陳維佳，周明艷，胡繼成，祝 哲，徐 劍

（1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院器官移植科，海南 ?？冢?70105；2.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，海南 ?？?，570105；3.海南省器官移植研究所，海南 ?？?，570105）

肝癌是我國第5 位常見惡性腫瘤及第2 位腫瘤致死病因，對我國人民的生命健康及財產(chǎn)安全產(chǎn)生極大影響［1］。早期肝癌細胞（hepatoma carcinoma cell，HCC）無遠處轉(zhuǎn)移，腫瘤手術(shù)切除是主要的治療手段。但是多數(shù)患者一經(jīng)確診，已經(jīng)屬于肝癌晚期，錯過手術(shù)治療最佳時期，往往只能通過藥物治療。目前臨床上抗肝癌主要使用的是索拉非尼等一線治療藥物，但長期使用患者容易產(chǎn)生耐受性和腹瀉、手足綜合征、高血壓等不良反應［2］。因此，研究有效的肝癌防治藥物已經(jīng)迫在眉睫。中藥作為我國的瑰寶，許多臨床研究已經(jīng)證明其在改善晚期肝癌患者的癥狀和提高生活質(zhì)量，減少腫瘤復發(fā)，控制疾病進展及藥物耐受性等方面具有很好的效果［3，4］。

膽木又稱藥烏檀，是我國唯一原產(chǎn)的茜草科烏檀屬植物品種［5］，主產(chǎn)于海南瓊中、白沙等黎族區(qū)域，其味苦、性寒，主要活性成分是生物堿類［6］。生物堿類抗肝癌具有低毒性、效性強和特異性高的特點，其抗肝癌機制并不是直接殺死肝癌細胞，而是通過改變肝癌細胞形態(tài)、抑制癌細胞轉(zhuǎn)移、促進細胞凋亡及引起細胞周期阻滯等發(fā)揮抗肝癌作用［7］。已有研究發(fā)現(xiàn)，膽木中的短小蛇根草苷、3-表短小蛇根草苷、喜樹果苷等生物堿具有抗腫瘤作用［8，9］。

目前膽木抗肝癌的作用及機制尚不十分明確，因此本研究對膽木抗肝癌的作用及機制進行預測并初步驗證。網(wǎng)絡藥理學是現(xiàn)代中藥研究的新手段，利用化合物與疾病相互作用的靶點，探索藥物的作用機制［10，11］。而中藥強調(diào)藥物對機體網(wǎng)絡的整體作用，網(wǎng)絡藥理學與中藥作用的整體觀吻合，故網(wǎng)絡藥理學對于研究中藥具有獨特優(yōu)勢［12］。本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法，對膽木抗肝癌作用的藥效成分、潛在靶點和通路機制進行了系統(tǒng)地預測，并通過體外細胞實驗初步驗證膽木主要成分異長春花苷內(nèi)酰胺抗肝癌藥理活性，為后續(xù)深入探究及臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 膽木化學成分篩選及預測靶點獲取

通過檢索PubMed、CNKI 得到膽木的主要化合物成分，檢索PubChem 數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取膽木化學成分的分子結(jié)構(gòu)及CanonicalSMILES 號，通過SwissTargetPrediction（http：//swisstargetprediction.ch/）網(wǎng)站，預測膽木化學成分的靶點，采用 UniProtKnowledgebase（http：//www.uniprot.org/）校正后，以SwissTarget-PredictionProb≥0.10、TargetNetProb≥0.60 或者PharmMapperFit≥0.60 為條件篩選預測靶點。

1.2 肝癌靶點獲取

以“l(fā)iver cancer”及“hepatocarcinoma”為關(guān)鍵詞，種屬限定為“Homo sapiens”，搜索PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org）、OMIM（http：//www.omim.org）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以GeneCards 得分≥15 分，DisGeNET≥0.10為篩選條件，并集后刪除重復靶點得到肝癌的靶點。

1.3 膽木抗肝癌的作用靶點的獲得

將膽木的靶點與肝癌靶點使用Venny2.1（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，獲得膽木抗肝癌作用靶點。

