張孟釗,岳陽陽,姜云中,李 延,范晉海

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院:1.泌尿外科,2.血管外科,陜西西安 710061)

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是腎臟腫瘤中最常見的病理類型,約占腎臟腫瘤的90%,也是成人泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,約占成人惡性腫瘤的2.2%[1-2]。其中腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是腎細胞癌中最常見的類型,約占腎細胞癌的70%[3]。ccRCC起病隱匿,多數(shù)患者在就診時已經(jīng)處于晚期而錯過了最佳的手術(shù)時機[4]。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療仍是改善ccRCC患者預(yù)后的首選策略。

KIF14是驅(qū)動蛋白家族(kinesin family member,KIFs)發(fā)揮重要作用的一員,其主要生物學(xué)功能為通過調(diào)控有絲分裂過程中紡錘體的形成、促進染色質(zhì)的凝集、染色體和胞漿的分離這一完整的細胞有絲分裂過程,促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5]。雖然目前已有很多關(guān)于KIF14在腫瘤中發(fā)揮作用的報道,也證實KIF14在多種腫瘤惡性進展中發(fā)揮重要作用,但與ccRCC的相關(guān)性尚未有報道。本課題組通過數(shù)據(jù)分析并設(shè)計相關(guān)實驗,對KIF14在ccRCC中的表達譜,生物學(xué)功能及其與免疫細胞浸潤的相關(guān)性進行了初步探究,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 KIF14在ccRCC組織和正常組織的表達差異分析在TCGA官網(wǎng)(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載TCGA-KIRC轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù),包含539個腫瘤組織和72個癌旁正常組織。使用R語言對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行處理和可視化分析。分析KIF14在ccRCC組織和癌旁組織的表達差異。GEO官網(wǎng)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載包含ccRCC腫瘤和正常組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并使用在線分析工具(GEO2R)進行在線分析,探究KIF14在ccRCC組織和正常組織之間的差異表達性。

1.2 KIF14蛋白的表達譜差異分析運用人類蛋白質(zhì)表達圖譜(the human protein atlas,HPA)數(shù)據(jù)庫[6]和基于ccRCC患者組織芯片(HKid-CRC030 PG-01)的免疫組化染色,探究KIF14蛋白在ccRCC組織和正常組織的表達譜差異。

1.3 KIF14表達與臨床病理特征的相關(guān)性及其預(yù)后價值采用Ualcan數(shù)據(jù)庫[7]分析KIF14在ccRCC中的表達與患者的年齡、性別、腫瘤子類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期以及病理分級之間的相關(guān)性。運用R軟件并結(jié)合survival包對總的生存期(overall survival,OS)、疾病特異生存期(disease specific survival,DSS)和無進展間隔(progress free interval)進行COX回歸分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析用Genemania網(wǎng)站[8]來構(gòu)建蛋白與蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction,PPI)分析。Linkedomics網(wǎng)站[9]用來構(gòu)建與KIF14表達正相關(guān)和負相關(guān)的共表達網(wǎng)絡(luò)。

1.5 免疫細胞浸潤相關(guān)性分析使用Timer數(shù)據(jù)庫[10]分析ccRCC中KIF14的表達與B cell、T cell CD4、T cell CD8、Neutrophil、Macrophage和Dendritic Cell 6種免疫細胞浸潤之間的相關(guān)性以及KIF14的表達水平與單核細胞(Monocyte)、腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor-associated macrophages,TAM)、M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞標志物的相關(guān)性。

1.6 KIF14低表達細胞模型構(gòu)建生長狀態(tài)良好的ccRCC細胞系786-O和OS-RC-2使用lipofectamine 2000將siRNA對照組si-NC和敲低組si-KIF14進行細胞轉(zhuǎn)染, 并使用Western blot實驗進行敲低效率的驗證。KIF14 siRNA的靶向序列為:si-NC,5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′;si-KIF14,5′-CAGCGGUGAUAUUCUUGAUTT-3′。

