唐小涵，陳金蓉，蘇炳銀，李淑蓉△，解學(xué)敏△

1.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室組織胚胎學(xué)教研室（成都 610500）；2.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室（成都 610500）

BCL11A基因座位于人類染色體2p16.1，編碼krüppel樣鋅指蛋白[1]。BCL11A在血液和神經(jīng)組織中呈高表達(dá)，可調(diào)節(jié)血紅蛋白的轉(zhuǎn)化并介導(dǎo)B細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)生[2]。BCL11A是皮質(zhì)發(fā)育所必需的關(guān)鍵因子[3]，在皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程中，BCL11A調(diào)控神經(jīng)元從多極形態(tài)到雙極形態(tài)的轉(zhuǎn)換，從而參與深層皮質(zhì)中的投射神經(jīng)元形成[4-5]。BCL11A缺陷的神經(jīng)元表現(xiàn)為輻射遷移受損和Semac3c的過(guò)表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)智能障礙（intellectual disability，ID）關(guān)聯(lián)基因TBR1 在皮質(zhì)中的表達(dá)，導(dǎo)致ID[6]。

ID的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知能力受損，伴隨適應(yīng)社會(huì)環(huán)境能力的嚴(yán)重缺陷，其全球發(fā)病率高達(dá)2%～3%[7]，病因多源于遺傳因素。遺傳性ID受蛋白表達(dá)、DNA堿基修飾、染色質(zhì)共價(jià)和非共價(jià)變化等多種轉(zhuǎn)錄以及表觀遺傳調(diào)控[8]。臨床報(bào)道[9]顯示，BCL11A基因座的缺失會(huì)介導(dǎo)2p15-p16.1 缺失型ID發(fā)生，并伴有持續(xù)性胎兒血紅蛋白升高。2p15-p16.1 微缺失綜合征是一種特殊類型的遺傳性ID，其臨床表現(xiàn)為中至重度ID、自閉癥、小頭畸形以及包括皮質(zhì)在內(nèi)的大腦結(jié)構(gòu)異常等特征[10]。然而，BCL11A在神經(jīng)發(fā)育中的調(diào)控方式及參與2p15-p16.1 微缺失綜合征的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步闡釋。

前期研究[11]證實(shí)，BCL11A主要在小鼠胚胎13.5 d的大腦皮質(zhì)表達(dá)，并通過(guò)設(shè)計(jì)siRNA瞬時(shí)敲降BCL11A，致使細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活化水平整體下降，初步證明BCL11A在胚胎皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程中具有轉(zhuǎn)錄激活作用。為了進(jìn)一步探索BCL11A如何參與神經(jīng)組織的表觀遺傳調(diào)控，本課題組在此基礎(chǔ)上，首先通過(guò)慢病毒載體構(gòu)建能長(zhǎng)期、穩(wěn)定敲降BCL11A的細(xì)胞株，并利用實(shí)時(shí)熒光定 量PCR（reverse-transcription quantitative PCR，RT-qPCR）和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，探索BCL11A對(duì)皮質(zhì)發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)影響，繼而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析BCL11A敲降后差異基因的富集情況，最終通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）驗(yàn)證差異基因啟動(dòng)子的染色質(zhì)活性變化，從而初步揭示BCL11A在神經(jīng)細(xì)胞中對(duì)ID風(fēng)險(xiǎn)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

293T細(xì)胞系（人腎上皮細(xì)胞系）來(lái)源于人胚腎細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞系（人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系）來(lái)源于人神經(jīng)母細(xì)胞，均為本實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞。