1.4 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將上述膽木抗肝癌作用靶點上傳到STRING11.5 數(shù)據(jù)庫，設置物種為“Homo Sapiens”及置信度為0.9，隱藏游離靶標，下載TSV 格式文件導入Cytoscape3.9.1 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡圖。運用“Network Analyze”對網(wǎng)絡中基因節(jié)點度值、介數(shù)等進行分析并篩選核心靶點。

1.5 膽木抗肝癌作用靶點的生物學功能和通路富集分析

將膽木抗肝癌的作用靶點導入David 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），設置物種為“Homo Sapiens”，閾值P＜0.05，進行生物學功能和通路富集分析，通過OMishare Tools（https：//www.omicshare.com/tools/）將結(jié)果可視化。

1.6 膽木抗肝癌“藥物-成分-靶點-通路-疾病”相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建

將膽木抗肝癌靶點和成分及前14 富集的信號通路導入到Cytoscape3.9.1，繪制“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡圖。節(jié)點代表藥物、成分、靶點、通路、疾病，通過度值篩選膽木抗肝癌活性成分。

1.7 膽木抗肝癌關(guān)鍵成分與核心靶點的分子對接

活性成分作為配體，在PubChem 中下載關(guān)鍵成份的3D 結(jié)構(gòu)；核心靶點作為受體，從ProteinData-Bank 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載核心靶點的3D 分子結(jié)構(gòu)。將活性成分和核心靶點導入Discovery Studio2019 Client 軟件，再去水、加氫等處理后，用DOCKLigand 進行分子對接，得到活性成分與核心靶點作用關(guān)系圖。

1.8 體外細胞實驗

1.8.1 材料 LX-2 人正常肝細胞、HepG2 肝癌細胞、DMEM 和RPMI-1640 培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素、0.25% 胰酶、PBS 緩沖液、CCK8 試劑盒（APExBIO）、異長春花苷內(nèi)酰胺（購自MedBio，純度≥98%）、Annexin V-APC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（凱基公司）、GAPDH、SRC、STAT3、MAPK3 引物（生工生物工程公司）。

1.8.2 儀器與試劑 可調(diào)量程移液槍、0.22 μm 微孔濾膜、96 孔板、24 孔板、恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱和水浴鍋、精密電子天平、超凈工作臺、流式分析儀（Beckman 公司，型號：cytoflex）、實時熒光定量PCR儀（美國ABI 公司）。

樣品溶液的配制：異長春花苷內(nèi)酰胺用培養(yǎng)基配成濃度為100 mmol/L 的母液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8.3 細胞培養(yǎng)與分組 細胞培養(yǎng)：將LX2、HepG2 細胞接種到新的25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入約4 mL 含10%胎牛血清和1%鏈霉素的RPMI-1640、青霉素或DMEM 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每隔兩天換一次培養(yǎng)液。直至細胞貼壁率約80%～90%，狀態(tài)良好時對細胞進行后續(xù)試驗。

細胞分組：空白組（不含異長春花苷內(nèi)酰胺）、給藥組（異長春花苷內(nèi)酰胺不同濃度組）。

1.8.4 CCK8 測定 取對數(shù)生長期細胞，制成單細胞混懸液，調(diào)整細胞濃度，將細胞以10 000 個/孔的密度接種于96 孔板中，每組設置5 個復孔，用無菌PBS 填充邊緣。37 ℃、5% CO2條件下孵育，次日給藥干預。12 h 后，吸棄96 孔板內(nèi)液體，每孔加入100 μL 含CCK8 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵育1 h。孵育結(jié)束后，在酶標儀450 nm 處測吸光度。

1.8.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取人肝癌HepG2 細胞，以2×105個每孔接種于6 孔板，用0、40、80、120、160 μmol/L 濃度異長春花苷內(nèi)酰胺溶液處理12 h 后，經(jīng)預冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗，用500 μL 的Binding Buffer 重懸細胞。加入Annex-in V-FITC 輕輕吹勻，再加入5 μL 的PI 混勻，室溫避光反應15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8.6 Real-time PCR 檢測 取人肝癌HepG2 細胞，以2×105個每孔接種于6 孔板，用0、40、80、120、160 μmol/L 濃度異長春花苷內(nèi)酰胺溶液處理，12 h后樣本中提取RNA 后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書，以37 ℃，15 min；85 ℃，5 s 進行反轉(zhuǎn)錄。PCR擴增根據(jù)儀器說明書：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，57.5 ℃退火20 s，延伸20 s，循環(huán)反應40 次，95 ℃，15 s，60 ℃溶解持續(xù)60 s。采用溶解曲線，最后統(tǒng)計Ct 值，結(jié)果以GAPDH 為參照，采用2-ΔΔCt相對定量法比較各組目標mRNA 表達差異，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.9 統(tǒng)計學處理

