宋唯琦 唐秀平 鄒云春 范浩博 王 英 謝 娟 胡秀珍

弱視是一種常見(jiàn)的兒童眼病,其在亞洲的發(fā)病率約為1.09%[1]。在兒童視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)存在皮層可塑性,但在關(guān)鍵期之后皮層可塑性下降,此時(shí)對(duì)弱視進(jìn)行治療十分棘手[2]。因此,如何激活皮層可塑性,提高弱視患者視覺(jué)功能是目前治療弱視新的研究方向。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(rTMS)是一項(xiàng)新的神經(jīng)調(diào)控治療技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn),高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(HF-rTMS) (>5 Hz)可引起長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng),對(duì)調(diào)節(jié)突觸可塑性具有顯著影響[3]。在初級(jí)視皮層應(yīng)用HF-rTMS可短期內(nèi)改善弱視眼的對(duì)比敏感度[4-5],而進(jìn)一步增加刺激頻率能長(zhǎng)期改善弱視眼視功能[6-7]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是哺乳動(dòng)物大腦中分布最廣、表達(dá)豐富的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;其在突觸的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和可塑性中發(fā)揮重要作用[8]。既往研究發(fā)現(xiàn),BDNF在弱視的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[9];并可通過(guò)激活下游通路抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]。本次我們就HF-rTMS對(duì)弱視大鼠視皮層BDNF表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響展開(kāi)研究,以期為弱視的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取3周齡清潔級(jí)SD大鼠30只,雌雄不限。 將大鼠置于(24±1)℃、相對(duì)濕度50%的飼養(yǎng)房?jī)?nèi)進(jìn)行飼養(yǎng),光暗交替各12 h。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組:正常對(duì)照組(NC組)、單眼剝奪組(MD組)和單眼剝奪+HF-rTMS組(MD+HF-rTMS組),每組10只大鼠。NC組大鼠不給予任何干預(yù);MD組和MD+HF-rTMS組縫合大鼠右眼眼瞼3周建立弱視模型;MD+HF-rTMS組大鼠于造模成功后給予HF-rTMS刺激2周。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。本研究已通過(guò)川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并全程接受其監(jiān)督,動(dòng)物處理遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 弱視動(dòng)物模型的建立采用100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.03 mL·kg-1)。NC組大鼠僅做麻醉處理;MD組和MD+HF-rTMS組大鼠在麻醉后采用眼瞼縫合進(jìn)行弱視造模。首先將右側(cè)眼瞼周?chē)拿l(fā)剪除,對(duì)眼瞼局部皮膚進(jìn)行碘伏消毒。將上、下眼瞼的瞼緣組織剪去0.5～1.5 mm,采用3-0絲線進(jìn)行間斷縫合?？p合完成后在縫合處涂抹左氧氟沙星眼膏。每天密切觀察縫合部位,若出現(xiàn)角膜損傷或眼瞼裂開(kāi)則剔除實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 圖形視覺(jué)誘發(fā)電位的檢測(cè)檢測(cè)圖形視覺(jué)誘發(fā)電位(PVEP)時(shí),將三根動(dòng)物電極針依次分別插入:記錄電極插入雙耳前緣連線枕部正中皮下,參考電極插入大鼠鼻骨皮下,接地電極插入大鼠尾部皮下。對(duì)記錄電極、參考電極和接地電極之間進(jìn)行電阻測(cè)量,要求阻抗小于 10 kΩ。PVEP采用棋盤(pán)翻轉(zhuǎn)模式進(jìn)行刺激,遮擋左眼,刺激距離為15 cm,刺激模式設(shè)定為每度0.04周,時(shí)間頻率為1 Hz,對(duì)比度97%,采樣時(shí)間300 ms,疊加100次;于暗室條件下進(jìn)行檢測(cè)。弱視模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[11]。

1.2.3 HF-rTMS治療方案將線圈中點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)大鼠枕骨頂點(diǎn),與大鼠頭皮相切;刺激頻率為20 Hz,刺激10 s,間歇60 s;30%最大輸出強(qiáng)度,一共5個(gè)序列;每天在相同時(shí)間進(jìn)行刺激,連續(xù)14 d[12-13]。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)BDNF蛋白表達(dá)從-80 ℃冰箱中取出視皮層組織行組織蛋白提取。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度,然后按照測(cè)定的濃度計(jì)算出各組視皮層30 μg上樣量的體積。根據(jù)目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小配置100 g·L-1的分離膠和濃縮膠,用SDS-PAGE 法進(jìn)行電泳,之后轉(zhuǎn)膜。50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h,4 ℃孵育BDNF抗體和GADPH抗體過(guò)夜,滴加二抗,最后進(jìn)行顯影。采用ImageJ圖像處理軟件對(duì)灰度值進(jìn)行測(cè)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BDNF mRNA表達(dá)從-80 ℃冰箱中取出視皮層組織放入EP管內(nèi),用 Trizol法提取總RNA,隨后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠視皮層中BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列:BDNF正向?yàn)?’-CTTGGAGAAGGAAACCGCCT-3’,反向?yàn)?’-GTCCACACAAAGCTCTCGGA-3’;GAPDH正向?yàn)?’-TGAAGGTCGGAGTGAACGG-3’,反向?yàn)?’-TGAAGGTCGGAGTGAACGG-3’。收集目的基因與內(nèi)參基因的Ct值,采用2-△△Ct計(jì)算出目的基因校正后的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 各種染色及陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)免疫組織化學(xué)染色、原位雜交染色和TUNEL染色均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。從每張視皮層切片中隨機(jī)選取4個(gè)400倍視野進(jìn)行圖像采集,最后采用Image-pro plus6.0檢測(cè)每高倍視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,三組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PVEP檢測(cè)結(jié)果建模后,MD組和MD+HF-rTMS組大鼠相比, P100波振幅差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.69);MD組和MD+HF-rTMS組大鼠與NC組相比,P100波振幅下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)。HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS組和MD組大鼠相比, P100波振幅提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);MD+HF-rTMS組大鼠 P100波振幅仍低于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1和表1)。