1.2 試劑與儀器

1）主要試劑：蛋白質(zhì)印跡技術(shù)整套試劑（上海碧云天）、蛋白酶抑制劑（北京擎科）、RIPA裂解液（上海碧云天）、anti-Ctip1 抗體（上海Abcam）、anti-β-actin抗體（上海Abcam）、anti-GAPDH抗體（上海Abcam）、anti-BCL11A 抗體（上海Abcam）、pPolⅡ（上海Abcam）、H3K9ac（上海Abcam）；opti-MEM 培養(yǎng)基和達(dá)爾貝科極限必需培養(yǎng)液（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）/F12（美國(guó)Gibco）、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco）、0.25%胰酶及胎牛血清（美國(guó)Gibco）；抗生素-抗真菌（美國(guó)Thermo）、聚凝胺（北京Solarbio）、TRIzol（美國(guó)Thermo）、逆轉(zhuǎn)錄RT-qPCR試劑盒（北京Trans Gen Biotech）。2）主要儀器：Olympus SZX2-ILLT熒光顯微鏡（日本Olympus）、PCR核酸擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad）、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo）、倒置熒光顯微鏡（日本Nikon）、臺(tái)式低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo）、RT-qPCR儀及CFX96TMReal-time system（美國(guó)Bio-Rad）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 細(xì)胞復(fù)蘇后，在37 ℃、5% CO2條件下，使用完全培養(yǎng)基（10% Gibico胎牛血清+1%抗真菌抗生素）培養(yǎng)HEK293T、SH-SY5Y細(xì)胞，每1～2 d采用1×PBS輕柔清洗后，更換1 次培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3.2 shRNA慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及病毒收集 在NCBI網(wǎng)站上下載人源BCL11A基因的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)5組慢病毒序列（表1）。PCR擴(kuò)增目的片段后，引物退火連接目標(biāo)片段，待感受態(tài)細(xì)胞為冰水混合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，然后在37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。第2天挑選克隆于37 ℃培養(yǎng)箱中，220 r/min搖晃過(guò)夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒測(cè)序鑒定。

表1 慢病毒引物序列

1.3.3 慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定敲降BCL11A的SHSY5Y細(xì)胞穩(wěn)定株的構(gòu)建 本研究部分設(shè)計(jì)并根據(jù)測(cè)序結(jié)果，篩選出測(cè)序結(jié)果正確的針對(duì)BCL11A的shRNA質(zhì)粒： sh1a、sh2c、sh3d、sh4b。利用載體質(zhì)粒pLKO.1-shRNA1a/2c/3d/4b以及HIV慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G（質(zhì)量比例為10∶7.5∶3.5 ）進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。以eGFP為對(duì)照，收集48、72、96 h的含有shRNA病毒上清，選擇72 h病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)密度為80%時(shí)進(jìn)行感染，病毒感染48 h后，每隔48 h向完全培養(yǎng)基里加入嘌呤霉素10 g/L Polybrene篩選，1 周后篩選出目的細(xì)胞株。

1.3.4 RT-qPCR 通過(guò)TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，然后使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的濃度和純度，按說(shuō)明書取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，參照試劑盒TransScript All-in-One First-Stand cDNA Synthesis SuperMix for RT-qPCR說(shuō)明書步驟操作，得到cDNA，以cDNA為模版進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)目的基因表達(dá)情況。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)驗(yàn)證BCL11A蛋白表達(dá)水平收集細(xì)胞，用PBS緩沖液清洗2～3 次，用RIPA裂解液冰上裂解60 min后，將裂解液經(jīng)12000 r/min，離心半徑9.6 cm，4 ℃，離心30 min。經(jīng)濃度12%SDS-PAGE分離膠、5% SDS-PAGE濃縮膠、電泳電壓60～120 V垂直電泳、300 mA恒流120 min轉(zhuǎn)膜。PVDF膜用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h后，分別與BCL11A一抗（1∶1000）和GAPDH一抗（1∶1000）在4 ℃搖床孵育過(guò)夜。含聚山梨酯-20 的Tris鹽酸緩沖液（Tris buffered saline with tween?20，TBST）清洗3 次后，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，洗滌3 次后，將化學(xué)發(fā)光試劑（electrochemiluminescence，ECL）A 液和B 液1∶1比例混合，覆蓋到膜上，置于 Bio-Rad 成像系統(tǒng)進(jìn)行拍攝，使用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 ChIP實(shí)驗(yàn)分析神經(jīng)元特異性因子的啟動(dòng)子活性SH-SY5Y-sh細(xì)胞用終濃度1%甲醛固定，加入甘氨酸終止反應(yīng)，PBS清洗后，離心收集固定好的細(xì)胞，Lysis buffer重懸細(xì)胞放冰上10 min，離心后用PBS漂洗。NCP bufferⅠ重懸，冰上放置10 min，ChIP Lysis buffer重懸，冰上放30 min 裂解細(xì)胞核膜，超聲儀使染色質(zhì)碎裂，用等超聲體積的酚氯仿提取超聲樣品，取上清液，超聲樣品分為3 組，即抗體IP組、IgG組和input組。每個(gè)樣品加入IgG，再加入磁珠Invitrogen dynabeads protein A磁珠，4 ℃搖床慢速搖2.5 h，去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，磁架上靜置1 min。將管中清亮液體吸取到新EP管，加入dynabeads protein A，4 ℃搖床過(guò)夜。依次使用Wash bufferⅠ、Ⅱ、Ⅲ分別4 ℃搖床慢速清洗磁珠，棄去液體，向珠子中加入新鮮制備的提取緩沖液，置于磁架上提取染色質(zhì)復(fù)合物。樣本提取液和input樣品中，加入RNase、NaCl、蛋白酶K，混勻，65 ℃水浴裂解過(guò)夜，第2天抽提DNA后，RT-qPCR定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用ImageJ及Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料采用（）描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，3 組及以上表達(dá)水平差異采用ANOVA分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α除特別說(shuō)明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建穩(wěn)定敲降BCL11A 的SH-SY5Y 細(xì)胞株

