楊 璐,趙國宏,白莉敏*

(1中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科,西安 710032;2中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院內分泌科;*通訊作者,E-mail:Limin864517987@126.com)

糖尿病骨質疏松(diabetic osteoporosis,DOP)是一種嚴重的糖尿病并發(fā)癥,其特征是骨量減少和微結構改變[1]。晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)[2]的過度積累及其信號轉導受體晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)的高表達可阻止成骨細胞增殖,增加破骨細胞形成,減少骨形成,增加骨骼脆性[3]。目前治療DOP的療法包括增加骨形成的藥物(阿巴拉帕肽、甲狀旁腺激素等)、減少骨吸收藥物(降鈣素、雙膦酸鹽類藥物等)、促進骨骼礦化的藥物(鈣和維生素D)[4]。上述療法存在副作用,且長期療效存疑[5]。迫切需要開發(fā)新型DOP治療藥物。蒽醌類物質具有良好的抗糖尿病和骨質疏松癥功效[6],蒽醌類物質可抑制α-葡萄糖苷酶[7]和蛋白酪氨酸磷酸酶1B[8]活性以及破骨細胞形成[9]。大黃素甲醚(physcion,PHY)是一種從中藥大黃中分離得到的蒽醌類物質,具有多種生物活性,如抗癌、抗菌、抗氧化和抗炎活性[10-12]。Inalegwu等[13]研究表明大黃素甲醚可改善糖尿病大鼠模型的空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、胰島素抵抗、血脂異常、炎癥反應和氧化應激標志物,且無明顯毒性。然而,目前尚不清楚大黃素甲醚治療DOP的效果。因此,本研究觀察了大黃素甲醚對高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射誘導建立的DOP模型大鼠的FPG、空腹胰島素(fasting insulin,FINS)、血清脂代謝指標、血清氧化應激指標、脛骨組織學病變、脛骨力學參數(shù)、成骨/破骨調控基因轉錄、RAGE/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號通路的影響,旨在探討大黃素甲醚治療DOP模型大鼠的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 大黃素甲醚(Physcion,PHY,批號:HY-N0108,純度:99.10%)購自美國Med Chem Express公司。鏈脲佐菌素(STZ,批號:S0130)、二甲基亞砜(DMSO,批號:D2650)購自美國Sigma-Aldrich公司。標準飼料(批號:D12450J)、高脂飼料(批號:D12492)購自美國Research Diets公司。胰島素(INS,批號:H203-1-1)、總膽固醇(TC,批號:A111-1-1)、甘油三酯(TG,批號:A110-1-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C,批號:A113-1-1)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C,批號:A112-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD,批號:A001-3-2)、過氧化氫酶(CAT,批號:A007-1-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX,批號:A005-1-2)、丙二醛(MDA,批號:A003-1-2)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。蘇木精和伊紅(HE)染色試劑盒(批號:C0105M)購自碧云天生物技術研究所。PrimerScript RT試劑盒(批號:RR047A)、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(批號:RR820A)購自日本TaKaRa公司。晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE,批號:ab216329))、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)(批號:ab170099)、p-p38 MAPK(批號:ab178867)和GAPDH(批號:ab8245)一抗及HRP標記的二抗(ab6721)購自美國Abcam公司。

1.1.2 實驗動物 100只6～7周齡無特定病原體級SD雄性大鼠(210～250 g)購自陜西君行生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證:SCXK(陜)2022-001。大鼠在(23±2)℃、濕度(55±5)%、12 h明暗循環(huán)條件下飼養(yǎng),不限制飲食。本研究內容已獲得中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準(審批號:201907210057)。

1.2 方法

1.2.1 DOP大鼠模型的建立 通過高脂飲食聯(lián)合STZ注射誘導建立DOP大鼠模型[14]。大鼠首先適應性喂養(yǎng)1周,然后取85只大鼠進行建模。使用高脂飼料喂養(yǎng)8周,然后連續(xù)2 d腹腔注射STZ(35 mg/kg),繼續(xù)用高脂飼料喂養(yǎng)1周后尾靜脈采血,檢測FPG,當FPG≥16.7 mmol/L表示糖尿病大鼠建模成功。所有大鼠繼續(xù)用標準飼料飼養(yǎng)8周,然后利用Quantum FX micro-CT機對大鼠脛骨進行掃描并測定骨密度(bone mineral density,BMD),當BMD小于正常大鼠平均BMD 2.5個標準差時表示DOP建模成功[15]。其余15只大鼠用標準飼料正常喂養(yǎng)。

