魏 晴,梁珊珊*

(1貴州中醫(yī)藥大學藥學院中藥炮制學教研室,貴陽 550025;2貴州中醫(yī)藥大學大果木姜子研究中心;3貴州中醫(yī)藥大學植物多糖研究中心;*通訊作者,E-mail:3113836821@qq.com)

胃潰瘍(gastric ulcer,GU)是消化系統(tǒng)常見且多發(fā)的疾病。臨床上以節(jié)律性和周期性上腹痛為特征,長期疼痛容易發(fā)展為慢性病[1,2]。研究表明,胃酸、胃蛋白酶、幽門螺桿菌、胃動力異常、遺傳、環(huán)境、飲食、飲酒和壓力等是攻擊胃黏膜的主要因素[3,4]。現(xiàn)代人在飲食、飲酒、吸煙等方面的不良習慣會對胃黏膜及其屏障造成物理性或化學性損害,進而破壞黏膜屏障,引發(fā)胃潰瘍。MicroRNAs(miRNAs/miRs)在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種生物學功能。研究表明miR-146a可通過APLL1負向調(diào)控應激性潰瘍的炎癥反應,對胃潰瘍有保護作用[5]。miR-146a過表達能夠抑制腫瘤壞死因子(TNF)受體相關因子6(TRAF6)和IL-1受體相關激酶1(IRAK1)等靶基因來調(diào)節(jié)炎癥反應。TRAF6和IRAK1在NF-κB通路中作為信號轉(zhuǎn)導器發(fā)揮作用,可以進一步激活IκB激酶以響應促炎細胞因子的表達[6,7]。

因此本研究以正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)為基礎,通過無水乙醇誘導建立GU模型,研究miR-146a-5p是否參與到無水乙醇誘導的胃潰瘍中,進一步尋找miR-146a-5p靶基因,探究miR-146a-5p和靶基因?qū)o水乙醇刺激的胃黏膜上皮細胞的保護作用,以期為胃潰瘍的預防和治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃黏膜上皮細胞GES-1購于武漢華聯(lián)科生物技術有限公司,MTT試劑購自Biosharp生物技術有限公司,青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液購自北京Solarbio科技有限公司,RMPI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,蛋白裂解液購自北京Solarbio科技有限公司,IRAK1、NF-κB p65、IL-6和GAPDH一抗及相應二抗購自武漢三鷹生物有限公司,實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購自美國伯樂公司,miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000購自美國Sigma公司,TNF-α、IL-6和IL-10 ELISA檢測試劑盒購自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。高通量RT-qPCR儀(瑞士Roche公司),Western blot系統(tǒng)(美國伯樂公司),細胞培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器公司),凝膠成像分析儀(美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組及胃潰瘍模型的建立 人胃黏膜上皮細胞GES-1常規(guī)復蘇后進行細胞培養(yǎng),置于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細胞分為空白組和模型組。空白組給予培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。胃潰瘍模型組是將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h后,每毫升培養(yǎng)液中加入70 μl無水乙醇,培養(yǎng)8 h后,無水乙醇誘導的胃潰瘍模型建立[8]。

1.2.2 MTT法檢測細胞活性 為比較正常細胞和胃潰瘍細胞活性,采用MTT法檢測空白和模型組細胞活性。取GES-1細胞,以每孔3×104的細胞接種于96孔板中,并分為空白組和模型組(GU組)。在模型組細胞建立后,將兩組細胞在37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24,48 h后,每孔再加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后吸盡培養(yǎng)液,每孔中加入150 μl DMSO,10 min后用酶標儀在490 nm測光密度(OD)值,測定細胞活性。

1.2.3 RT-qPCR檢測miR-146a-5p、IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA的表達 為比較正常細胞和胃潰瘍細胞中相關基因表達,采用RT-qPCR檢測空白組和模型組中miR-146a-5p、IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA的表達。miRNA試劑盒提取空白組和模型組細胞的總RNA,用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,通過熒光定量試劑盒進行PCR擴增。PCR引物設計見表1。反應條件為95 ℃預變性5 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進行35個循環(huán),72 ℃再延伸5 min。