成功構(gòu)建4 株穩(wěn)定敲降BCL11A的SH-SY5Y-sh細(xì)胞株，不同慢病毒細(xì)胞株的細(xì)胞生長(zhǎng)速率存在明顯差異，SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-4b的生長(zhǎng)密度較SH-SY5Y-2c、SH-SY5Y3d低（圖1）。

圖1 嘌呤霉素篩選后感染成功的SH-SY5Y細(xì)胞

2.2 SH-SY5Y-sh 細(xì)胞株中BCL11A 的mRNA 表達(dá)水平

SH -SY5Y- sh細(xì)胞株的RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)表明，SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh2c、SH-SY5Y-sh3d細(xì)胞株中BCL11A的mRNA干擾效果明顯，其中，SH-SY5Y-sh1a細(xì)胞株BCL11A的mRNA水平下調(diào)為對(duì)照組的73.5%（P＜0.01），SH-SY5Y-sh2c的mRNA水平下調(diào)為43.0 %（P＜0.001），SH-SY5Y-sh3d細(xì)胞株BCL11A的mRNA水平下調(diào)為39.0%（P＜0.001）（圖2）。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)SH-SY5Y-sh細(xì)胞中BCL11A的干擾效率（，n=3）

2.3 SH-SY5Y-sh 細(xì)胞株中BCL11A 蛋白表達(dá)水平改變

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)BCL11A蛋白的表達(dá)情況，可見(jiàn)在構(gòu)建成功的4 組慢病毒細(xì)胞株中，SH-SY5Y-Sh1a、SH-SY5Y-Sh2c、SH-SY5Y-Sh4b細(xì) 胞中BCL11A蛋白表達(dá)量下降＞80.0%（P＜0.001），而SH-SY5Y-Sh3d細(xì)胞BCL11A蛋白表達(dá)量下調(diào)約20.0%（P＜0.01）；將慢病毒細(xì)胞株的蛋白表達(dá)量灰度值統(tǒng)計(jì)分析顯示，SH-SY5Y-Sh1a、SH-SY5Y-Sh2c 細(xì)胞的BCL11A蛋白表達(dá)量最低（圖3）。

圖3 SH-SY5Y-sh細(xì)胞中BCL11A蛋白表達(dá)水平（，n=3）

2.4 BCL11A 敲降后調(diào)控皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育關(guān)鍵基因TCF12、MEF2D 的表達(dá)

TCF12 參與調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、免疫應(yīng)答、肌發(fā)育、調(diào)控轉(zhuǎn)錄等重要生物學(xué)過(guò)程[12]；MEF2 是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MADS-box家族成員之一，在脊椎動(dòng)物中參與轉(zhuǎn)錄、調(diào)控RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、肌發(fā)育等過(guò)程[13]。

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示，BCL11A敲降后，SH-SY5Y-sh1a細(xì)胞株中皮質(zhì)發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF12的mRNA表達(dá)上調(diào)至1.25倍（P＜0.001）、MEF2D的mRNA表達(dá)量上調(diào)至3倍（P＜0.001）。SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞株中皮質(zhì)發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF12的mRNA表達(dá)上調(diào)至1300倍（P＜0.001），MEF2D的mRNA 表達(dá)量上調(diào)至3.8倍（P＜0.001）。由此提示，BCL11A對(duì)于皮質(zhì)神經(jīng)元關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用，BCL11A對(duì)TCF12、MEF2D的抑制作用呈線性負(fù)相關(guān)（圖4）。

