邢現(xiàn)菲,李瑞華,韓亞娟,張競競,邵渝歡,馬賽菲,劉亞萌,韓正全*

(1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科;3蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;*通訊作者,E-mail:dochyj@163.com)

乳腺癌是女性中最常見的癌癥,它是世界上婦女死亡的第二大常見原因[1]。近年來,雖然手術和術后化療在乳腺癌治療方面取得了顯著進展,但是,乳腺癌的5年生存率仍然不高,特別是三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的治療效果較差,嚴重威脅患者生存。糖基化是在包括乳腺癌、卵巢癌和內膜癌在內的不同類型癌癥中觀察到的一種關鍵修飾,其促進了乳腺癌細胞的黏附、增殖和轉移[2]。糖基轉移酶在癌細胞中的差異表達是腫瘤糖基化異常的主要原因之一,而ALG家族代表了一類關鍵的糖基轉移酶[3,4]。α-1,3-甘露糖基轉移酶(alpha-1,3-mannosyltransferase,ALG3)是ALG家族的一員,位于染色體3q27.1區(qū)域[5],是一種完整的ER膜蛋白,具有多個跨膜區(qū)域。研究表明,ALG3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關,如口腔鱗狀細胞癌[6]、非小細胞肺癌[7]、膀胱癌[8]等,但在乳腺癌方面的研究報道較少,因此,本研究將通過RNA干擾技術下調/過表達乳腺癌細胞中ALG3的表達量,觀察ALG3對乳腺癌增殖、侵襲和遷移等生物學行為的影響,并探究其可能的分子機制,旨在為乳腺癌患者的預后和治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

正常人乳腺細胞HBL-100和乳腺癌細胞SKBr3、MCF-7、MDA-MB-231均購自武漢普諾賽生物科技有限公司。BALB/c裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,動物實驗過程符合蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗、PBS緩沖溶液購自武漢普諾賽生物科技有限公司,胎牛血清(FBS)、Materigel膠購自浙江天杭生物科技股份有限公司,si-NC、siRNA、mimic-NC、mimic均購自上海生工生物工程股份有限公司,轉染試劑Lip 2000由Thermo Fisher Scientific(美國)公司購買,一抗(GAPDH、ALG3、JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、Bcl-2、MMP2、Cyclin D1)購于武漢三鷹生物技術有限公司,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、ECL顯影液購于Abbkine(美國)科技有限公司,JAK/STAT抑制劑WP1066、Transwell小室、BCA蛋白濃度測量試劑盒、脫脂奶粉均購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 HBL-100、MDA-MB-231、MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),SKBr3在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),在37 ℃和5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染對象為處于對數(shù)生長期的細胞,要求轉染時細胞密度達到50%～60%,在下調ALG3時,分別轉染si-NC、ALG3-S1、ALG3-S2、ALG3-S3,選擇敲減效率最明顯的序列構建ALG3-KD組;在上調ALG3時,分別轉染mimic-NC、ALG3-mimic驗證轉染效率,選擇ALG3-mimic構建ALG3-OE組。轉染步驟嚴格按照轉染試劑說明書進行,在后續(xù)實驗中將進行如下分組:control組(Lip2000)、NC-KD組(Lip2000+si-NC)、ALG3-KD組(Lip2000+ALG3-siRNA)和NC-OE組(Lip2000+mimic-NC)、ALG3-OE組(Lip2000+ALG3-mimic)以及ALG3-OE+WP1066組(使用通路抑制劑WP1066培養(yǎng)ALG3-OE組細胞)。本研究中使用的ALG3特異性序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 CCK-8和集落克隆實驗檢測增殖能力 CCK-8實驗:將轉染后處于對數(shù)生長期的control組、NC-KD組和ALG3-KD組MDA-MB-231細胞重新消化離心,計數(shù)后接種于96孔板中,調整每孔細胞懸液為100 μl,細胞密度為3 000個/孔,每組設置5個復孔,放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱內,分別于24,48,72,96 h時,每孔加入CCK-8溶液10 μl,37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育1 h后,在酶標儀上選擇460 nm波長測定吸光度。本實驗重復3次。