表1 qPCR引物序列

1.2.4 Western blot檢測細胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表達水平 將兩組細胞接種于6孔板中,24 h后換液,采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白,然后采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。隨后各取10 μl樣品進行SDS-PAGE,再將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入兔抗GAPDH(1∶20 000,10494-1-AP)、兔抗IRAK1(1∶1 500,10478-2-AP)、兔抗NF-κB p65(1∶1 000,10745-1-AP)、兔抗IL-6(1∶1 000,21865-1-AP)一抗,4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000,SA00001-2)室溫孵育60 min,用ECL液顯影,使用化學發(fā)光試劑盒在化學發(fā)光系統(tǒng)檢測,結果采用Image-Pro Plus 6軟件進行分析,計算蛋白表達水平。

1.2.5 ELISA法檢測GES-1細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平 按照說明書,通過ELISA法檢測空白和模型組細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的GES-1細胞消化后,接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine 3000試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染,分別標記為空白組(control)、GU組、mimic NC組、miR-146a-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic)、inhibitor NC組、miR-146a-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-146a-5p inhibitor)、siRNA NC組、siRNA IRAK1組(轉(zhuǎn)染siRNA IRAK1),轉(zhuǎn)染成功后,用于后續(xù)試驗。

1.2.7 miR-146a-5p的靶基因預測 為進一步預測miR-146a-5p的靶點,采用預測軟件Targetscan(http://www.targetscan.org)預測,物種選Human,依據(jù)context score評分,評分越低其靶基因可能性越大。

1.2.8 熒光素酶報告基因驗證miR-146a-5p與IRAK1的靶向關系 依據(jù)Targetscan結果,IRAK1可能是miR-146a-5p的靶基因,為進一步確認二者關系,采用熒光素酶報告基因進行驗證。預先構建了Psi-check 2/IRAK1-3′-UTR WT(野生型)和Psi-check 2/IRAK1-3′-UTR MUT(突變型)報告質(zhì)粒。再通過Lipofectamine 3000使用miR-146a-5p mimic和miR-NC以及0.1 μg psi-check 2/IRAK1-3′-UTR WT或psi-check 2/IRAK1-3′-UTR MUT質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染至GES-1細胞。分別建立miR-146a-5p mimic+IRAK1 3′ UTR-WT組、miR-146a-5p mimic+IRAK1 3′ UTR-MUT組、miR-NC+IRAK1 3′ UTR-WT組和miR-NC+IRAK1 3′ UTR-MUT組。采用多功能酶標儀檢測兩組細胞中螢火蟲與海腎熒光比值,作為熒光素酶活性。進一步通過Western blot法比較miR-146a-5p mimic、miR-NC、miR-146a-5p inhibitor和inhibitor NC組中IRAK1蛋白的表達量,以確認miR-146a-5p和IRAK1調(diào)控關系。

1.2.9 過表達miR-146a-5p或敲減IRAK1后對胃潰瘍細胞的影響 為進一步確認miR-146a-5p是否能夠通過IRAK1調(diào)控胃潰瘍的產(chǎn)生,采用過表達miR-146a-5p和敲減其相關靶點IRAK1蛋白,觀察胃潰瘍相關蛋白和炎癥因子變化。取對數(shù)生長期的GES-1細胞消化后,接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine 3000試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染,分別標記為空白組(control)、GU組、mimic NC組、miR-146a-5p mimic組(轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic)、siRNA NC組和siRNA IRAK1組(轉(zhuǎn)染siRNA IRAK1),轉(zhuǎn)染成功后,每毫升培養(yǎng)液中加入70 μl無水乙醇,培養(yǎng)8 h,建立無水乙醇誘導的胃潰瘍模型。進一步通過Western blot檢測GES-1細胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表達水平,ELISA法檢測細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 無水乙醇刺激后對GES-1細胞的影響

MTT結果表明,在24 h和48 h時,與空白組相比,GU組細胞活性顯著降低(P<0.01,見圖1)?？瞻捉MGES-1細胞生長旺盛,呈長梭形均貼壁生長,有絲分裂細胞數(shù)較多;當用無水乙醇造模后GES-1細胞貼壁細胞數(shù)量減少,細胞變圓懸浮,部分細胞核濃縮(見圖2)。