用統(tǒng)計學軟件GraphPad Prism 9.0 整理分析數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差（±s）表示。組間差異比較用t檢驗，方差不齊用非參數(shù)檢驗，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膽木成分的篩選及靶點的獲取

使用化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫以及查找文獻［13-15］，收集膽木的化學成分，再通過檢索PubChem 數(shù)據(jù)庫得到含有分子結(jié)構(gòu)的化合物14 個，主要為：異長春花苷內(nèi)酰胺（DM1）、喜果苷（DM2）、短小蛇根草苷（DM3）、NaucleamideG（DM4）、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（DM5）、阿魏酸乙酯（DM14）、蘆?。―M6）、3，4，5-三甲氧基苯酚（DM7）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（DM8）、2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸甲酯（DM9）、4-羥基-3，5-二甲氧基苯甲醛（DM10）、VinmajineI（DM11）、3-醛基吲哚（DM12）、狹花馬錢堿（DM13）、阿魏酸乙酯（DM14）。按篩選條件將各個數(shù)據(jù)庫預測的膽木靶點合并，得到膽木靶點587 個。其中異長春花苷內(nèi)酰胺是黎藥膽木中主要的活性成分，屬于吲哚類生物堿［6，16］。

2.2 肝癌靶點獲取

按篩選條件，得到的肝癌靶點為GeneCards 數(shù)據(jù)庫1 981 個、OMIM 數(shù)據(jù)庫507 個、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫1 396 個、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫284 個，取并集后得到肝癌的靶點3 319 個，見圖1。

圖1 肝癌對應靶點匹配維恩圖Fig 1 Venn diagram of targets of HCC

2.3 膽木抗肝癌作用靶點獲取

將587 個膽木靶點與3 319 個肝癌靶點導入Venny 2.1，得到288 個共有靶點見圖2，這288 個共有靶點即為膽木抗肝癌作用靶點。

圖2 膽木與肝癌對應靶點匹配維恩圖Fig 2 Venn diagram of Nauclea Officinalis and corresponding targets of HCC

2.4 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將共有靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫后，再導入Cytoscape 3.9.1 軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡圖，包括98 個節(jié)點，794 條邊，見圖3。并在軟件進行網(wǎng)絡拓撲分析，結(jié)果表明TP53、SRC、STAT3、HSP90AA1、PIK3R1、MAPK3 等鄰接節(jié)點最多，且在表2 中膽木抗肝癌PPI 網(wǎng)絡靶點自由度值排名靠前，可能為核心靶點。

圖3 膽木抗肝癌靶點PPI 圖Fig 3 PPI diagram of anti-HCC targets of Nauclea Officinalis

表2 膽木抗肝癌PPI 網(wǎng)絡靶點自由度值排名Tab 2 Ranking of the degree of PPI network targets of Nauclea Officinalis against HCC

2.5 膽木抗肝癌作用靶點的生物學過程和通路富集分析

將膽木抗肝癌靶點進行分析GO、KEGG 富集分析（P＜0.05）。GO 功能富集分析中生物過程（BP）相關(guān)的條目994 個，主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)自身磷酸化、凋亡過程的負調(diào)控等；細胞成分（CC）相關(guān)的條目125 個，關(guān)于胞液、受體復合體、質(zhì)膜、高分子復合物、核漿等方面；分子功能（MF）相關(guān)的條目238 個，主要涉及激酶活性、酶的結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合等，將富集基因數(shù)多的前10 名BP、CC、MF 的生物學過程可視化分析結(jié)果見圖4。KEGG 通路富集分析，膽木抗肝癌靶點主要作用于癌癥通路、乙型肝炎、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗、PI3K-Akt 等信號通路，前20 的KEGG 通路可視化分析結(jié)果見圖5。

