劉 蓉，唐 斌，劉漪淪，譚悅浩，李 燦，胡 雪，沈昊天，鄧峰美△

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（成都 610500）；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（成都 610500）；3.雅安市名山區(qū)人民醫(yī)院（雅安 625000）

肝纖維化是肝硬化和肝癌的必經(jīng)階段，由肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生形成。病毒性肝炎、酒精性或肥胖相關(guān)的脂肪性肝炎、寄生蟲病、代謝性疾病、自身免疫性肝病等均可引起慢性肝損傷，導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化[1]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）駐留在血管內(nèi)皮下間隙，在各種損傷因素下可被激活，使之活化為肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白，從而產(chǎn)生瘢痕組織[2]。在肝臟疾病中，HSCs的激活是肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵步驟。在生理情況下，HSCs處于靜息狀態(tài)；當(dāng)受到各種損傷因素刺激時，肝臟中的細(xì)胞（肝細(xì)胞、枯否細(xì)胞等）釋放大量細(xì)胞因子作用于靜止?fàn)顟B(tài)的HSCs，使其活化為肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞是以表達(dá)豐富的細(xì)胞內(nèi)蛋白為特征，包括波形蛋白、平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin，α-SMA）和α1-Ⅰ型膠原蛋白（collagen typeⅠalpha1，COL1A1）等，而ECM的主要成分又是I型膠原蛋白，實驗中常把α-SMA和COL1A1 蛋白作為體外肝纖維化的標(biāo)志物[3]。血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是肝臟中關(guān)鍵的有絲分裂原，可激活HSCs[4-5]，增加α-SMA的表達(dá)，而PDGF-BB是其中最強的絲裂原，因此在實驗中常采用PDGF-BB來激活HSCs，模擬體內(nèi)肝纖維化微環(huán)境。

細(xì)胞凋亡、壞死和自噬性死亡均會觸發(fā)細(xì)胞死亡[6]，可作為介導(dǎo)HSCs的靶點。研究[7]表明，抑制HSCs增殖、激活或誘導(dǎo)HSCs衰老和凋亡，阻斷ECM的過度沉積，可有效改善肝纖維化[8-9]。慢性肝損傷后，肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致HSCs活化、增殖并導(dǎo)致炎癥和纖維化反應(yīng)，因此抑制肝細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是肝纖維化治療的重要策略[10]。

長期肝損傷引起的肝纖維化和肝硬化是全球衛(wèi)生保健的主要負(fù)擔(dān)之一，迄今為止，肝移植仍然是失代償性肝病的主要治療方法[11]。近年來隨著肝病發(fā)病率的逐年上升，急需研發(fā)高效、毒性較小的新藥物，中藥因作用靶點多、副作用小、毒性低等特點備受關(guān)注。連翹酯苷A（forsythiaside A，F(xiàn)A）是從連翹的風(fēng)干果實中分離出來的一種苯乙醇苷類物質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能，如抗炎[12]、抗氧化[13]、抗病毒感染[14]等。近年來研究[15]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A具有保肝作用，F(xiàn)A可通過PI3K/AKT介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，改善乙酰氨基酚誘導(dǎo)的斑馬魚肝損傷；FA通過調(diào)節(jié)腸道微生物組群從而減輕四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化[16]。FA可預(yù)防過氧化氫誘導(dǎo)的線粒體依賴性PC12 細(xì)胞凋亡[17]。FA還可通過抗炎和抗凋亡作用改善膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷[18]。目前，F(xiàn)A對LX-2 細(xì)胞凋亡及改善肝纖維化的作用機制尚未完全闡明，因此本研究擬探索FA對人肝星狀細(xì)胞增殖活化及凋亡的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

采用人源肝星狀細(xì)胞（LX-2）為實驗對象，LX-2細(xì)胞株購自武漢普諾塞公司，于無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃、5%CO2）。每天觀察細(xì)胞密度及形態(tài)，待培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化時更換細(xì)胞培養(yǎng)液，后續(xù)進(jìn)行油紅O染色、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)等實驗。

1.2 主要試劑

杜氏改良高糖培養(yǎng)基（貨號：11965092）、胎牛血清（貨號：10100147）、0.25%胰蛋白酶（貨號：25200072）、青鏈霉素雙抗（貨號：15070063）購自美國Gibco公司；FA（貨 號：HY-N0028）、PDGF-BB（貨 號：HY-P7055）購自美國MCE公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（貨 號： C1002） 、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號：A0423）購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（貨號：CA1020）、油紅O染色試劑盒（貨號：G1262）購自北京索萊寶公司；兔多克隆抗體α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（貨號：19245）、α1-I型膠原蛋白（collagen type I alpha1，COL1A1）（貨號：72026）、腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（貨號：9532）、B淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（B-cell lymphoma-2，BCL-2）（貨號：4223）、BCL-2 相關(guān)X蛋白（BCL-2-associated X protein，BAX）（貨號：41162）、剪切的-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-CASPASE3）（貨號：9664）、甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（貨號：5174）和HRP偶聯(lián)的抗兔IgG抗體（貨號：7074）購自美國CST公司。

