王 旺,熊康平,錢開宇,2,王行環(huán)

(1.武漢大學中南醫(yī)院泌尿外科,湖北武漢 430071;2.湖北省人類遺傳資源保藏中心,湖北武漢 430071)

膀胱癌當前是泌尿系統(tǒng)最常見的癌癥,復發(fā)率和死亡率都很高[1]。非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)是膀胱癌中最常見的類型,約占膀胱癌患者的75%。NMIBC具有復發(fā)頻繁、疾病進展風險高的特點,5年復發(fā)率為50%～70%,5年進展率為10%～30%。經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)聯(lián)合膀胱內(nèi)化療或膀胱內(nèi)免疫治療是NMIBC的推薦治療方法。但是仍然有40%～50%的NMIBC患者最終會進展為肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)[2],新輔助化療聯(lián)合根治性膀胱切除術(shù)是MIBC的推薦治療方法。新輔助化療是能夠顯著改善膀胱癌患者預后和生存質(zhì)量的必要手段[3]。近年來人們提出了一些新的治療方案,如使用順鉑、吉西他濱等,但是這些藥物毒副作用較大,可引起諸如中性粒細胞和血小板減少等不良反應,且患者的5年生存率并沒有得到顯著改善[4]。因此,繼續(xù)探索并發(fā)現(xiàn)新的有效的化療藥物很有必要。

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在基因轉(zhuǎn)錄和表達過程中發(fā)揮著重要作用,能夠使組蛋白發(fā)生乙?；M而調(diào)控轉(zhuǎn)錄,維持細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄修飾及蛋白表達的平衡[5]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT7(histone acetyltransferase KAT7,KAT7)已經(jīng)被鑒定為膀胱癌的癌基因[6]。WM-3835是一種新的KAT7特異性抑制劑,能夠有效抑制骨肉瘤、非小細胞肺癌和去勢抵抗性前列腺癌等癌癥的增殖和遷移,并促進細胞凋亡[7-9]。然而,WM-3835對人膀胱癌的效果尚不明確。本研究采用不同濃度WM-3835處理膀胱癌細胞,初步發(fā)現(xiàn)WM-3835通過抑制組蛋白乙?；{(diào)控轉(zhuǎn)錄的方式影響膀胱癌細胞的增殖和遷移,旨在為臨床轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)膀胱癌細胞系UM-UC-3、T24來自中國科學院上海典型培養(yǎng)物保藏委會細胞庫。UM-UC-3采用DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng),T24采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。WM-3835購自中國selleck生物有限公司(貨號:S9805)。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco生物有限公司。β-actin(稀釋比例1∶200)、cyclin-D1(稀釋比列1∶1 000)、PCNA(稀釋比列1∶1 000)、MMP9(稀釋比列1∶1 000)、N-cadherin(稀釋比列1∶500)抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。細胞周期染色試劑盒購自武漢沃萊邦德貿(mào)易有限公司。

1.2 噻唑藍(MTT)實驗細胞消化重懸,以3×103個/孔接種于96孔板。24 h后棄去原有培養(yǎng)基,向每孔中加入200 μL含WM-3835(0、10、20、30、40 μmol/L)的完全培養(yǎng)基。給藥48 h后,添加20 μL MTT(5 mg/mL),37 ℃避光孵育4 h。小心吸去上清液,添加150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解沉淀,使用酶標儀(SpectraMax,USA)檢測570 nm波長處吸光度值。設(shè)定0 μmol/L的WM-3835處理下各細胞系吸光度值為100%細胞活力,10、20、30、40 μmol/L的WM-3835處理后各細胞系的細胞活力/%=各濃度的吸光度值/0 μmol/L的吸光度值×100%。

1.3 流式細胞術(shù)用不同濃度WM-3835(0、10、20 μmol/L)處理UM-UC-3和T24細胞24 h。消化并收集細胞沉淀,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗細胞沉淀3次,依次加入500 μL緩沖液、破膜劑和PI染液。室溫下避光孵育30 min后,用流式細胞儀(Beckman,USA)檢測細胞周期分布比例,統(tǒng)計分析不同藥物濃度下細胞G0/G1期分布比例。