圖4 SH-SY5Y-sh細(xì)胞中皮質(zhì)發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF12、MEF2D的mRNA表達(dá)水平（，n=3）

2.5 BCL11A 敲降后關(guān)鍵基因BCL11B、CTCF、ADCYAP1R1、NeuroD 1/2、PAX6、SATB 1/2 的表達(dá)水平

選取BCL11A蛋白水平敲降效果明顯的SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞株進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，觀察皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化。轉(zhuǎn)錄因子BCL11B為參與神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)發(fā)育的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子[14]；CTCF廣泛存在于真核生物中，可阻斷增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的相互作用[15]；ADCYAP1R1 在焦慮、恐懼認(rèn)知和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16]；NeuroD1/2 參與調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及細(xì)胞形態(tài)分化中起重要作用[17]；在胚胎發(fā)育過(guò)程中，PAX6 對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)起重要作用[18]；SATB1/2 參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的分化和成熟[19]。

RT-qPCR 結(jié)果顯示，構(gòu)建的SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞株中，BCL11A的mRNA水平降至44.0%～70.0%（P＜0.001），此時(shí)細(xì)胞株內(nèi)皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育關(guān)鍵基因BCL11B、CTCF、NeuroD1、NeuroD2、SATB1、ADCYAP1R1、PAX6、SATB2 的mRNA表 達(dá)降低。以上結(jié)果提示，BCL11A可正向調(diào)控以上皮質(zhì)神經(jīng)元關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，且對(duì)胚胎發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ADCYAP1R1、PAX6、SATB2 的降低程度更明顯（圖5）。

圖5 SH-SY5Y-sh細(xì)胞中皮質(zhì)發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BCL11A、BCL11B、CTCF、ADCYAP1R1、NeuroD1/2、PAX6、SATB1/2的mRNA表達(dá)水平（，n=3）

2.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析BCL11A 在神經(jīng)細(xì)胞中參與調(diào)控的靶基因及相關(guān)啟動(dòng)子染色質(zhì)水平變化

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣顯示，SH-SY5Y-sh細(xì)胞株組差異表達(dá)的246個(gè)基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析顯示，193個(gè)基因富集到人類疾病相關(guān)因素的GO條目（P＜0.05），有約200個(gè)基因富集到生物系統(tǒng)及環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、代謝、遺傳信息處理等方面皆有參與（圖6A～B）。通過(guò)京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對(duì)BCL11A敲降后差異基因參與的基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，BCL11A代謝通路分為多個(gè)分支，其中在組織系統(tǒng)異常富集數(shù)量排名第3 的為神經(jīng)系統(tǒng)異常（圖6C）。在生物學(xué)功能中，BCL11A與免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)高度相關(guān)，KEGG疾病富集柱狀圖分析結(jié)果顯示，BCL11A在神經(jīng)系統(tǒng)疾病有高度富集（圖6D）。

圖6 BCL11A參與的重要生物學(xué)過(guò)程

RNA測(cè)序結(jié)果顯示，SH-SY5Y-sh細(xì)胞株組差異表達(dá)基因共824 個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中有649 個(gè)基因上調(diào)，175 個(gè)基因下調(diào)；與神經(jīng)發(fā)育異常相關(guān)的差異表達(dá)基因有兩個(gè)，分別是下調(diào)基因GRM7 與上調(diào)基因GRIN1，都是ID風(fēng)險(xiǎn)基因（圖7）。GRM7 是一種抑制性異源三聚體G蛋白偶聯(lián)受體，它通過(guò)河馬信號(hào)通路影響腦發(fā)育，可調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末端的神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸可塑性，為神經(jīng)發(fā)育障礙風(fēng)險(xiǎn)基因[20]。GRIN1 基因突變可影響NMDA受體的生理功能，引起神經(jīng)元功能異常，最終導(dǎo)致大腦到腸道的各種神經(jīng)、精神癥狀[21]。