集落克隆實驗:將轉染后處于對數(shù)生長期的1.2.1各組MDA-MB-231細胞重新消化離心,以500個/孔種植于6孔板,每3 d換一次液,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的同時觀察克隆數(shù)目,待6孔板中大多數(shù)單個細胞克隆數(shù)大于50個時,棄上清,PBS緩沖溶液洗滌一次;加入1 ml 4%多聚甲醛至每個孔內,4 ℃冰箱固定細胞20 min,PBS洗滌細胞一次;每孔加入結晶紫1 ml,進行染色15～20 min,PBS洗滌細胞若干次,倒扣晾干,拍照計數(shù)。本實驗重復3次。

1.2.3 裸鼠移植瘤模型的構建 收集轉染后處于對數(shù)生長期的NC-KD組和ALG3-KD組MDA-MB-231細胞,用DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液,以5×106個/只的密度注射到裸鼠上肢腋下,將裸鼠分為NC-KD組(注射NC-KD組MDA-MB-231細胞)和ALG3-KD組(注射ALG3-KD組MDA-MB-231細胞),每組6只。每4 d用游標卡尺測量腫瘤大小,瘤體體積=π/6×L×W×W=3.14/6×L×W×W(L代表長徑,W代表短徑)。26 d后,將裸鼠斷椎處死,用彎頭鑷和眼科剪將皮下腫瘤鈍性分離,稱重。

1.2.4 細胞劃痕實驗檢測遷移能力 將轉染后處于對數(shù)生長期的control組、NC-KD組和ALG3-KD組MDA-MB-231細胞重新消化離心,以5×105個/孔的密度種植于6孔板,待細胞貼壁后換成無血清DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜。無菌10 μl槍頭垂直于細胞面劃痕,洗滌后使用無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0,24,48 h將6孔板置于倒置顯微鏡下拍照,每組隨機選擇3個劃痕視野拍照,并做好標記,計算遷移率。本實驗重復3次。

1.2.5 Transwell實驗檢測侵襲和遷移能力 遷移實驗:將轉染后處于對數(shù)生長期的1.2.1各組MDA-MB-231細胞重新消化離心,用無血清培養(yǎng)基重懸并計數(shù),以1.5×104/孔分別種植于Transwell小室,每組設3個復孔,加入無血清DMEM培養(yǎng)基定量至100 μl,小室置于24孔板,下室孔內加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h,取出Transwell小室,棉簽輕輕擦拭小室膜上表面多余的細胞,4%多聚甲醛固定15～20 min,結晶紫溶液浸泡染色15～20 min,PBS漂洗掉多余的染料,晾干后于倒置顯微鏡下拍照,觀察小室膜下表面細胞數(shù)量。本實驗重復3次。

侵襲實驗:4 ℃環(huán)境下將Materigel基質膠與基礎培養(yǎng)基按1∶8的比例稀釋,每孔加入60 μl的Materigel基質膠均勻覆蓋Transwell小室底部,置于培養(yǎng)箱孵育30 min?；|膠凝固后,將轉染后處于對數(shù)生長期的1.2.1各組MDA-MB-231細胞重新消化離心,用無血清培養(yǎng)基重懸并計數(shù),將各組細胞以1.5×104/孔的密度種植于小室上室,其余步驟與遷移實驗相同,培養(yǎng)48 h后多聚甲醛固定,結晶紫染色,晾干后于倒置顯微鏡下拍照,檢測細胞數(shù)量。本實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測ALG3、JAK/STAT信號通路相關蛋白表達 分別將1.2.1各組細胞裂解后提取蛋白,使用BCA法測定蛋白濃度,于SDS-PAGE上取等量蛋白樣品進行電泳,PVDF膜轉膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗(GAPDH、ALG3、JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、Bax、MMP2、Cyclin D1)按1∶1 000稀釋,4 ℃條件下孵育過夜。TBST溶液洗5次,每次5 min,二抗按1∶10 000稀釋,室溫下孵育2 h,TBST溶液洗5次,每次5 min,ECL顯影液曝光顯影,Image J分析實驗結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 ALG3在乳腺癌細胞中高表達

Western blot實驗結果表明,與正常乳腺上皮細胞HBL-100相比,乳腺癌細胞SKBr3、MCF-7、MDA-MB-231中的ALG3的表達量明顯增加,其中MDA-MB-231和MCF-7細胞的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而SKBr3細胞的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。由于MDA-MB-231細胞中ALG3表達升高最顯著,因此,選擇MDA-MB-231細胞作為后續(xù)研究對象。