1.7 KIF14生物學(xué)功能驗證細胞轉(zhuǎn)染siRNA 48 h之后,使用MTT實驗驗證細胞的生長活性;使用平板克隆實驗驗證細胞的集落形成能力;使用碘化丙啶(PI)和Rnase A處理之后流式細胞儀檢測細胞周期分布驗證細胞周期改變;使用含或者不含基質(zhì)膠的Transwell小室驗證細胞的遷移和侵襲能力的變化[11]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用R軟件和GraphPad軟件對本研究中的數(shù)據(jù)進行分析和處理,若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,采取單因素方差分析(one-way ANOVA),若不符合正態(tài)分布,采取非參數(shù)檢驗。剩余的數(shù)據(jù)均為在線分析時自動生成。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KIF14在ccRCC和正常組織中的表達差異HPA數(shù)據(jù)庫以及ccRCC組織芯片的免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry,IHC)檢測發(fā)現(xiàn)KIF14在ccRCC腫瘤組織中的表達顯著高于癌旁正常組織(圖1A、B)。將TCGA-KIRC中腫瘤和癌旁正常組織中KIF14的轉(zhuǎn)錄水平進行整理后分析發(fā)現(xiàn)KIF14 ccRCC組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織(P<0.05,圖1C)。與此同時,GEO數(shù)據(jù)集GSE68417和GSE40435中KIF14在ccRCC腫瘤組織中的表達也顯著高于正常組織(P<0.05,圖1D)。

A:HPA數(shù)據(jù)庫中KIF14在ccRCC以及正常腎臟組織中的表達差異;B:KIF14在ccRCC組織(n=15)以及對應(yīng)的癌旁正常組織(n=15)中的表達差異;C:TCGA-KIRC數(shù)據(jù)庫配對以及非配對分析KIF14在ccRCC組織及正常腎臟組織中的表達差異;D:GEO數(shù)據(jù)庫(GSE68417和GSE40435)分析KIF14在ccRCC組織以及正常腎臟組織中的表達差異。標尺=100 μm,**P<0.01,***P<0.001。

2.2 KIF14的表達與ccRCC患者臨床病理特征的相關(guān)性前期結(jié)果已經(jīng)證實KIF14在ccRCC中高表達,我們繼而利用Ualcan數(shù)據(jù)庫分析KIF14的表達水平與ccRCC患者臨床病理特征之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)KIF14的mRNA表達水平在不同年齡階段的患者中沒有明顯的差異(圖2A)。KIF14在男性患者中的mRNA表達水平高于女性患者 (P<0.05,圖2B)。ccRCC根據(jù)患者基因表達差異和臨床預(yù)后的差別分為ccA(預(yù)后較好)和ccB(預(yù)后較差)兩種亞型[12]。我們發(fā)現(xiàn)在ccRCC的子類型中ccB subtype中KIF14的mRNA表達量也高于ccA subtype類型(P<0.05,圖2C)。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中KIF14的mRNA表達水平也高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05,圖 2D),提示KIF14可能參與了腫瘤的局部或遠處轉(zhuǎn)移過程。與此同時我們發(fā)現(xiàn)KIF14在ccRCC中的表達水平與患者的臨床分期和病理分級呈正相關(guān)(P<0.05,圖2E～F)。

A:ccRCC患者年齡;B:性別;C:分子亞型;D:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;E:腫瘤分期;F:組織學(xué)分級。ccA:預(yù)后較好;ccB:預(yù)后較差。ns:無意義,**P<0.01,***P<0.001。

2.3 KIF14的表達水平與ccRCC患者臨床預(yù)后的關(guān)系我們進一步分析KIF14表達與ccRCC患者的OS、DSS、PFS的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn) KIF14表達水平越高患者的預(yù)后越差(P<0.05,圖3A～C)。與此同時,我們采用COX回歸模型分析各病理因素對ccRCC患者生存率的影響(圖3C、D)。單因素分析顯示KIF14的表達、年齡以及TNM分期是影響ccRCC患者OS的因素,多因素分析顯示KIF14的表達、年齡以及TNM分期同樣也是影響ccRCC患者總生存率的獨立危險因素。