圖7 SH-SY5Y細(xì)胞差異基因表達(dá)水平的分布情況

2.7 BCL11A 敲降后神經(jīng)元中GRM7 啟動(dòng)子染色質(zhì)富集情況

為探索神經(jīng)細(xì)胞中BCL11A的上游差異表達(dá)基因GRM7的啟動(dòng)子染色質(zhì)活性，課題組針對(duì)GRM7的啟動(dòng)子進(jìn)行了ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在SH-SY5Y-sh細(xì)胞中，ID基因GRM7 啟動(dòng)子位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)志pPolⅡ（抗Phospho-Rpb1 CTD）以及染色質(zhì)活性修飾H3K9ac（抗H3K9ac）的富集都明顯降低；其中，mRNA水平和蛋白表達(dá)水平下調(diào)效果明顯的SH-SY5Y-sh1a、SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞中pPolⅡ的富集度下調(diào)95%以上（P＜0.001），較IgG下調(diào)92%以上（P＜0.001）。GRM7啟動(dòng)子染色質(zhì)活性修飾H3K9ac的富集度降低50%以上（P＜0.001），SH-SY5Y-sh1a細(xì)胞中H3K9ac的富集較對(duì)照組降低約25%（P＜0.01），SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞中H3K9ac的富集較對(duì)照組降低約90%（P＜0.001）。以上結(jié)果表明，GRM7的啟動(dòng)子染色質(zhì)活性及染色質(zhì)修飾活性在BCL11A敲降后明顯降低，且在SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞中富集度降低明顯，提示神經(jīng)發(fā)育異常相關(guān)基因GRM7 可能受到BCL11A的正向調(diào)控（圖8）。

圖8 SH-SY5Y-sh1a/2c/3d/4b細(xì)胞中GRM7 啟動(dòng)子染色質(zhì)富集情況（，n=3）

2.8 BCL11A 敲降后神經(jīng)元中GRIN1 啟動(dòng)子染色質(zhì)富集情況

RNA測(cè)序結(jié)果顯示，ID風(fēng)險(xiǎn)基因GRIN1 表達(dá)上調(diào)。課題組針對(duì)GRIN1 的啟動(dòng)子進(jìn)行了ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，以探索神經(jīng)細(xì)胞BCL11A敲降后GRIN1 的啟動(dòng)子染色質(zhì)活性。SH-SY5Y-sh2c、SH-SY5Y-sh3d細(xì)胞中GRIN1 啟動(dòng)子處pPolⅡ的富集度上調(diào)為140 倍，SH-SY5Y-sh4b的富集度上調(diào)為243 倍。GRIN1 啟動(dòng)子處SH-SY5Y-sh1a細(xì)胞的pPolⅡ富集度為對(duì)照組的4.5倍，SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞的pPolⅡ富集度為對(duì)照組的749倍，SH-SY5Y-sh3d細(xì)胞的pPolⅡ富集度為IgG的7.7 倍，SH-SY5Y-sh4b細(xì)胞的pPolⅡ富集度為IgG的2800 倍。

SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞中GRIN1 啟動(dòng)子染色質(zhì)活性修飾H3K9ac的富集度上調(diào)為4倍，SH-SY5Y-sh3d的富集度上調(diào)為1.3倍。GRIN1啟動(dòng)子處SH-SY5Y-sh1a細(xì)胞的H3K9ac富集度為對(duì)照組的11 倍，SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞的H3K9ac富集度為對(duì)照組的21倍，SH-SY5Y-sh3d細(xì)胞的H3K9ac集度為對(duì)照組的7.8倍，SH-SY5Y-sh4b細(xì)胞的H3K9ac富集度為對(duì)照組的1.4 倍（圖9）。

圖9 SH-SY5Y-sh1a/2c/3d/4b細(xì)胞中GRIN1 啟動(dòng)子染色質(zhì)富集情況（，n=3）

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄活性標(biāo)志pPolⅡ以及染色質(zhì)活性修飾H3K9ac在GRIN1啟動(dòng)子的富集呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且在SH-SY5Y-sh2c細(xì)胞中的富集差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示ID風(fēng)險(xiǎn)基因GRIN1可能受到BCL11A的負(fù)向調(diào)控。

