謝文娟，趙雅妮，龍雪麟，李淑蓉，蘇炳銀△，譚泓琳△

1.成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610500）；2.成都醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（成都 610500）；3.成都醫(yī)學(xué)院 病理與病理生理學(xué)教研室（成都 610500）

多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis， MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性脫髓鞘疾病，常累及腦、脊髓和視神經(jīng)，其主要病理特征包括脫髓鞘、軸突損傷及神經(jīng)炎癥[1]。MS發(fā)病年齡在20～40 歲，是青壯年致殘的主要疾病之一[2]。目前，MS的病因和發(fā)病機(jī)理尚未明確，由于MS患者的腦組織標(biāo)本不易獲取，限制了對(duì)該疾病的基礎(chǔ)和臨床研究，因此構(gòu)建合適的動(dòng)物模型十分必要。

目前常用的MS模型包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓 炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、銅螯合劑-新銅試劑等毒素誘導(dǎo)的脫髓鞘模型和小鼠腦脊髓炎病毒模型，其中EAE模型與人類疾病十分相似，因此在科研中應(yīng)用廣泛，其原理是給動(dòng)物體內(nèi)注射某些抗原物質(zhì)，引起機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別異常，從而導(dǎo)致髓鞘、軸突等結(jié)構(gòu)的免疫性損傷。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）雖然只占髓鞘總蛋白的0.05%左右，但由于其在少突膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)，因此具有很強(qiáng)的免疫原性[3]。MOG35-55是MOG細(xì)胞膜表面致腦炎的抗原決定簇之一，其敏感小鼠品系為C57BL/6J小鼠[4]，該品系在國(guó)內(nèi)常見(jiàn)且遺傳背景清晰。

本研究以MOG35-55作為抗原兩次免疫C57BL/6J小鼠，同時(shí)注射百日咳毒素（pertussis toxin， PTX）制備EAE模型，通過(guò)臨床癥狀評(píng)分和組織病理學(xué)檢測(cè)分析模型是否構(gòu)建成功，以期為進(jìn)一步研究MS的發(fā)病機(jī)制、病理過(guò)程及藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8 周齡C57BL/6J雌性小鼠，體重18～20 g，20 只，購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，按隨機(jī)數(shù)字表法分為EAE組和對(duì)照組，每組10只。所有小鼠按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，環(huán)境要求如下：室內(nèi)溫度18 ℃～29 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，氣流速度≤0.18 m/s，新鮮空氣換氣次數(shù)10次/h，潔凈度10000級(jí)，氨濃度15 mg/m32，光照度150～300 Lux，噪聲≤60 dB。實(shí)驗(yàn)小鼠正常進(jìn)食、飲水，定期更換墊料、飲水等。

1.2 試劑與儀器

MOG35-55多肽由上海生物工程有限公司合成（貨號(hào)：T510219），經(jīng)質(zhì)譜分析純度＞ 97%；卡介苗滅活凍干粉購(gòu)自上海晶諾生物科技有限公司（貨號(hào)：GOMY0147）；不完全弗氏佐劑（incomplete Freund's adjuvant， IFA）購(gòu)自上海sigma-Aldrich公司（貨號(hào)：F5506）；PTX購(gòu)自上海sigma-Aldrich公司（貨號(hào)：P7208）；髓鞘堿性蛋白抗體（anti-myelin basic protein， Anti-MBP）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司（貨號(hào)：NE1019）；小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物抗體（Anti-Iba1）購(gòu)于上海Abcam公司（貨號(hào)：ab178847）；Anti-Mouse IgG（貨號(hào)：31160）、Anti-Rabbit IgG（貨號(hào)：31210）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自安徽biosharp生物科技有限公司（貨號(hào)：BS114）；曲拉通X-100（Triton X-100）購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司（貨號(hào)：A600198）；Black-Gold Ⅱ染色試劑盒購(gòu)自上海sigma-Aldrich公司（貨號(hào)：AG105）。

倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司（型號(hào)：BX-63）；脫色搖床購(gòu)自太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司（型號(hào)：ZD-9556）；冰凍切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司（型號(hào)：CM1950）。