A～C:KIF14在ccRCC患者中的表達水平與臨床預(yù)后(OS、DSS、PFI)的相關(guān)性分析;D、E:基于COX回歸模型的單因素和多因素分析。Reference:參考。

2.4 KIF14共表達基因的篩選和GO/KEGG富集分析Linkedomics數(shù)據(jù)庫對KIF14的共表達基因進行篩選和排序,并把P<0.05作為基因入選差異基因的門檻。我們把篩選出的正相關(guān)基因和負相關(guān)基因按照基因差異性和相關(guān)性以火山圖的形式進行展示(圖4A)。與此同時篩選出前50個KIF14正相關(guān)和負相關(guān)的基因以熱圖形式展示,結(jié)果顯示與KIF14表達最相關(guān)的基因為CENPF、ASPM、KAT5、BAG1等(圖4B、C)。我們將挑選與KIF14表達最相關(guān)的top 500個基因,使用R軟件進行聚類富集分析和可視化,并以氣泡圖的形式進行展示,發(fā)現(xiàn)KIF14的共表達基因主要在Go生物學(xué)過程(biological processes,BP)中參與了細胞核分裂、細胞器裂變、DNA復(fù)制、細胞黏附以及細胞周期的正向調(diào)控等(圖4D),在細胞學(xué)組分(cellular components,CC)中主要定位于染色體的著絲粒、微管、有絲分裂紡錘體和驅(qū)動蛋白復(fù)合體等部位(圖4E),分子生物學(xué)功能(molecular function,MF)方面主要參與了微管蛋白結(jié)合,ATP酶活性,DNA解旋酶活動以及DNA聚合酶活性等功能(圖4F),KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)KIF14及其共表達基因主要參與了細胞周期,卵母細胞減數(shù)分裂和P53信號通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(圖4G)。其中與細胞周期信號通路的聯(lián)系(count=29)和差異性(P<0.05)最為明顯。我們將Top 500基因標記為紅色帶入KEGG網(wǎng)站(https://www.kegg.jp/kegg/)進行分析并制作細胞周期線路圖(圖5)對基因位置進行展示以紅色為標記,發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因主要與G1/S期和G2/M期相關(guān)。結(jié)合以上結(jié)果我們認為KIF14在ccRCC中可能通過促進細胞有絲分裂,調(diào)控細胞周期來促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

A:LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析與KIF14表達相關(guān)性基因的火山圖;B:與KIF14表達正相關(guān)的前50個基因熱圖;C:與KIF14表達負相關(guān)的前50個基因熱圖;D～G:基于KIF14共表達基因的功能和信號通路富集分析(BP、CC、MF、KEGG)。

圖5 KIF14的共表達基因在細胞周期信號通路圖中的定位

2.5 KIF14蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Genemania網(wǎng)站根據(jù)蛋白之間物理的相互作用、基因的共表達、共定位、共享的蛋白結(jié)構(gòu)域、基因的相互作用、信號通路及網(wǎng)站預(yù)測等篩選出了前20個已經(jīng)證實或者高度預(yù)測的可能與KIF14相互作用的蛋白,包括CIT、CENPE、GORASP1、KIF23、KIF11、KIFBP、KIFC1、GTSE1、SNRPG、TOP2A、CENPF、PRC1、ARHGAP11A、SIRT7、TUBB1、KIF4A、SMC4、HMMR、MKI67、TRIM32(圖6)。