1.4 細胞劃痕實驗將膀胱癌細胞系UM-UC-3和T24細胞按2×105個/孔的密度接種于六孔板內(nèi),細胞匯合度>95%時,使用200 μL移液槍頭輕劃細胞表面。PBS洗凈懸浮細胞,加入1% FBS培養(yǎng)基(含WM-3835 0、10、20 μmol/L),在劃痕后0 h和24 h分別觀察細胞遷移距離并拍照記錄。設(shè)定0 μmol/L WM-3835處理下各細胞系遷移率為100%,10、20 μmol/L的WM-3835處理后各細胞系的遷移率/%=各濃度遷移距離/0 μmol/L的遷移距離× 100%。

1.5 Transwell實驗消化并收集細胞沉淀,用含WM-3835的無血清培養(yǎng)基重懸UM-UC-3細胞和T24細胞。實驗使用孔徑為8 μm Transwell小室(Corning,USA)。在上室中加入100 μL 細胞懸液,下室加入600 μL完全培養(yǎng)基,UM-UC-3細胞密度為3.5×105個/mL,T24細胞密度為4.0 × 105個/mL。培養(yǎng)箱孵育24 h后,用4%多聚甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染色10 min,自來水洗去多余結(jié)晶紫。用棉簽擦去上室未遷過去的細胞,熒光顯微鏡(Leica,German)觀察細胞并拍照,通過計算細胞遷移數(shù)目比較細胞遷移能力。

1.6 實時熒光定量PCR分析使用RNeasy Mini Kit(貨號:#74101,Qiagen,德國)分離膀胱癌細胞總RNA。使用ReverTrace qRT-PCR Kit (Toyobo,中國)進行逆轉(zhuǎn)錄反應,合成cDNA。反應體系為:0.5 μL引物、1 μL cDNA、 3.5 μL 無RNA酶水和5 μL 2×SYBR Green mix (Biolight,中國)。引物序列如下,β-actin-F:GATCCACATCTGCTGGAAG;β-actin-R:CAGCACAATGAAGATCAAGA;cyclin-D1-F:CAATGACC CCGCACGATTTC;cyclin-D1-R:CATGGAGGGCGGATTGGAA;PCNA-F:CCTG

CTGGGATATTAGCTCCA;PCNA-R:

CAGCGGT

AGGTGTCGAAGC;MMP9-F:

TCTTCCCTGGAG

ACCTGAGA;MMP9-R:GAGTGTAACCATAGCG

GTACAGG;N-cadherin-F:

TGCGCGTGAAGGTT

TGCCAGT;N-cadherin-R:TGGCGTTCTTTATCC

CGGCGT。以β-actin為內(nèi)參,以0 μmol/L WM-3835處理下轉(zhuǎn)錄水平為基準(100%),計算并比較不同濃度WM-3835處理后基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.7 免疫印跡實驗膀胱癌細胞UM-UC-3經(jīng)不同濃度WM-3835孵育24 h,消化后離心收集細胞,放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液(添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)于冰上裂解細胞,離心取上清,二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法檢測蛋白濃度并調(diào)整至同一濃度,加入5×SDS loading buffer混勻,95 ℃加熱10 min。選擇10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜(Millipore,USA),轉(zhuǎn)膜時恒定電流為275 mA,時間為60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%奶粉封閉,選擇相應一抗4 ℃孵育至少8 h,二抗室溫孵育1 h。蛋白質(zhì)條帶使用化學發(fā)光試劑盒顯示(Bio-Rad,USA),由分子成像儀CheiDocXRS顯影記錄。使用Image J 軟件計算蛋白灰度值。以β-actin為內(nèi)參,以0 μmol/L WM-3835處理下蛋白表達水平為基準(100%),計算并比較不同濃度WM-3835處理后蛋白表達水平的變化。