圖4 膽木抗肝癌GO 富集分析圖Fig 4 GO function enrichment analysis of anti-HCC targets of Nauclea Officinalis

圖5 膽木抗肝癌靶點KEGG 通路富集圖Fig 5 KEGG pathway enrichment diagram of anti-HCC targets of Nauclea Officinalis

2.6 膽木抗肝癌“藥物-成分-靶點-通路-疾病”相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建

將相關(guān)信息導入Cytoscape3.9.1 構(gòu)建 “藥物-成分-靶點-通路-疾病”相互作用網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡由99 個節(jié)點和406 條邊構(gòu)成，見圖6，經(jīng)分析后，活性成分按照自由度值進行排序，見表3。網(wǎng)絡中膽木可通過多成分作用于多靶點、調(diào)控多條信號通路，發(fā)揮抗肝癌的作用特點。

圖6 膽木-成分-通路-疾病-靶點網(wǎng)絡圖Fig 6 Network diagram of Nauclea Officinalis-ingredient-pathway-HCC-target

表3 膽木-活性成分-抗肝癌靶點網(wǎng)絡自由度值排名Tab 3 Ranking of degree value of drug-active ingredientanti-HCC target network of Nauclea Officinalis

2.7 膽木活性成分與核心靶點的分子對接

將活性成分和核心靶點導入DiscoveryStudio2019Client 軟件，再加水、去氫等處理后，進行分子對接驗證，當LibDockScore 大于105 分，認為該成分與靶標具有較好的結(jié)合活性［17］，取排名靠前的有效活性成分與核心靶點TP53、SRC、STAT3、HSP90AA1、PIK3R1、MAPK3 進行對接驗證，發(fā)現(xiàn)其中TP53、HSP90AA1、PIK3R1 與異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷、短小蛇根草苷結(jié)合能力差。核心靶點SRC、STAT3、MAPK3 與排名靠前的有效化合物的LibDockScore 均高于105 分，說明膽木中的關(guān)鍵成分與核心靶點SRC、STAT3、MAPK3 具有較好的親和性，能發(fā)生相互作用。活性成分與核心靶點的對接分數(shù)較高的結(jié)果見表4，分子對接可視化見圖7～9。

圖7 喜果苷與SRC 靶點的分子對接圖Fig 7 Molecular docking diagram of vincosamide and SRC target

圖8 短小蛇根草苷與MAPK3 靶點分子對接圖Fig 8 Molecular docking diagram of pumiloside andMAPK3 target

圖9 異長春花苷內(nèi)酰胺與MAPK3 靶點分子對接圖Fig 9 Molecular docking diagram of strictosamide and MAPK3 target

表4 分子對接結(jié)果Tab 4 The results of molecular docking.

2.8 體外細胞CCK8 實驗結(jié)果

結(jié)合網(wǎng)絡藥理學結(jié)果，選擇膽木中主要活性成分異長春苷內(nèi)酰胺進行驗證。如圖10 所示，濃度為40～160 μmol/L 的異長春花苷內(nèi)酰胺對LX-2 正常肝細胞生長無抑制作用（P＞0.05）。但是圖11 結(jié)果顯示，分別在80～160 μmol/L 濃度作用12 h 后，異長春花苷內(nèi)酰胺對于HepG2 細胞表現(xiàn)出了顯著的抑制細胞生長的活性（P＜0.001）。因此，異長春花苷內(nèi)酰胺對肝癌HepG2 具有細胞毒性，可抑制肝癌細胞增殖生長，但是對正常LX-2 肝細胞無明顯作用。

圖10 異長春花苷內(nèi)酰胺對LX-2 細胞毒性影響Fig 10 Effect of strictosamide lactam on cytotoxicity of LX-2 cells

圖11 異長春花苷內(nèi)酰胺對HepG2 細胞毒性影響Fig 11 Effect of strictosamide lactam on cytotoxicity of HepG2 cells

2.9 藥物對腫瘤細胞凋亡的影響

不同濃度異長春花苷內(nèi)酰胺（0、40、80、120、160 μmol/L）處理人肝癌HepG2 細胞12 h 后，采用流式細胞術(shù)檢測其對細胞凋亡的影響。圖12 左下象限代表正常細胞，右上象限代表晚期凋亡細胞。與對照組相比，0、40、80、120、160 μmol/L 組中凋亡細胞明顯增多，正常細胞明顯減少。凋亡率分別為15.99%、24.49%、29.16%、36.12%、49.11%（表5）。與對照組相比，隨濃度增加人肝癌HepG2 細胞凋亡率明顯上升（P＜0.001）。