圖6 KIF14的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.6 KIF14在ccRCC組織中的表達水平與免疫浸潤之間的關(guān)系Timer數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)KIF14的表達與腫瘤的純度之間存在明顯的負性相關(guān)關(guān)系(r=-0.183,P<0.001)。但KIF14的表達與免疫細胞浸潤之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系,其相關(guān)性和差異性為:B細胞 (r=0.358,P<0.001)、CD4+T細胞 (r=0.268,P<0.001)、CD8+T細胞(r=0.28,P<0.001)、中性粒細胞(r=0.459,P<0.001)、巨噬細胞(r=0.31,P<0.001) 和樹突狀細胞(r=0.467,P<0.001)(圖7)。我們從上述結(jié)果中發(fā)現(xiàn)KIF14的表達與巨噬細胞有明顯的正相關(guān)關(guān)系,巨噬細胞作為腫瘤微環(huán)境中最重要且占比最大的一類免疫細胞在腫瘤的惡性進展過程中發(fā)揮著極其重要的作用[13]。進一步我們通過Timer數(shù)據(jù)庫中Correlation模塊分析發(fā)現(xiàn)KIF14與單核細胞表面標記物(CD86、CSF1R),巨噬細胞表面標記物(CD68、IL10),M1型的巨噬細胞表面標記物(IRF5、PTGS2)以及M2型的巨噬細胞表面標記物(CD163、VSIG4和MS4A4A)都存在正相關(guān)關(guān)系(P<0.05,圖8)。以上結(jié)果證實KIF14與免疫細胞浸潤之間存在正相關(guān)關(guān)系,且與巨噬細胞的浸潤密切相關(guān)。

圖7 ccRCC組織中KIF14的表達與免疫浸潤的相關(guān)性

圖8 ccRCC中KIF14與Monocyte、TAM、M1 及 M2 細胞的表面標志物的相關(guān)性

2.7 敲低KIF14表達可以抑制ccRCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力前期結(jié)果提示KIF14在調(diào)控細胞增殖和細胞周期中發(fā)揮重要作用。為了進一步探究KIF14在ccRCC中的功能。我們通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制了KIF14的蛋白表達水平(圖9A)。MTT實驗發(fā)現(xiàn),抑制KIF14的表達之后細胞的增殖活力受到顯著的抑制(圖9B)。平板克隆試驗也證實抑制KIF14的表達水平可以明顯抑制ccRCC細胞的集落形成能力(圖9C)。我們進一步通過流式細胞儀周期檢測發(fā)現(xiàn),抑制KIF14的表達可以導(dǎo)致ccRCC細胞出現(xiàn)G1期阻滯,使處于G1期的細胞不能順利地進入S期(圖9D)。Transwell侵襲和遷移實驗也證實敲低KIF14可以明顯抑制ccRCC細胞的遷移和侵襲能力(圖9E、F)。以上結(jié)果證實KIF14的表達對維持ccRCC細胞的惡性進展作用至關(guān)重要,抑制KIF14表達就可以抑制ccRCC的增殖、遷移和侵襲潛能。

A:KIF14表達的敲低效率;B:MTT檢測ccRCC細胞的增殖活力;C:平板克隆實驗檢測ccRCC細胞的克隆形成能力;D:流式細胞儀檢測ccRCC細胞周期分布;E、F:Transwell實驗檢測ccRCC細胞的遷移和侵襲能力;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3 討 論

RCC作為泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,近些年來的發(fā)病率以超2%的速度迅速發(fā)展,占據(jù)了成人所有惡性腫瘤的2%～3%,每年新增因腎癌死亡的患者超過100 000例[14-15]。ccRCC作為RCC中最常見的病理類型(約占60%～85%)受到廣泛研究。由于ccRCC起病隱匿,早期無特異性的癥狀,因此在初次確診的患者中約20%就已經(jīng)進展為轉(zhuǎn)移性的腎細胞癌,造成患者預(yù)后不良。因此尋找與ccRCC惡性進展和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性分子和關(guān)鍵的分子機制,是提高ccRCC早期診斷率、開發(fā)更為有效治療手段的基礎(chǔ)。