1.3 檢測LX-2 細(xì)胞活力

當(dāng)LX-2 細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，用胰蛋白酶進(jìn)行消化并收集細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以3×103個/孔的密度接種，每組接種6個復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；次日，加入不同濃度（0.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0 μmol/L）的FA處理；24 h后每孔加入10 μL的細(xì)胞計數(shù)（cell counting kit-8，CCK-8）試劑；在37 ℃的條件下孵育1 h；在酶標(biāo)儀上選擇波長為450 nm條件下測定吸光度值，并計算6 孔的平均值。

1.4 油紅O 染色

將細(xì)胞爬片放入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將LX-2 細(xì)胞以5×104個/孔的密度接種至孔內(nèi)，將細(xì)胞分為4組：二甲基亞砜（dsulfoxide，DMSO）組、PDGF-BB組、FA組、PDGF-BB+FA組，采用40 μg/L PDGF-BB和100 μmol/L FA處理細(xì)胞，作用24 h，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗5 min×3次；用10%中性甲醛室溫固定10 min；用PBS洗滌1 min×1次，然后用60%異丙醇處理15 s；在37 ℃避光環(huán)境下用已過濾的油紅O染液對細(xì)胞爬片染色；用60%異丙醇處理細(xì)胞15 s；用PBS洗滌3 min×3 次；用蘇木素染液對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染、甘油封片；在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

將4 組細(xì)胞用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上裂解，離心后取蛋白上清液，用BCA法測定蛋白濃度，加入Loading Buffer制備蛋白樣品；樣品加入SDSPAGE凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加一抗4 ℃孵育過夜，三乙醇胺緩沖鹽吐溫溶液（tris buffered saline tween，TBST）洗膜5 min×3 次；加二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次；采用凝膠成像儀進(jìn)行曝光并拍照。

1.6 免疫熒光染色

在細(xì)胞爬片上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，F(xiàn)A 處理24 h 后，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗5 min；0.1%的Tritonx-100處理15 min；PBS漂洗5 min；5%山羊血清室溫封閉1 h；4 ℃孵育一抗（α-SMA）過夜；恢復(fù)至室溫，PBS漂洗細(xì)胞；使用熒光二抗Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗；DAPI染核5 min，PBS漂洗3 min×3次；用防熒光淬滅劑封片，使用光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，型號：BX-63）觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照，全程避光操作。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測

收集4 組細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化細(xì)胞，1000 r/min，離心半徑5 cm，離心5 min，沉淀細(xì)胞，吸除上清，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀，小心吸除上清。按照說明書加入Annexin V-FITC和碘化丙錠溶液（propidium iodide，PI）；最后使用流式細(xì)胞儀檢測FA對LX-2 細(xì)胞凋亡的影響。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定性資料采用例數(shù)（%）表示，定量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用Dunnett's t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α除特別說明外均設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 FA 對LX-2 細(xì)胞增殖活化的影響

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，不同濃度的FA（0.0、12.5、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0 μmol/L）處理后，LX-2 細(xì)胞活力降低，且呈劑量依賴性。油紅O染色結(jié)果顯示，PDGF-BB組細(xì)胞中脂滴較少，而FA組和PDGF-BB+FA組細(xì)胞中脂滴較多（圖1、表1）。

表1 LX-2 細(xì)胞在不同濃度FA處理下的細(xì)胞活力分析（，n=3）

表1 LX-2 細(xì)胞在不同濃度FA處理下的細(xì)胞活力分析（，n=3）

注：與0 μmol/L比較，*P＜0.05。

濃度/（μmol/L）增殖率/%0.0100.00±0.0012.5100.00±0.4625.098.67±1.0250.096.47±0.64*75.094.57±1.40*100.087.98±1.07*150.078.79±1.76*200.066.37±1.31*F 366.800 P＜0.001

2.2 FA 對肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，PDGF-BB組α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)明顯增加，而FA組和PDGF-BB+FA組α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)明顯降低。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，PDGF-BB組α-SMA表達(dá)明顯增加，而FA組和PDGF-BB+FA組α-SMA表達(dá)明顯低于PDGF-BB組（圖2、表2）。