圖12 不同濃度異長春花苷內(nèi)酰胺溶液對細胞凋亡的影響Fig 12 Effect of different concentrations of strictosamide solution on cell apoptosis

表5 不同濃度異長春花苷內(nèi)酰胺溶液對細胞凋亡率的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of different concentrations of strictosamide on cell apoptosis rate（n=3，±s）

表5 不同濃度異長春花苷內(nèi)酰胺溶液對細胞凋亡率的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of different concentrations of strictosamide on cell apoptosis rate（n=3，±s）

注：與空白組相比，***P＜0.001。

凋亡率（%）15.99±1.49 24.49±2.18***29.61±2.13***36.12±0.11***49.11±1.05***組別（μmol/L）0 40 80 120 160

2.10 藥物抑制核心靶點mRNA 的表達

qRT-PCR 檢測不同濃度異長春花苷內(nèi)酰胺（0、40、80、120 μmol/L）作用HepG2 細胞12 h 后，TP53、SRC、STAT3、MAPK3 mRNA 的表達情況。如表6 結(jié)果所示，隨著高異長春花苷內(nèi)酰胺的升高，HepG2 細胞中SRC、STAT3、MAPK3 mRNA 的表達下降（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，異長春花苷內(nèi)酰胺可以下調(diào)HepG2 細胞中SRC、STAT3、MAPK3 mRNA 的表達水平。

表6 異長春花苷內(nèi)酰胺對肝癌HepG2 細胞核心蛋白 mRNA 表達的影響（n=3，±s）Tab 6 Effect of strictosamide on core protein mRNA expression in hepatocellular carcinoma HepG2 cells（n=3，±s）

表6 異長春花苷內(nèi)酰胺對肝癌HepG2 細胞核心蛋白 mRNA 表達的影響（n=3，±s）Tab 6 Effect of strictosamide on core protein mRNA expression in hepatocellular carcinoma HepG2 cells（n=3，±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001。

組別（μmol/L）0 40 80 120 160 MAPK3 1.00±0.03 0.79±0.12**0.81±0.02*0.69±0.41***0.67±0.12***SRC 1.00±0.09 0.82±0.06*0.81±0.08*0.73±0.23**0.48±0.05***STAT3 1.01±0.12 0.86±0.08 0.72±0.08*0.55±0.12***0.31±0.06***

3 討論

肝癌是指發(fā)生在肝臟的惡性腫瘤，其預防和治療仍然是主要的臨床挑戰(zhàn)。對于晚期不能切除的肝癌，藥物治療是主要治療策略。生物堿類化合物是膽木主要化學成分，是目前臨床抗腫瘤研究的關(guān)注點之一。本研究通過網(wǎng)絡藥理學預測膽木抗肝癌的可能活性成分及作用機制，并通過體外細胞實驗進行驗證其抗肝癌活性。

在膽木的14 種活性成分中，預測潛在活性成分生物堿類化合物異長春花苷內(nèi)酰胺、喜果苷、短小蛇根草苷抗肝癌對應靶點最多，且在“藥物-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡中自由度值排名前3。將這3 種化學成分與膽木抗肝癌的關(guān)鍵靶點TP53、SRC、STAT3、MAPK3 進行分子對接，其中SRC、STAT3、MAPK3 靶點對接分數(shù)都大于105 分，提示結(jié)合活性好。利用體外細胞實驗驗證，表明膽木中主要成分異長春花苷內(nèi)酰胺能顯著抑制肝癌HepG2 細胞增殖（P＜0.001）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，生物堿類化合物可以通過抑制端粒酶活性、減少肝癌擴散、誘導肝癌細胞分化和凋亡、抑制肝癌細胞周期和增殖來發(fā)揮抗肝癌作用［18-20］。