2 結(jié) 果

2.1 WM-3835抑制膀胱癌細胞增殖用不同濃度的WM-3835(0、10、20、30、40 μmol/L)處理膀胱癌細胞48 h,發(fā)現(xiàn)WM-3835能夠顯著抑制UM-UC-3細胞和T24細胞增殖,且呈現(xiàn)濃度依賴性。此外,WM-3835表現(xiàn)出對膀胱腫瘤細胞更強的抑制效果,20 μmol/L WM-3835對正常尿路上皮細胞的抑制效果較小(圖1)。后繼實驗選擇0 μmol/L WM-3835為空白對照組,10 μmol/L為低濃度組,20 μmol/L為高濃度組。

圖1 不同濃度WM-3835對膀胱癌細胞增殖的抑制情況

2.2 WM-3835影響膀胱癌細胞周期分布WM-3835處理膀胱癌細胞24 h后,通過細胞流式儀檢測UM-UC-3和T24的細胞周期分布變化,發(fā)現(xiàn)給藥后,低濃度組和高濃度組都誘導膀胱癌細胞發(fā)生G0/G1期阻滯(圖2)。

2.3 WM-3835抑制膀胱癌細胞的遷移在用WM-3835處理UM-UC-3和T24細胞系24 h后,通過劃痕實驗檢測不同濃度WM-3835對膀胱癌細胞遷移能力的影響。發(fā)現(xiàn)WM-3835能夠顯著的抑制膀胱癌細胞的遷移能力,且高濃度組的效果比低濃度組更有效(圖3)。采用Transwell實驗方法檢測了WM-3835對膀胱癌細胞遷移的影響,遷移結(jié)果與劃痕實驗結(jié)果一致(圖4)。

A:劃痕實驗檢測不同濃度WM-3835下UM-UC-3細胞遷移情況的顯微鏡下觀;B:不同濃度WM-3835對UM-UC-3細胞遷移距離的影響;C:劃痕實驗檢測不同濃度WM-3835下T24細胞遷移情況的顯微鏡下觀;D:不同濃度WM-3835對T24細胞遷移距離的影響;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

A:Transwell實驗檢測不同濃度WM-3835下UM-UC-3細胞遷移情況的顯微鏡下觀;B:不同濃度WM-3835對UM-UC-3細胞遷移個數(shù)的影響;C:Transwell實驗檢測不同濃度WM-3835下T24細胞遷移情況的顯微鏡下觀;D:不同濃度WM-3835對T24細胞遷移個數(shù)的影響;**P<0.01,***P<0.001。

2.4 WM-3835抑制膀胱癌細胞增殖和遷移相關(guān)蛋白的表達用不同濃度WM-3835處理UM-UC-3細胞系24 h后,通過實時熒光定量PCR分析和免疫印跡實驗檢測細胞增殖標志物cyclin-D1和PCNA以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物N-cadherin和MMP9的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達量。免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)上述標志物在WM-3835處理后蛋白表達水平均顯著降低(圖5A、B),實時熒光定量PCR分析顯示以上標志物的基因轉(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)了下調(diào)(圖5C),且蛋白及轉(zhuǎn)錄水平都隨給藥濃度的升高而降低。

A:免疫印跡法檢測不同濃度WM-3835下UM-UC-3細胞增殖和遷移標志物蛋白表達的電泳條帶;B:不同濃度WM-3835下UM-UC-3細胞增殖和遷移標志物蛋白表達的定量分析;C:不同濃度WM-3835下UM-UC-3細胞增殖和遷移相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平;**P<0.01,***P<0.001。

3 討 論

膀胱癌是全球最常見的泌尿系統(tǒng)癌癥,復發(fā)率和死亡率都很高[3]。迄今為止,使用化療藥物進行局部或全身化療仍然是輔助手術(shù)治療膀胱癌的最佳治療和干預措施。鑒于膀胱切除術(shù)后的高遠處復發(fā)和局部區(qū)域復發(fā)的發(fā)生率較高,需要積極進行局部和全身治療[2-3]。圍手術(shù)期化療(無論是新輔助化療還是輔助化療)已被用于提高患者生活質(zhì)量和預后生存。而目前臨床上常用的化療藥物,如吉西他濱、吡柔比星、順鉑等,都具有一系列不同程度的副作用[10-12]。本實驗室前期也檢測了一系列用于膀胱癌輔助化療的新藥,例如依澤麥布和香菇多糖能夠通過誘導細胞發(fā)生周期阻滯和抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進展來抑制膀胱癌的增殖和遷移[13-14]。