3 討論

BCL11A在腦組織中高表達(dá)，它參與調(diào)節(jié)大腦中的軸突分支[22]，其基因座缺失可致2p15-p16.1 微缺失綜合征發(fā)生。前期研究[11]通過(guò)設(shè)計(jì)siRNA瞬時(shí)敲降BCL11A，初步證明BCL11A在神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程中具有轉(zhuǎn)錄激活作用。在此基礎(chǔ)上，課題組構(gòu)建了可穩(wěn)定敲降BCL11A的SH-SY5Y-sh細(xì)胞株作為工具來(lái)進(jìn)一步探索BCL11A對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，BCL11A正向調(diào)控部分胚胎發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其中BCL11A對(duì)焦慮癥狀、恐懼應(yīng)激因子ADCYAP1R1、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙因子PAX6 的降低程度更明顯。同時(shí)，在神經(jīng)系統(tǒng)中，BCL11A負(fù)向調(diào)控神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵因子TCF12、MEF2D，且抑制作用呈線性負(fù)相關(guān)，由此提示，BCL11A除在胚胎皮質(zhì)發(fā)育時(shí)期發(fā)揮重要作用外，還與ID及相關(guān)自閉癥譜系障礙疾病的發(fā)生有著緊密聯(lián)系。

GRM7 調(diào)節(jié)整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)傳遞和突觸可塑性，其與抑制性G蛋白偶聯(lián)主要定位在突觸前活性區(qū)[22-23]。在發(fā)育退化的雷諾氏綜合征人類模型[24]中顯示，患者運(yùn)動(dòng)皮層的mGlu7 蛋白表達(dá)水平降低。GRM7 在神經(jīng)元發(fā)育早期突變可導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)嚴(yán)重受損，進(jìn)而引起成熟神經(jīng)元突觸前末端數(shù)量缺陷[25]。在早期發(fā)育期間，使用mGlu7 激動(dòng)劑可恢復(fù)誘導(dǎo)的軸突生長(zhǎng)和突觸前末端發(fā)育缺陷[26]，表明GRM7 在神經(jīng)發(fā)育障礙發(fā)病機(jī)制中的穩(wěn)定表達(dá)具有關(guān)鍵作用。GRIN1相關(guān)神經(jīng)發(fā)育障礙（GRIN1-NDD）的所有受影響個(gè)體表現(xiàn)為輕度至重度發(fā)育遲緩及ID，其皮質(zhì)發(fā)育畸形個(gè)體的雜合致病變異位于結(jié)構(gòu)域S2 和M3 中，且可能存在基因型-表型相關(guān)性[27]。NMDAR是人類大腦學(xué)習(xí)與記憶的分子開(kāi)關(guān)，在人類大腦皮質(zhì)中廣泛分布，參與大腦發(fā)育及神經(jīng)元活動(dòng)[28]。GRIN1 編碼GluN1 亞基，交替剪接產(chǎn)生8 種亞型，GRIN1 通過(guò)影響NMDAR通道，在大腦發(fā)育、學(xué)習(xí)、記憶和其他高級(jí)認(rèn)知功能中起著重要作用。

本研究構(gòu)建的SH-SY5Y-sh細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，BCL11A的缺失與人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病高度相關(guān)，BCL11A缺失顯示下游有兩個(gè)神經(jīng)發(fā)育遲滯風(fēng)險(xiǎn)差異基因GRM7 與GRIN1，且GRM7 可能受到BCL11A的正向調(diào)控，GRIN1 可能受到BCL11A的負(fù)向調(diào)控，通過(guò)ChIP驗(yàn)證其增強(qiáng)子活性同樣受BCL11A的表達(dá)影響。由此可以推論，BCL11A和其他神經(jīng)元關(guān)鍵因子共同作用于皮質(zhì)發(fā)育的重要環(huán)節(jié)，并與ID密切聯(lián)系，但相關(guān)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，BCL11A在神經(jīng)元中功能重要且復(fù)雜，它參與多種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵因子的表達(dá)調(diào)控。BCL11A對(duì)胚胎神經(jīng)元發(fā)育的功能及作為轉(zhuǎn)錄因子參與皮質(zhì)發(fā)育的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，完善靶向轉(zhuǎn)錄因子BCL11A在皮質(zhì)發(fā)育中的組織特異性，對(duì)研究和診治2p15-p16.1 微缺失綜合征至關(guān)重要。