圖1 ALG3在正常人乳腺上皮細胞和各種乳腺癌細胞中的表達(n=3)

2.2 ALG3敲減/過表達序列的篩選及驗證

Western blot結果顯示,與control組和NC-KD組比較,ALG3-S3組ALG3敲減效果最好,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與control組和NC-OE組比較,ALG3-mimic組ALG3表達顯著增加(P<0.01,見圖2)。故選擇ALG3-S3和ALG3-mimic用于后續(xù)敲減/過表達。

與control組和各自對應的NC組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.3 下調ALG3抑制MDA-MB-231細胞的增殖能力

集落克隆和CCK-8實驗結果表明,與control組和NC-KD組比較,ALG3-KD組細胞的增殖率降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3A)。

與control組和NC-KD組對比,*P<0.05

裸鼠成瘤實驗表明,與NC-KD組比較,ALG3-KD組裸鼠腫瘤的體積和質量明顯較慢,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3B)。

2.4 下調ALG3抑制MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力

劃痕實驗結果顯示,與control組和NC-KD組比較,ALG3-KD組劃痕愈合顯著延遲,遷移能力明顯減弱,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4A);Transwell實驗結果顯示,與control組和NC-KD組比較,ALG3-KD組24 h時乳腺癌細胞的遷移能力降低,ALG3-KD組48 h時跨膜細胞數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4B)。

A.劃痕實驗檢測遷移能力變化(×4)B.Transwell檢測侵襲和遷移能力變化(結晶紫染色,×10)

2.5 下調ALG3可以抑制MDA-MB-231細胞中JAK/STAT通路蛋白表達

Western blot結果顯示,與control組和NC-KD組比較,ALG3-KD組JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、MMP2、Cyclin D1的表達均受到抑制,相反,Bax在ALG3-KD組中的表達升高,而且磷酸化水平也有所降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖5)。

圖5 下調ALG3對MDA-MB-231細胞中JAK/STAT通路蛋白的影響(n=3)

2.6 WP1066可以抑制ALG3過表達MDA-MB-231細胞的JAK/STAT信號通路

Western blot結果顯示,加入通路抑制劑WP1066后,與NC-OE組和ALG3-OE組比較,ALG3-OE+WP1066組JAK/STAT通路相關蛋白JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3及其磷酸化水平受到抑制,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6)。

與NC-OE和ALG3-OE組對比,*P<0.05

2.7 抑制JAK/STAT通路后可降低ALG3過表達MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲和遷移

集落克隆實驗表明,與NC-OE組和ALG3-OE組比較,ALG3-OE+WP1066組細胞的增殖能力被抑制(P<0.05,見圖7A);Transwell實驗表明,與NC-OE組和ALG3-OE組比較,ALG3-OE+WP1066組24 h時乳腺癌細胞的遷移能力降低,ALG3-OE+WP1066組48 h時跨膜細胞數(shù)減少(P<0.05,見圖7B)。

A.集落克隆檢測抑制JAK/STAT通路后增殖能力變化 B.Transwell檢測抑制JAK/STAT通路后侵襲、遷移能力變化(結晶紫染色,×10)

3 討論

近年來,乳腺癌基因研究一直是熱點問題,雖然目前已經有不少分子標志物應用于其臨床診斷及治療,但仍需發(fā)現(xiàn)更多的基因治療靶點。糖基化是蛋白質普遍存在的翻譯后修飾[9,10],當正常上皮細胞轉化為癌細胞時,表面糖基化變得異常[11],已有相關的糖基化蛋白作為臨床上腫瘤標志物,如肝細胞癌的甲胎蛋白(AFP)[12]、結腸癌的癌胚抗原(CEA)[13]和前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)[14]。糖基化是由多種糖基轉移酶通過復雜的生物合成途徑產生的,ALG3屬于糖基轉移酶家族中的一員,其突變可導致糖基化蛋白糖基化不足和糖蛋白功能障礙[15,16],ALG3有助于腫瘤細胞中的高甘露糖型N-聚糖,已經描述了幾種高甘露糖型N-連接聚糖的異常表達與癌癥進展有關[17],在乳腺癌患者血清中也已經檢測到豐富的高甘露糖聚糖[18]。研究表明,下調ALG3可抑制MCF-7細胞在體外和體內的生長[19],而其在三陰性乳腺癌中的功能作用尚不明確。