1.2.2 大鼠分組及給藥處理 本研究共有72只建模成功。將建模成功的DOP大鼠隨機分為4組(n=18):模型組、PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組。正常飼養(yǎng)的大鼠作為對照組(n=15)。PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠分別給予灌胃2 ml劑量為10,20,30 mg/kg的大黃素甲醚[13]。大黃素甲醚經(jīng)DMSO溶解后用生理鹽水稀釋,終濃度為5% DMSO。對照組和模型組大鼠分別灌胃2 ml的5% DMSO。各組大鼠均治療12周。

1.2.3 FPG和空腹胰島素(FINS)檢測 末次治療24 h后,對各組大鼠尾靜脈采血,使用強生穩(wěn)步血糖儀檢測FPG。通過ELISA法檢測FINS。

1.2.4 血清脂代謝指標檢測 末次治療24 h后,對各組大鼠尾靜脈采血,4 ℃下3 000 r/min離心10 min,取血清,使用貝克曼AU680自動生化分析儀檢測血清膽固醇(serum total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。

1.2.5 血清氧化應激指標檢測 根據(jù)試劑盒說明書檢測各組大鼠血清氧化應激指標超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平。

1.2.6 HE染色檢測大鼠脛骨組織學病變 末次治療24 h后,分離各組大鼠左脛骨,4%多聚甲醛固定72 h,10%DETA脫鈣3個月,梯度乙醇脫水和二甲苯透明后,石蠟包埋制作4 μm厚的切片。按試劑盒說明進行HE染色,觀察大鼠脛骨組織形態(tài)改變。

1.2.7 大鼠脛骨微型計算機斷層掃描(micro-CT)分析 利用Quantum FX micro-CT機對各組大鼠脛骨進行掃描,掃描參數(shù):能量/強度70 kVp,114 μA,8 W,掃描時間29.7 min。利用micro-CT自帶軟件SCANCO Medical AG進行骨力學參數(shù)定量分析,參數(shù)如下:骨密度(bone mineral density,BMD)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)和骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)。

1.2.8 免疫組織化學分析 將各組大鼠脛骨石蠟切片用二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,3%的H2O2室溫孵育10 min,使用5%牛血清白蛋白封閉30 min。將切片與稀釋度均為1∶500的RAGE和p38 MAPK一抗在4 ℃下孵育過夜,然后與稀釋度為1∶500的HRP標記的二抗37 ℃孵育30 min。DAB顯色,蘇木精復染。使用奧林巴斯BX53顯微鏡拍攝照片。用Image Pro Plus6.0軟件定量計算陽性蛋白染色面積百分比。

1.2.9 qRT-PCR分析RAGE、Runx2、OCN、OPN、ALP、BMP-2、RANK、RANKL和OPG基因表達水平 使用TRIzol試劑提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒進行逆轉錄。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ在ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行PCR。擴增條件如下:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 15 s,40次循環(huán)。GAPDH作為內參基因。通過2-ΔΔCt法計算靶基因的相對表達水平。引物序列信息見表1。

1.2.10 Western blot分析RAGE、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表達水平 用RIPA裂解緩沖液從各組大鼠脛骨組織中提取蛋白質,然后用BCA試劑盒測定蛋白質濃度。將蛋白質在10% SDS-PAGE上電泳分離并電轉移到PVDF膜上,與RAGE(稀釋度為1∶1 000)、p38 MAPK(稀釋度為1∶1 000)和p-p38 MAPK(稀釋度為1∶1 000)和GAPDH(稀釋度為1∶1 000)一抗在4 ℃孵育過夜后,與HRP標記的二抗(稀釋度為1∶1 000)37 ℃孵育2 h。使用ECL試劑盒顯影。GAPDH作為內參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件分析本研究數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析及LSD檢驗分析組間差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大黃素甲醚對DOP大鼠FPG和FINS的影響

各組大鼠的FPG和FINS水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見表2)。與對照組比較,模型組大鼠的FPG和FINS水平均升高(P<0.05)。與模型組比較,PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠的FPG和FINS水平均降低,且呈PHY劑量依賴性降低趨勢(P<0.05,見表2)。