PPI 網(wǎng)絡顯示黎藥膽木抗肝癌作用的核心靶點有TP53、SRC、STAT3、MAPK3 等。TP53 是一種腫瘤抑制基因，抑制其TP53 基因突變和表達的肝癌患者預后較好［21，22］。且TP53 可調(diào)節(jié)癌細胞衰老和凋亡［23］。SRC 為首個發(fā)現(xiàn)的原癌基因，影響細胞增殖、遷移、侵襲及血管形成等過程，當SRC 表達下調(diào)時，肝癌疾病進展受到抑制［24-26］。Seo 等［27］研究表明咖啡豆醇能通過抑制SRC 的磷酸化，以及抑制pmTOR 和p-STAT3 來誘導肝癌細胞凋亡。在腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中，STAT3 在癌細胞和非癌細胞中廣泛的過度激活，在對抗腫瘤免疫反應的調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，當STAT3 磷酸化增加會促進肝臟腫瘤的發(fā)生［28，29］。研究表明，當MAPK3 過表達時，肝癌細胞的增殖速率、遷移能力隨之加快［30］。而下調(diào)MAPK3 后，細胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因表達顯著增加［31］。因此，抑制SRC、STAT3、MAPK3 的表達，可能促進肝癌細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)異長春花苷內(nèi)酰胺可下調(diào)肝癌HepG2 細胞SRC、STAT3、MAPK3 mRNA 的表達（P＜0.05），并誘導肝癌細胞凋亡（P＜0.001）。

GO 富集顯示共有靶點在蛋白質(zhì)磷酸化、凋亡過程的負調(diào)控等過程富集。已有研究表明，中藥能通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)磷酸化水平促進凋亡等方式發(fā)揮抗腫瘤作用［32］。核心靶點MAPK3 也是一種蛋白激酶，磷酸化活化STAT3，促進肝臟腫瘤的發(fā)生［29，33］。因此，影響蛋白質(zhì)磷酸化過程參與細胞凋亡可能與膽木抑制MAPK3 表達，發(fā)揮抗肝癌作用密切相關(guān)。KEGG 通路顯示，在癌癥通路和EGFR 受體酪氨酸激酶抑制劑抵抗和PI3K-Akt 信號通路中共有靶點富集較多，提示其可能是膽木抗肝癌潛在通路。癌癥通路，是由NF-κB、MAPK、JAK-STAT 等多條通路匯集而成，其中核心靶點MAPK3 在MAPK 信號通路上，這一通路中相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平的變化與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［30］。核心靶點STAT3、SRC 等基因參與了調(diào)節(jié)EGFR 受體酪氨酸激酶抑制劑抵抗通路。肝癌細胞通過激活這一通路途徑，促進該軸上EGFR、STAT3、SRC 靶點的表達，獲得對一線抗癌藥侖伐替尼的耐藥性［34，35］。此外，研究表明 PI3K-Akt 信號通路被激活時，促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，加快疾病進程［36］。植物素可通過抑制PI3K/Akt 信號通路進而轉(zhuǎn)導PI3K/Akt 的表達，限制肝細胞癌進展［37］。結(jié)合RTPCR 結(jié)果，膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺可抑制SRC、STAT3、MAPK3 基因的表達，初步顯示出膽木可通過作用于SRC、STAT3、MAPK3 等靶點調(diào)節(jié)多條通路，發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述，膽木可能的抗肝癌機制為：膽木中活性成分異長春花苷內(nèi)酰胺、短小蛇根草苷、喜果苷等多種活性物質(zhì)通過SRC、STAT3、MAPK3 等靶點作用于肝癌，通過調(diào)節(jié)癌癥通路、PI3K/Akt 和EGFR 酪氨酸激酶抑制劑抵抗等多重信號通路最終干預肝癌的發(fā)生發(fā)展。體外細胞實驗進一步驗證膽木對肝癌有顯著抑增殖作用、并且可下調(diào)SRC、STAT3、MAPK3 基因表達，促進癌細胞凋亡。本研究為膽木抗肝癌機制研究奠定方向和提供思路，但鑒于網(wǎng)絡藥理學及細胞實驗初步驗證的局限性，膽木抗肝癌的功效及其作用機制仍需進一步研究。

作者貢獻度說明：

陳維佳：細胞實驗、收集數(shù)據(jù)并撰寫論文；徐劍：負責文章構(gòu)思和審核；其余作者參與文章潤色和格式校正。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。