與空白組比較,**P<0.01

空白組 模型組

RT-qPCR結果表明,與空白組相比,GU組miR-146a-5p表達顯著降低(P<0.01),IRAK1、NF-κBp65和IL-6 mRNA表達顯著升高(P<0.01,見表2)。Western blot結果表明,與空白組相比,GU組IRAK1、NF-κB p65和IL-6表達顯著升高(P<0.05或P<0.01,見圖3)。ELISA結果表明,與空白組相比,GU組TNF-α和IL-6表達顯著升高,IL-10表達顯著降低(均P<0.01,見表3)。以上結果表明無水乙醇誘導的胃潰瘍能夠顯著升高miR-146a-5p和相關蛋白以及炎癥因子的表達。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01

表2 兩組細胞中miR-146a-5p及IRAK1、NF-κB p65和IL-6 mRNA水平比較

表3 兩組細胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-10表達結果 (n=6,

2.2 miR-146a-5p與IRAK1靶向關系驗證

靶基因在線軟件Targetscan預測顯示miR-146a-5p與IRAK1存在靶向關系,結合位點見圖4A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y果顯示,與IRAK1-WT+mimic NC組相比,IRAK1-WT+miR-146a-5p mimic組GES-1細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),而IRAK1-MUT+miR-146a-5p mimic組和IRAK1-MUT+mimic NC組GES-1細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05,見圖4B),說明miR-146a-5p與IRAK1存在靶向關系。與mimic NC組相比,miR-146a-5p mimic組IRAK1表達顯著降低(P<0.01);與inhibitor NC組相比,miR-146a-5p inhibitor組IRAK1表達顯著升高(P<0.01,見圖5)。由以上結果進一步可知miR-146-5p可負向調(diào)控IRAK1蛋白的表達。

與mimic NC比較,**P<0.01

與mimic NC比較,**P<0.01;與inhibitor NC比較,##P<0.01

2.3 過表達miR-146a-5p對無水乙醇刺激的GES-1細胞的影響

與mimic NC組相比,miR-146a-5p mimic組GES-1細胞中IRAK1、NF-κB p65和IL-6蛋白表達顯著降低(P<0.05或P<0.01,見圖6)。進一步ELISA結果表明,與GU組或GU+mimic NC組相比,GU+miR-146a-5p-mimic組TNF-α和IL-6表達顯著降低,IL-10表達顯著升高(P<0.05,見表4)。以上結果表明miR-146a-5p參與到無水乙醇刺激的GES-1細胞的保護中,并能夠減少炎癥因子的釋放。

與mimic NC組比較,*P<0.05,**P<0.01

表4 過表達miR-146a-5p對細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10表達的影響

2.4 敲減IRAK1對無水乙醇刺激的GES-1細胞的影響

Western blot結果表明,與siRNA NC組相比,siRNA IRAK1組IRAK1、NF-κB p65和IL-6表達顯著降低(P<0.05或P<0.01,見圖7)。

與siRNA NC組比較,**P<0.01

ELISA結果表明,與GU組或GU+siRNA NC組相比,GU+siRNA IRAK1組TNF-α和IL-6的表達顯著降低,IL-10的表達顯著升高(均P<0.05,見表5)。

表5 敲減IRAK1對細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10表達的影響

3 討論

消化性潰瘍是一種常見的消化系統(tǒng)疾病,包括胃潰瘍和十二指腸潰瘍,其中胃潰瘍是最常見的一種,其主要臨床表現(xiàn)為餐后上腹痛,伴有噯氣、反酸、燒心等癥狀,甚至出現(xiàn)胃穿孔和胃出血[9]。隨著潰瘍的反復發(fā)作,胃黏膜的損傷加重,最終導致癌變,胃癌的預后極差,甚至危及生命。研究表明,導致胃潰瘍形成的因素很多,包括酗酒、不良生活習慣、生活壓力過大、Hp感染、長期使用藥物等[10]。因此,積極預防和治療胃潰瘍具有重要意義。