表2 各組大鼠的FPG和FINS水平

2.2 大黃素甲醚對DOP大鼠血清脂代謝指標的影響

各組大鼠的血清脂代謝指標水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見表3)。與對照組比較,模型組大鼠的血清TC、TG和LDL-C水平均升高,HDL-C水平降低(P<0.05)。與模型組比較,PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠的血清TC、TG和LDL-C水平均呈PHY劑量依賴性降低,HDL-C水平呈PHY劑量依賴性升高(P<0.05,見表3)。

表3 各組大鼠的血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平 (mmol/L)

2.3 大黃素甲醚對DOP大鼠血清氧化應激指標的影響

各組大鼠的血清氧化應激指標水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見表4)。與對照組比較,模型組大鼠的血清SOD、CAT和GSH-PX水平均降低,MDA水平升高(P<0.05)。與模型組比較,PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠的血清SOD、CAT和GSH-PX水平均呈PHY劑量依賴性升高,MDA水平呈PHY劑量依賴性降低(P<0.05,見表4)。

表4 各組大鼠的血清SOD、CAT、GSH-PX和MDA水平

2.4 大黃素甲醚對DOP大鼠脛骨組織學改變的影響

HE染色結果顯示,對照組大鼠脛骨組織形態(tài)正常;模型組脛骨出現(xiàn)明顯的骨質疏松,骨小梁數(shù)量減少,間距增寬,厚度變薄,連續(xù)性差。與模型組比較,PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠的脛骨組織形態(tài)均明顯改善,且呈PHY劑量依賴性良好改善(見圖1)。

圖1 各組大鼠脛骨HE染色(×100)

2.5 大黃素甲醚對DOP大鼠脛骨力學參數(shù)的影響

各組大鼠的脛骨力學參數(shù)水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,見表5)。與對照組比較,模型組大鼠的脛骨BMD、Tb.N和Tb.Th水平均降低(P<0.05);與模型組比較,PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠的脛骨BMD、Tb.N和Tb.Th水平均升高,且呈PHY劑量依賴性升高(P<0.05,見表5)。

表5 各組大鼠的脛骨BMD、Tb.N和Tb.Th水平

2.6 大黃素甲醚對DOP大鼠脛骨成骨和破骨相關基因轉錄的影響

各組大鼠脛骨組織中Runx2、OCN、OPN、ALP、BMP-2、RANK、RANKL和OPG的mRNA水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。與對照組比較,模型組大鼠的脛骨組織中Runx2、OCN、OPN、ALP、BMP-2和OPG的mRNA相對表達量均降低,RANK和RANKL的mRNA相對表達量均升高(P<0.05);與模型組比較,PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠的脛骨組織中Runx2、OCN、OPN、ALP、BMP-2和OPG的mRNA相對表達量均呈PHY劑量依賴性升高,RANK和RANKL的mRNA相對表達量均呈PHY劑量依賴性降低(P<0.05,見圖2)。

2.7 大黃素甲醚對DOP大鼠脛骨RAGE/MAPK信號通路的影響

免疫組化染色結果顯示,各組大鼠脛骨組織中RAGE和p38 MAPK的陽性染色面積百分比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3)。與對照組比較,模型組大鼠的脛骨組織中RAGE和p38 MAPK的陽性染色面積百分比均升高(P<0.05);與模型組比較,PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠的脛骨組織中RAGE和p38 MAPK的陽性染色面積百分比均降低,且呈PHY劑量依賴性降低(P<0.05,見圖3)。

黃色或黃褐色區(qū)域表示陽性染色區(qū)域;與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與PHY低劑量組比較,&P<0.05;與PHY中劑量組比較,△P<0.05

qRT-PCR和Western blot結果顯示,各組大鼠脛骨組織中RAGE的mRNA和蛋白表達水平及p38 MAPK的磷酸化水平差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。與對照組比較,模型組大鼠的脛骨組織中RAGE的mRNA和蛋白表達水平及p38 MAPK的磷酸化水平均升高(P<0.05);與模型組比較,PHY低劑量組、PHY中劑量組和PHY高劑量組大鼠的脛骨組織中RAGE的mRNA和蛋白表達水平及p38 MAPK的磷酸化水平均降低,且呈PHY劑量依賴性降低(P<0.05,見圖4)。