1.3 試劑配制

抗原乳劑：將100 mg卡介苗滅活凍干粉加入到10 mL IFA中，使之成為完全弗式佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）；4 mg MOG35-55多肽溶于1.33 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），即配制濃度為3 g/L的多肽液；MOG35-55多肽液（3 g/L）與CFA按1∶1比例混合，用注射器反復(fù)推拉乳化，制成“油包水”的抗原乳劑。PTX溶液：50 μg PTX溶于1 mL PBS，配制成50 mg/L的PTX儲(chǔ)備液，使用濃度為1 mg/L。

1.4 EAE 的構(gòu)建

EAE組小鼠在雙側(cè)腹股溝及后肢分4 點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注射50 μL乳劑。于首次免疫后0、48 h腹腔注射PTX （1 mg/L）200 μL，6 d后在相同部位注射相同劑量抗原乳劑加強(qiáng)免疫。對(duì)照組小鼠在雙側(cè)腹股溝及后肢分4 點(diǎn)皮下注射不含MOG35-55多肽的CFA，其余實(shí)驗(yàn)方法均與EAE組相同。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分

建模后，根據(jù)Kelero等[5]提出的神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，課題組成員每天觀察兩組小鼠行為學(xué)變化，并對(duì)小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分（表1）。

表1 小鼠神經(jīng)功能評(píng)分（分）

1.6 組織取材與檢測(cè)

1）取材：在EAE組小鼠癥狀較嚴(yán)重時(shí)（免疫后第19 天），腹腔注射4%水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，使用消毒滅菌后的手術(shù)器械，快速打開(kāi)小鼠胸腔，充分暴露心臟，經(jīng)左心室灌注1×PBS充分洗凈組織中的血液，觀察肝臟顏色變白后改用4%多聚甲醛灌注，充分固定后立即取出小鼠的大腦和脊髓組織，放入4%多聚甲醛液中進(jìn)行后固定，固定好的組織進(jìn)行梯度脫水，OCT包埋并冰凍切片（20 μm）。2）免疫組織化學(xué)染色：切片置于PBS復(fù)水，隨后滴加封閉液（5% BSA + 1.5% Triton X-100+1×PBS）于37 ℃孵育60 min；滴加Anti-MBP、Anti-Iba1 抗體（1∶500）， 4 ℃孵育過(guò)夜；PBS清洗3 次后，滴加DyLight 488 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶200），室溫孵育1.5 h；PBS清洗3 次后，使用含DAPI的抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下觀察及拍照。3）Black Gold染色：切片復(fù)水后放入60 ℃Black Gold Ⅱ染色液染色到合適深淺的顏色，染色時(shí)間15～20 min，采用95%、75%酒精進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

EAE組小鼠在首次免疫后第12天開(kāi)始發(fā)病，在第19天癥狀最為顯著，隨后病情有所緩解，發(fā)病率為100%。EAE組小鼠首先出現(xiàn)尾部張力下降，接著出現(xiàn)尾部癱瘓拖垂、步態(tài)搖擺、后肢無(wú)力、后肢癱瘓等癥狀。對(duì)照組小鼠在首次免疫后第14天左右出現(xiàn)短暫的尾巴無(wú)力癥狀（圖1）。

圖1 兩組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2 兩組小鼠脫髓鞘情況比較

Black Gold髓鞘染色結(jié)果顯示，EAE組小鼠脊髓白質(zhì)著色比對(duì)照組淺，脊髓灰質(zhì)的絲狀著色明顯減少（圖2A～B），同時(shí)EAE組小鼠大腦胼胝體區(qū)域著色相比對(duì)照組更淺（圖2C～D）。MBP的免疫熒光染色結(jié)果顯示，EAE組小鼠脊髓和大腦的MBP著色較對(duì)照組淺（圖3），提示EAE組小鼠脊髓和腦組織發(fā)生了脫髓鞘。

圖2 兩組小鼠脊髓組織Black Gold染色

圖3 兩組小鼠MBP免疫熒光染色

2.3 兩組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞增殖情況比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EAE組小鼠脊髓和大腦皮層區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時(shí)伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大、突起增多等形態(tài)學(xué)改變（圖4），提示EAE組小鼠脊髓和腦組織的小膠質(zhì)細(xì)胞處于增殖活化狀態(tài)。

圖4 兩組小鼠Iba-1 染色

3 討論

MS的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，認(rèn)可度較高的理論是由于病毒或某些抗原物質(zhì)觸發(fā)了機(jī)體自身免疫反應(yīng)，從而損害髓鞘及其包裹的神經(jīng)元軸突，基于該理論建立了不同的EAE模型，目前所制備的動(dòng)物模型還不穩(wěn)定，需要進(jìn)一步探索。

