3 討論

目前建立POF 動(dòng)物模型的方法有很多種，如化療藥物造模法、放射損傷造模法、自身免疫損傷造模法、雷公藤多苷片造模法等［10］。本次實(shí)驗(yàn)中，本課題選用了國(guó)內(nèi)運(yùn)用較為廣泛的雷公藤多苷片造模法，該方法簡(jiǎn)單、可重復(fù)性高，所誘導(dǎo)的模型可高度模擬臨床上因使用雷公藤多苷片治療而造成卵巢早衰的婦女的疾病狀態(tài)［11］。本次實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)雷公藤多苷片干預(yù)后的大鼠，AMH 水平普遍降低。與FSH、E2 隨月經(jīng)周期變化波動(dòng)較大不同，AMH 隨月經(jīng)周期可變性很?。?2］。在目前性激素檢測(cè)，竇卵泡計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子、卵巢體積檢量等常用來(lái)檢測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能的方法中，有研究表明AMH 可能是目前所有檢測(cè)方法中準(zhǔn)確度最高的一種［13］，所以本次實(shí)驗(yàn)選取AMH 作為POF 模型大鼠性激素水平評(píng)估。本次實(shí)驗(yàn)參考大鼠動(dòng)情周期表現(xiàn)、卵巢形態(tài)學(xué)改變及AMH 水平變化，可以推斷本次的POF 模型建立是成功的。

在中醫(yī)古籍中并無(wú)卵巢早衰這一病名，可根據(jù)POF 臨床癥狀歸屬中醫(yī)“血枯”，“經(jīng)水早斷”，“不孕”和“臟燥”等疾病范疇［14］。女子以血為本，氣血充盈，腎精充足，則可滋潤(rùn)沖任、下養(yǎng)胞宮，反之氣血虧虛無(wú)法濡養(yǎng)腎精，則婦人天癸竭，地道不通，形壞而無(wú)子，導(dǎo)致POF 的發(fā)生［15］。脾主運(yùn)化，為后天之本，氣血生化之源，若脾失健運(yùn)，運(yùn)化失常，則經(jīng)血化生無(wú)源，胞宮失于濡養(yǎng)，脾失健運(yùn)，又易水濕內(nèi)生，導(dǎo)致胞宮氣血運(yùn)行不暢，而致經(jīng)閉、不孕等癥。嶺南大部分地區(qū)，常年氣候較濕熱，濕易困脾，所以該地區(qū)居民脾胃病多發(fā)［16］，根據(jù)“百病皆由脾胃衰而生”及異病同治的指導(dǎo)思想，嶺南醫(yī)家在諸多疾病治療中常運(yùn)用具有清熱利濕、益氣健脾功效的藥物，以求脾胃安則身安。受上述學(xué)術(shù)思想啟發(fā)，結(jié)合前期研究成果，我們對(duì)道地通管湯治療POF 的可行性開展了研究。道地通管湯是嶺南醫(yī)家羅志娟教授自創(chuàng)的婦科臨床驗(yàn)方，全方大部分藥材取于嶺南地區(qū)的道地藥材，全方具有益氣健脾，清熱祛濕，活血化瘀的功效。方中以黃芪、桂枝益氣健脾，鑒于嶺南氣候較為濕熱，脾易為濕困，加以土茯苓、玄參等藥清熱利濕，又以POF 病程較長(zhǎng)，中醫(yī)素有“久病必瘀”之說(shuō)，遂再佐以三七、大血藤活血化瘀，從而達(dá)到健脾胃、清濕熱、化瘀阻的效果?！捌⑽负蛣t血自生”“婦人所重在血，血能構(gòu)精，胎孕乃成”，脾胃功能正常，方得氣血充盈，婦人才能月經(jīng)正常來(lái)潮，胎孕有成。

既往有實(shí)驗(yàn)證實(shí)VEGF、Bax 及Bcl-2 這3 個(gè)蛋白與POF 的發(fā)生存在相關(guān)聯(lián)系。VEGF 參與卵泡膜血管的生成［17］，而卵泡膜血管是卵泡從血液中吸取自身生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及激素的通道［18］。鄔建飛等［19］研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的外源性VEGF 可以提高顆粒細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞凋亡率。Bax 和Bcl-2在卵巢組織中均有表達(dá)，在閉鎖卵泡可檢測(cè)到高Bax 和/或低Bcl-2 表達(dá)以及二者比值增高樣改變［20］。諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)POF 模型大鼠卵巢中的VEGF 蛋白表達(dá)減少，提高VEGF 蛋白的表達(dá)，或許可促進(jìn)Bcl-2 蛋白表達(dá)，降低Bax 蛋白表達(dá)量，減少閉鎖卵泡的發(fā)生［21，22］。在本次實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，中藥治療組大鼠卵巢組織病理形態(tài)均有不同程度改善，血清AMH 值均有不同程度上升，且與所用藥物濃度存在一定正相關(guān)性。根據(jù)上述結(jié)果，本課題組推測(cè)道地通管湯具有調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平，改善內(nèi)環(huán)境，緩解卵巢損傷的作用。與空白組相比，模型組大鼠卵巢組織Bax 蛋白表達(dá)及卵泡中顆粒細(xì)胞凋亡率升高，VEGF、Bcl-2 蛋白表達(dá)減弱。除傷口愈合及腫瘤等特殊病理情況下，絕大部分器官都不會(huì)主動(dòng)重塑血管系統(tǒng)。但卵巢較為特殊，其血管系統(tǒng)會(huì)伴隨排卵周期變化發(fā)生血管生成和血管通透性增加的改變［23］。VEGF 在新生血管的構(gòu)建過(guò)程中起著重要的作用，新生血管的數(shù)量決定著組織的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境［24］。VEGF 表達(dá)減少提示雷公藤多苷可能阻斷了卵巢內(nèi)部分新生血管的形成，卵巢內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)供給通道減少，卵泡發(fā)育過(guò)程過(guò)早中止，迫使閉鎖卵泡增多，導(dǎo)致了POF 的發(fā)生。其次VEGF 的表達(dá)減少可能打破了Bax 和Bcl-2 之間的調(diào)控平衡，啟動(dòng)了促凋亡機(jī)制，進(jìn)一步加劇了閉鎖卵泡的發(fā)生。從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，與模型組相比，道地通管湯治療組VEGF、Bcl-2 表達(dá)升高，Bax 表達(dá)下降，說(shuō)明道地通管湯具有促進(jìn)卵巢內(nèi)血管生成，改善卵巢營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，抑制促凋亡蛋白表達(dá)的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示道地通管湯可以改善POF 大鼠的血清激素水平及卵巢組織結(jié)構(gòu)，減少卵巢中顆粒細(xì)胞的凋亡，減緩POF 的進(jìn)程。其具體機(jī)制可能與調(diào)節(jié)POF 大鼠卵巢組織中VEGF、Bcl-2、Bax 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)卵巢內(nèi)受損組織修復(fù)及減少卵巢中顆粒細(xì)胞的凋亡有關(guān)。該研究為POF 的治療提供了新思路，同時(shí)也為擴(kuò)大道地通管湯的應(yīng)用提供了理論支持。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

龍?jiān)葡迹簩?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；羅志娟、鐘義惠、吳媛媛：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)論文提出指導(dǎo)意見；陳湫錦、杜立、鄭虹、李胤穎：參與實(shí)驗(yàn)資料收集。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。