3 討論

目前,大黃蒽醌類物質已經(jīng)應用于DOP大鼠模型的治療中,可有效提高DOP大鼠的骨密度和骨礦含量[16]。大黃素甲醚(physcion,PHY)是一種大黃中分離得到的蒽醌類物質,Inalegwu等[13]報道大黃素甲醚可有效降低糖尿病大鼠的FBG,改善胰島素敏感性和血脂異常,抑制炎癥和氧化應激,且無明顯毒性。本研究考察了大黃素甲醚治療DOP的效果,結果表明,大黃素甲醚劑量依賴性地降低了DOP大鼠中FPG和FINS水平,并降低了血清TC、TG和LDL-C水平,升高了血清HDL-C水平,從而改善了DOP大鼠的糖脂代謝,減輕了糖尿病癥狀,與Inalegwu等[13]報道的結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn),大黃素甲醚劑量依賴性地改善了DOP大鼠的脛骨組織形態(tài)并升高了脛骨力學參數(shù)BMD、Tb.N和Tb.Th水平,從而緩解了DOP大鼠的骨質疏松,提示大黃素甲醚在治療DOP方面具有潛力。

氧化應激在骨代謝中具有重要地位,也是骨質疏松的主要誘因之一,氧化應激會降低成骨細胞活性和數(shù)量,從而加速骨質流失[17]。高糖刺激可升高成骨細胞中活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平、降低礦化能力和OCN的基因表達,最終誘導骨質疏松的發(fā)生[18]。此外,ROS可通過促進破骨細胞形成[19]、下調OPG的表達和上調RANKL的表達來促進骨吸收[20]。因此,提高糖尿病患者的機體抗氧化能力是防治骨質疏松的重要途徑。其他學者報道了大黃素甲醚的抗氧化功能[21]。本研究表明,大黃素甲醚劑量依賴性地升高了DOP大鼠血清抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-PX)水平,降低了氧化產(chǎn)物(MDA)水平,從而抑制了氧化應激。

Runx2、OCN、OPN、ALP、BMP-2、RANK、RANKL和OPG是重要的成骨/破骨調控基因。活化的Runx2可增加ALP活性和骨基質蛋白(OCN和OPN)的合成,從而促進成骨細胞分化,BMP-2可誘導Runx2的活化[22-24]。RANK、RANKL和OPG是調控破骨細胞分化的重要基因。RANK通過與RANKL結合促進破骨細胞分化和成熟,OPG是RANKL的誘騙受體,其通過與RANK競爭性結合阻斷RANK與RANKL的相互作用,抑制骨吸收[25]。本研究表明,大黃素甲醚劑量依賴性地上調了DOP大鼠脛骨組織中Runx2、OCN、OPN、ALP、BMP-2和OPG的轉錄,下調了RANK和RANKL的轉錄。這些結果提示大黃素甲醚可能通過促進成骨細胞分化和抑制破骨細胞分化來延緩骨質疏松的發(fā)生。

RAGE是AGEs的受體,高表達的RAGE可阻止成骨細胞增殖,增加破骨細胞形成[26]。其他學者研究表明,p38 MAPK是RAGE的下游靶基因[27],p38 MAPK是破骨細胞分化過程中必不可少的一種MAPK家族蛋白激酶,RANK與RANKL結合可激活p38 MAPK,激活的p38 MAPK通過活化其下游促進破骨細胞分化[28]。p38 MAPK也可以通過上調轉錄因子c-Fos來影響破骨細胞的分化成熟[29]。據(jù)報道,知母皂苷A-III通過抑制RAGE/MAPK信號通路來保護成骨細胞免受AGEs誘導的損傷并減輕斑馬魚DOP[3]。Selim等[30]的分子對接研究表明,大黃素甲醚可特異性抑制脂多糖誘導的肝細胞癌細胞系(HepG2)中p38 MAPK信號通路介導的炎癥。本研究表明,大黃素甲醚劑量依賴性地抑制了DOP大鼠脛骨組織中RAGE的表達和p38 MAPK的活化,因此,大黃素甲醚可能通過抑制RAGE/MAPK信號通路發(fā)揮抗DOP作用。

綜上所述,本研究表明大黃素甲醚在治療DOP大鼠中具有良好的效果,其機制可能與促進成骨細胞分化、抑制破骨細胞分化和RAGE/MAPK信號通路有關。大黃素甲醚在治療DOP方面具有一定的研究開發(fā)價值。