本研究采用的抗原物質(zhì)是MOG35-55多肽，與其他髓鞘蛋白相比，如MBP、髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白（myelin proteolipid protein，PLP）等，MOG因在少突膠質(zhì)細(xì)胞膜表面表達(dá)而具有很強(qiáng)的免疫原性，并且MBP的敏感小鼠品系是B10.PL和PL小鼠[6]，PLP的敏感小鼠品系是SJL和SWXJ小鼠[7-8]，這些品系在國(guó)內(nèi)不易獲得，而MOG的敏感小鼠品系C57BL/6J，是常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)小鼠品系。在構(gòu)建EAE模型時(shí)，通常會(huì)加入強(qiáng)效佐劑CFA，增強(qiáng)抗原的免疫反應(yīng)強(qiáng)度并延長(zhǎng)免疫反應(yīng)時(shí)間[9]，刺激大量吞噬細(xì)胞攝取和呈遞抗原以及CD4+T細(xì)胞的增殖活化[10]，提高模型成功率。而PTX具有破壞血腦屏障的作用，使外周反應(yīng)性T細(xì)胞得以進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌相關(guān)細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生[10-11]。目前大多數(shù)EAE模型構(gòu)建只進(jìn)行1 次免疫誘導(dǎo)，本研究采用MOG35-55和CFA的混合乳劑兩次加強(qiáng)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠，并對(duì)注射部位進(jìn)行了調(diào)整，在小鼠雙側(cè)腹股溝和下肢分4 點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，于首次免疫后0、48 h腹腔注射PTX破壞血腦屏障，然后根據(jù)小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EAE組小鼠在免疫后第12 天開(kāi)始發(fā)病，第19 天癥狀最為嚴(yán)重（神經(jīng)功能評(píng)分＜3.5 分），表明該方法構(gòu)建的EAE模型穩(wěn)定，且發(fā)病率為100%。本研究中對(duì)照組小鼠在免疫后第14 天左右出現(xiàn)短暫的尾巴無(wú)力癥狀，推測(cè)是由CFA中的結(jié)核分枝桿菌及注射的PTX引發(fā)的炎癥所造成的。脫髓鞘是MS主要的病理特征。本研究中Black Gold髓鞘染色和MBP免疫熒光染色結(jié)果表明，EAE組小鼠的脊髓和大腦胼胝體均出現(xiàn)脫髓鞘，并且大腦胼胝體的脫髓鞘要遲于脊髓，原因可能與免疫部位位于腹股溝和后肢有關(guān)。膠質(zhì)細(xì)胞活化是MS常見(jiàn)的一個(gè)病理學(xué)特征，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性損傷密切相關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，EAE組小鼠脊髓和大腦的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化，提示小膠質(zhì)細(xì)胞參與了脫髓鞘和神經(jīng)變性?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞在EAE發(fā)病過(guò)程中扮演著雙重角色：一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞活化會(huì)增強(qiáng)抗MOG的自身免疫反應(yīng)，參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重髓鞘脫失和軸突損傷；另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞能吞噬、清除崩解的髓鞘碎片，并招募少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞到達(dá)脫髓鞘部位進(jìn)行髓鞘修復(fù)，促進(jìn)髓鞘再生[13-14]。

綜上所述，本研究建立的EAE模型發(fā)病率為100%，EAE組小鼠表現(xiàn)為平衡失調(diào)及運(yùn)動(dòng)功能障礙，脊髓和腦組織均發(fā)生髓鞘脫失及小膠質(zhì)細(xì)胞活化，符合MS的臨床表現(xiàn)及病理特征，因此本研究采用MOG35-55兩次免疫C57BL/6J小鼠成功構(gòu)建了EAE模型。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于易于誘導(dǎo)，能模擬出MS的典型特征（脫髓鞘和炎癥損傷），且發(fā)病率高、病程穩(wěn)定，但該模型也存在一定的局限性。EAE模型是人工誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，以CD4+T細(xì)胞反應(yīng)為主，而MS患者發(fā)生的免疫反應(yīng)以CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)為主。此外，EAE誘導(dǎo)的脫髓鞘主要是軸突損傷后的繼發(fā)性脫髓鞘，原發(fā)性脫髓鞘較少，故該模型與人類MS存在一定差異，仍需進(jìn)行大量研究以建立更好的MS模型，為后續(xù)藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。