miRNA由內(nèi)源基因編碼,在多種生物學行為中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,被認為廣泛參與基因表達和RNA沉默的調(diào)控[11,12]。綜合以前的文獻和現(xiàn)代研究進展,本研究選擇了與胃潰瘍相關的miR-146a-5p進行進一步研究。尹斌[5]研究表明miR-146a可通過APLL1負向調(diào)控應激性潰瘍的炎癥反應,對胃潰瘍有保護作用。過表達miR-146a后可降低NF-kB p65的蛋白和mRNA水平,同時還能夠降低炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達[5]。本研究結果表明在無水乙醇誘導的GES-1細胞中miR-146a-5p的表達顯著降低,伴隨著各炎癥因子含量也發(fā)生改變,而過表達miR-146a-5p后,各炎癥因子含量逐步恢復,提示miR-146a-5p在胃潰瘍發(fā)生及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。

為進一步研究無水乙醇刺激的GES-1細胞中miR-146a-5p的作用機制,通過雙熒光素酶結果發(fā)現(xiàn),miR-146a-5p可與IRAK1靶向結合,且miR-146-5p可負向調(diào)控IRAK1蛋白的表達。作為一個絲氨酸-蘇氨酸激酶,IRAK1可以介導Toll樣受體(TLR)和白細胞介素-1(IL-1)信號通路,因此在先天免疫性疾病包括自身免疫性疾病、癌癥、糖尿病或神經(jīng)性疼痛中起著關鍵作用[13-16]。Li等[17]研究表明,在幽門螺旋桿菌所致胃潰瘍中,過表達miR-146a能夠抑制IRAK1和TRAF6表達水平,減輕胃黏膜損傷。Zhang等[18]研究表明,miR-146a缺陷的小鼠會出現(xiàn)嚴重的痛風性關節(jié)炎,通過TRAF6、IRAK1和NALP3引起炎癥體失調(diào)。本研究進一步表明miR-146-5p可負向調(diào)控IRAK1蛋白的表達,并參與到炎癥因子的釋放中,保護胃黏膜。

IRAK1存在于NF-κB、IL-17等通路中,而研究表明NF-κB通路能夠調(diào)節(jié)胃黏膜上皮細胞發(fā)生炎癥反應[19]。進一步對下游通路研究表明,當IRAK1表達被抑制后,NF-κB p65和IL-6蛋白的表達降低,下游炎癥因子TNF-α和IL-6的表達降低,IL-10的表達升高,提示miR-146a-5p靶向調(diào)控IRAK1后可以進一步抑制炎癥相關反應。TNF-α、IL-6和IL-10是重要的炎癥細胞因子,它們參與了炎癥和胃潰瘍的發(fā)展。TNF-α是一種由單核細胞和巨噬細胞分泌的內(nèi)源性多向性炎癥細胞因子[20,21]。TNF-α也是一種重要的炎癥介質(zhì),會導致潰瘍的形成。當炎癥反應發(fā)生時,TNF-α會引起其他炎癥因子的二次釋放,如IL-2、IL-6、IL-10等,TNF-α還可激活中性粒細胞并釋放氧自由基,產(chǎn)生急性期蛋白,阻礙胃黏膜的血液微循環(huán),加重胃黏膜損傷[22]。本研究結果顯示,與空白組相比,GU組細胞上清液中IL-6和TNF-α的含量明顯增加,而IL-10的含量則顯著下降,說明胃潰瘍造模后大量的炎癥因子TNF-α和IL-6相繼釋放,IL-10的產(chǎn)生受到抑制,促進了炎癥反應的發(fā)生。與GU組相比,GU+miR-146a-5p mimic或GU+siRNA IRAK1組,細胞上清液中IL-6和TNF-α的含量顯著下降,IL-10的含量顯著上升,表明miR-146a-5p可以通過抑制IRAK1的表達抑制炎癥因子的釋放,減少對胃腸道的損害,從而發(fā)揮對胃黏膜的保護作用。

綜上所述,在無水乙醇刺激的GES-1細胞中,miR-146a-5p高表達能夠起到保護胃黏膜的作用,其作用機制可能是通過miR-146a-5p靶向抑制IRAK1,進一步抑制炎癥因子的釋放,保護胃黏膜。本研究為miR-146a-5p靶向保護胃黏膜提供了新的思路和依據(jù)。