驅(qū)動蛋白家族(KIFs)是一種較為保守的ATP依賴和微管依賴的運動蛋白,包含多達45種不同的驅(qū)動蛋白[16]。KIF14作為新發(fā)現(xiàn)的驅(qū)動蛋白,在細胞有絲分裂、染色體分離、胞質(zhì)分裂以及微管聚合物的形成過程中發(fā)揮著重要的作用。其在細胞內(nèi)的異常表達則會導(dǎo)致細胞有絲分裂的紊亂、細胞分裂不完全、細胞核內(nèi)染色體分離障礙,導(dǎo)致雙核或多核出現(xiàn),從而引起細胞的異常增殖和分化,引發(fā)腫瘤[17]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KIF14在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌和肺癌中存在異常的表達且均與腫瘤的惡性進展密切相關(guān)。例如KIF14在乳腺癌組織中異常的高表達并與腫瘤的分期、侵襲轉(zhuǎn)移能力和臨床預(yù)后密切相關(guān)[18]。KIF14在30%的漿液性卵巢癌和63.6%的原發(fā)性漿液性卵巢癌組織中都出現(xiàn)表達上調(diào),參與調(diào)控卵巢癌的增殖和集落形成,并與患者的復(fù)發(fā)呈正相關(guān),且可以作為卵巢癌預(yù)測預(yù)后的標記物[19-20]。研究發(fā)現(xiàn),KIF14在肝癌中表達升高,且與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。體內(nèi)外實驗同時證實KIF14的高表達可以通過促進肝癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移并抑制凋亡來促進肝癌的惡性進展[21]。上述研究充分表明KIF14在多種腫瘤中發(fā)揮著促癌基因的作用,但其在ccRCC中的表達和功能目前仍然不是很清楚。

我們在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中下載ccRCC組織及正常組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析發(fā)現(xiàn)相較于正常組織,KIF14在ccRCC組織中高表達。將KIF14的表達水平與ccRCC患者臨床病理特征進行分析發(fā)現(xiàn),KIF14的表達與患者的分期、分級和淋巴轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān),并且KIF14的表達水平越高,患者預(yù)后越差。與此同時通過COX單、多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)KIF14可以作為預(yù)測ccRCC患者預(yù)后的獨立危險因素。為了進一步闡明KIF14在ccRCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的生物學(xué)功能和可能涉及的信號通路,我們首先通過蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)了與KIF14可能存在直接或者間接相互作用的20個蛋白分子,其中KIF23、KIF11和TOP2A均已經(jīng)證實在ccRCC的進展中發(fā)揮了促癌作用[22-24]。與此同時,對Top 500共表達基因的GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)KIF14可能主要參與了細胞核分裂、胞漿分離等有絲分裂過程并涉及細胞周期、P53信號通路等生物學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。KEGG的細胞周期調(diào)控基因分布圖也展示了這些共表達基因參與調(diào)控了細胞周期的全過程,包括G1/S和G2/M。我們結(jié)合KIF14基因的相關(guān)背景知識認為其在ccRCC中通過調(diào)控細胞有絲分裂過程,促進細胞周期轉(zhuǎn)換和調(diào)控p53信號通路發(fā)揮其促癌作用。與此同時,體外功能學(xué)實驗也證實抑制KIF14的表達就可以抑制ccRCC細胞的惡性增殖、遷移和侵襲潛能。因此KIF14的表達在ccRCC惡性進展過程中至關(guān)重要。此外KIF14與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系此前也未見相關(guān)報道,我們通過Timer數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)KIF14在ccRCC中與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的免疫浸潤均呈正相關(guān)關(guān)系,并且與單核細胞、腫瘤相關(guān)TAM、M1型的巨噬細胞以及M2巨噬細胞的標志物之間都存在較為明顯的正相關(guān)關(guān)系,提示KIF14可能會驅(qū)動免疫細胞浸潤,尤其是通過招募腫瘤相關(guān)巨噬細胞來促進ccRCC的發(fā)生、發(fā)展,但其是否可作為免疫治療的靶點分子仍需進一步地研究證實。

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)KIF14在ccRCC中表達升高,且KIF14的表達與患者的臨床分期、病理分級、臨床預(yù)后以及免疫細胞浸潤之間均存在明顯的相關(guān)性。同時我們發(fā)現(xiàn)KIF14主要是通過調(diào)控有絲分裂和細胞周期等生物學(xué)過程來影響細胞增殖潛能,并通過影響細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能以及通過影響免疫細胞浸潤對ccRCC的進展發(fā)揮調(diào)控作用。故KIF14具有作為早期診斷和預(yù)測ccRCC患者臨床預(yù)后標志物的潛力,但仍需更多的分子生物學(xué)的實驗進行研究和證實。