作為腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ),癌基因的突變和上調(diào)在腫瘤檢測中經(jīng)常被觀察到。此外,越來越多的證據(jù)表明,癌基因的異常激活常?？蓺w因于轉(zhuǎn)錄異常激活和翻譯后修飾,例如乙?；揎梉15]。組蛋白乙?；窴AT5可以通過使組蛋白H2A乙?；瘉碚{(diào)控Hoxa9基因表達,進而影響急性髓系白血病的進展[16]。在胃癌中,組蛋白乙?；窧RD4的高表達促進了胃癌的進展和轉(zhuǎn)移,其機制為BRD4以乙酰化依賴性方式識別轉(zhuǎn)錄因子slug上的乙?；嚢彼?防止其被E3泛素連接酶識別,從而抑制slug的多泛素化和蛋白酶體降解[17]。這些結(jié)果清楚地表明乙?；钦{(diào)節(jié)癌基因轉(zhuǎn)錄和修飾的一種重要手段。因此,特異性靶向調(diào)控癌基因乙?；せ畹男》肿右种苿┛赡芴峁┮种瓢┑鞍谆钚缘男峦緩?從而延緩腫瘤發(fā)生。KAT7通過催化多個賴氨酸殘基的H4和H3組蛋白乙?；瘜θ旧|(zhì)空間結(jié)構(gòu)進行重構(gòu),從而促進轉(zhuǎn)錄,它對基因轉(zhuǎn)錄和表達、細胞自我更新、免疫反應調(diào)節(jié)和發(fā)育具有重要意義[18]。WM-3835是KAT7的特異性抑制劑,在其他癌癥中的作用已經(jīng)有了大量的研究報道。例如,WM-3835可有效抑制非小細胞肺癌的細胞生長,5 μmol/L的WM-3835即可顯著抑制非小細胞肺癌的增殖活力[7]。在體內(nèi)和體外實驗中驗證了WM-3835對骨肉瘤的抑制作用,它能夠激活骨肉瘤細胞凋亡,有效抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移[8]。然而,WM-3835在膀胱癌中的作用效果目前尚未見報道,所以我們對此進行了研究。

本研究采用MTT、流式細胞術(shù)和免疫印跡等實驗揭示了WM-3835可抑制膀胱癌細胞UM-UC-3和T24增殖和遷移。經(jīng)WM-3835處理后,UM-UC-3和T24細胞的增殖能力得到了顯著抑制,在同一濃度下,WM-3835對正常尿路上皮細胞的殺傷效果很弱。膀胱癌細胞的周期分布出現(xiàn)了G0/G1期阻滯,這可能是WM-3835抑制細胞增殖的原因,而且遷移能力也得到了顯著地抑制(P<0.05)。采用不同濃度WM-3835處理膀胱癌細胞UM-UC-3可有效抑制周期蛋白cyclin-D1和增殖標志物蛋白PCNA的表達,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物MMP9和N-cadherin的蛋白表達也下調(diào),這可能是通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明,WM-3835可能是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄來誘導膀胱癌細胞周期阻滯和抑制膀胱癌細胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而抑制膀胱癌細胞增殖和遷移。WM-3835的體內(nèi)抗腫瘤研究及生物安全性評價有待后續(xù)進一步研究。

綜上所述,WM-3835可以抑制膀胱癌腫瘤的增殖和遷移,具有顯著的體外抗腫瘤活性,體內(nèi)抗腫瘤效果也在其他癌癥中得到驗證。WM-3835具有成為膀胱癌術(shù)前新輔助化療及術(shù)后化療用藥的潛力。