首先,本研究采用Western blot檢測正常人乳腺上皮細胞和不同乳腺癌細胞中ALG3蛋白的表達水平,結果發(fā)現(xiàn),多種乳腺癌細胞中ALG3蛋白的表達水平高于正常人乳腺上皮細胞,且MDA-MB-231細胞中的表達水平最高。為進一步說明ALG3對MDA-MB-231細胞相關生物學行為的影響,通過RNA干擾技術和轉染敲減MDA-MB-231細胞中ALG3蛋白的表達,觀察下調ALG3蛋白對MDA-MB-231細胞增殖、侵襲和遷移的影響,結果表明,ALG3-KD組MDA-MB-231細胞增殖、侵襲和遷移能力相較于對照組均受到了明顯抑制。Cui等[20]的研究表明,ALG3促進卵巢癌的增殖和腹膜轉移等惡性行為,且與不良預后相關。Zhao等[21]的研究表明,ALG3在肝細胞癌中過度表達,沉默其表達可以抑制增殖、侵襲遷移能力。同理,Li等[22]的研究證實了ALG3在膀胱癌中也呈現(xiàn)高表達狀態(tài),下調ALG3的表達可以抑制膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。本研究的結果與上述文獻報道的結果一致。

據(jù)報道,ALG3可能通過CDK-周期蛋白途徑促進口腔鱗狀細胞癌的侵襲性行為[6],還可以通過FTX/miR-342軸促進急性髓系白血病的耐藥發(fā)展[4]。本研究通過Western blot檢測腫瘤增殖、侵襲和凋亡相關基因變化,發(fā)現(xiàn)ALG3可以調節(jié)Bcl-2、MMP2、Cyclin D1的表達,而這些基因蛋白都是與JAK/STAT通路相關的下游蛋白,提示ALG3促進MDA-MB-231細胞的惡性行為可能與該通路相關。酪氨酸蛋白激酶/信號傳導和轉錄激活因子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)是從膜表面?zhèn)鬟f外部信號激活靶基因轉錄的主要信號級聯(lián)途徑之一,其信號異常有助于腫瘤的增殖和轉移[23],當有配體與細胞表面受體結合時,JAKs會通過磷酸化STATs從而形成二聚體進入細胞核內與DNA結合,調節(jié)目標基因的轉錄[24]。STATs磷酸化導致穩(wěn)定的二聚體的形成,這些二聚體在細胞核中易位,并與基因啟動子區(qū)域的特定回文序列結合,啟動轉錄反應,從而調節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡[25,26]。研究表明,JAK/STAT信號通路對于乳腺癌細胞的增殖及凋亡具有重要作用,抑制該信號通路可抑制癌細胞的發(fā)生及發(fā)展[27],因此,對于開發(fā)乳腺癌的新的治療方法,JAK/STAT通路應該是一個潛在的靶點。在本研究中,為了確定ALG3介導的影響MDA-MB-231細胞增殖、轉移和凋亡的機制,通過Western blot檢測下調ALG3表達后JAK/STAT信號通路相關蛋白,表現(xiàn)為增殖、轉移相關蛋白(MMP2、Cyclin D1)表達受到抑制,凋亡相關蛋白(Bcl-2)表達水平升高,且磷酸化水平降低,提示下調ALG3可以抑制JAK/STAT信號通路下游蛋白的表達和磷酸化。此外,使用WP1066阻斷JAK/STAT通路后,ALG3-OE+WP1066組MDA-MB-231細胞增殖、侵襲和遷移水平受到不同程度的影響,表明抑制JAK/STAT通路可以降低ALG3對MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲和遷移能力。由此推測,ALG3可能通過激活JAK/STAT通路下游蛋白(JAK2/pJAK2、STAT3/pSTAT3、Bcl-2、MMP2、Cyclin D1)及其磷酸化,從而促進MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲和遷移。

綜上所述,ALG3可能通過激活JAK/STAT信號通路促進乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移,可能成為乳腺癌分子診斷及治療靶點,但具體通過何種方式影響JAK/STAT通路仍需進一步研究。然而,本研究仍有一定的局限性,僅從細胞層面進行驗證,后續(xù)還可以在生信、組織和體內實驗上進行更深層次的研究,給本研究提供更充分的理論依據(jù)。