表2 4組細(xì)胞α-SMA、COL1A1蛋白表達(dá)情況比較（，n =3）

表2 4組細(xì)胞α-SMA、COL1A1蛋白表達(dá)情況比較（，n =3）

注：與DMSO組相比，*P＜0.05。

組別α-SMACOL1A1 DMSO組1.00±0.001.00±0.00 PDGF-BB組0.93±0.011.96±0.43*FA組0.63±0.11*1.03±0.13 PDGF-BB+FA組0.54±0.22*1.18±0.11 F 6.8667.897 P 0.0470.037

圖2 FA對肝纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響

2.3 FA 對LX-2 細(xì)胞凋亡的影響

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)A組和PDGF-BB+ FA 組cleaved-PARP、BAX 和cleaved-CASPASE3蛋白表達(dá)增高，同時BCL-2 蛋白表達(dá)降低（圖3、表3）。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，PDGF-BB組細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例減少，而FA組細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例明顯增多（圖4）。

表3 4 組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)比較（，n =3）

表3 4 組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)比較（，n =3）

注：與DMSO組相比，*P＜0.05。

組別cleaved-PARPBCL-2BAXcleaved-CASPASE3 DMSO組1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 PDGF-BB組0.73±0.371.01±0.110.63±0.17*0.83±0.05*FA組2.21±0.36*0.44±0.15*1.35±0.03*1.35±0.00*PDGF-BB+FA組2.36±0.11*0.45±0.16*1.32±0.03*1.29±0.07*F 20.17020.59029.39063.040 P 0.0070.0010.0040.001

圖3 FA對LX-2 凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖4 流式細(xì)胞儀檢測FA對LX-2 細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

肝纖維化廣泛存在于多種肝臟疾病的病理過程中，在各種損傷因素刺激的情況下，靜息狀態(tài)的HSCs活化為肌成纖維細(xì)胞，并合成大量ECM，ECM過度沉積導(dǎo)致肝纖維化[1]。HSCs是肌成纖維細(xì)胞最主要的細(xì)胞來源，HSCs的活化被稱為是纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)[3]。

PDGF最初發(fā)現(xiàn)于血小板中，是肝星狀細(xì)胞活化的關(guān)鍵分子，而PDGF-BB親和力更強[19-20]，因此本研究選擇PDGF-BB作為HSCs的激活劑，模擬體內(nèi)肝纖維化的微環(huán)境，使HSCs處于激活狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A可使細(xì)胞活力降低，抑制LX-2細(xì)胞的增殖。LX-2細(xì)胞在靜息狀態(tài)下富含多個儲存維生素A的脂滴，而在激活狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失。本研究結(jié)果顯示，PDGF-BB能使細(xì)胞中脂滴數(shù)量減少，LX-2細(xì)胞呈活化狀態(tài)；FA能使細(xì)胞中脂滴數(shù)量增加，LX-2細(xì)胞呈靜息狀態(tài)，表明FA不僅可抑制LX-2細(xì)胞的活化，還可使已經(jīng)活化的LX-2細(xì)胞恢復(fù)靜息狀態(tài)。PDGF-BB可使LX-2細(xì)胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)增多，而FA處理后LX-2細(xì)胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)均降低，表明FA可使LX-2細(xì)胞不活化為具有肌成纖維表型的細(xì)胞，從而改善PDGF-BB誘導(dǎo)的體外肝纖維化。

凋亡是細(xì)胞在特定的情況下，本身發(fā)生的主動性、程序性死亡[21-22]。研究[23]表明，正常情況下大多數(shù)肌成纖維細(xì)胞在修復(fù)完成后會主動發(fā)生凋亡，但是在慢性肝病中，活化的HSCs可通過旁分泌和自分泌細(xì)胞因子的作用來逃逸凋亡，加重肝纖維化，最終進(jìn)展為肝硬化。研究[24-25]表明，黃芪素、卡維地洛通過促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡來減輕肝纖維化?；罨腍SCs發(fā)生凋亡，可改善肝纖維化的發(fā)展，因此調(diào)控HSCs 凋亡是研究肝纖維化的關(guān)鍵靶點。為了進(jìn)一步研究FA是否能夠誘導(dǎo)LX-2凋亡的發(fā)生，本研究對細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB作為HSCs的激活劑可抑制LX-2細(xì)胞凋亡，而FA可促進(jìn)LX-2細(xì)胞凋亡。

綜上所述，F(xiàn)A可抑制LX-2 細(xì)胞的增殖活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，改善體外PDGF-BB誘導(dǎo)的肝纖維化。本研究存在一定不足，未探討FA促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡的具體作用靶點以及FA在體內(nèi)的作用，未來研究中還需要進(jìn)一步深入研究。