表1 各組大鼠建模后和HF-rTMS刺激2周后 P100波振幅

圖1 各組大鼠HF-rTMS刺激2周后PVEP檢測(cè)結(jié)果 A:MD組;B:MD+HF-rTMS組;C:NC組。

2.2 HF-rTMS刺激2周后各組大鼠視皮層BDNF蛋白及mRNA表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS組大鼠視皮層BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.74±0.03,高于MD組(0.61±0.02),但仍低于NC組(1.00±0.02),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(圖2)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示: HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS組大鼠視皮層BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.62±0.02,高于MD組(0.44±0.01),但仍低于NC組(1.00±0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

圖2 HF-rTMS刺激2周后各組大鼠視皮層BDNF蛋白表達(dá)情況

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果HF-rTMS刺激2周后,各組大鼠視皮層中均有BDNF蛋白染色陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),BDNF蛋白表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)中,陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色或淡黃色。HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS組BDNF蛋白染色陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(0.73±0.09,57.6±9.2)均高于MD組(0.43±0.09,28.9±6.0),低于NC組(1.06±0.08,86.7±7.8),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)(圖3)。

圖3 HF-rTMS刺激2周后各組大鼠視皮層免疫組織化學(xué)、原位雜交和TUNEL染色結(jié)果(×400) 紅色箭頭示BDNF蛋白染色陽(yáng)性細(xì)胞,藍(lán)色箭頭示BDNF mRNA染色陽(yáng)性細(xì)胞,綠色箭頭示凋亡染色陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞。

2.4 原位雜交染色結(jié)果HF-rTMS刺激2周后,各組大鼠視皮層中均有BDNF mRNA染色陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),BDNF mRNA表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)中,被染成棕黃色或淡黃色,與藍(lán)染的細(xì)胞核重疊。HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS組陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(0.94±0.15,62.3±4.5)均高于MD組(0.51±0.10,40.6±3.7),低于NC組(1.48±0.10,90.3±4.7),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)(圖3)。

2.5 TUNEL染色結(jié)果HF-rTMS刺激2周后,各組大鼠視皮層中均有凋亡染色陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn),表達(dá)位于細(xì)胞核中,呈棕黃色或淡黃色,與藍(lán)染的細(xì)胞核重疊。HF-rTMS刺激2周后,MD+HF-rTMS組凋亡染色陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)(54.6±8.6)低于MD組(84.8±6.3),高于NC組(23.9±5.9),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.001)(圖3)。

3 討論

弱視是一種常見(jiàn)的兒童眼病,可導(dǎo)致視路之間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,臨床主要表現(xiàn)為矯正視力低下。PVEP是視功能檢查的客觀手段[14],可反映從視網(wǎng)膜到視皮層之間的視覺(jué)傳導(dǎo)功能。在本研究中,我們對(duì)3周齡大鼠進(jìn)行3周的眼瞼縫合后,剝奪眼P100波振幅下降,提示3周的形覺(jué)剝奪可造成弱視。經(jīng)HF-rTMS治療2周后,MD+HF-rTMS組大鼠P100波振幅高于MD組,提示HF-rTMS可改善弱視大鼠視覺(jué)功能。

BDNF作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),通過(guò)與特異性受體結(jié)合,激活下游通路,對(duì)大腦的發(fā)育,神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化,以及對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[8]。研究表明,BDNF對(duì)弱視的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義,弱視發(fā)生時(shí)個(gè)體BDNF表達(dá)下降[15],通過(guò)鼻腔注射BDNF可長(zhǎng)期改善弱視大鼠的視覺(jué)功能[9]。本研究發(fā)現(xiàn),MD組大鼠視皮層BDNF蛋白及mRNA表達(dá)明顯低于NC組,這與既往研究結(jié)果一致。近年來(lái),大量研究發(fā)現(xiàn),HF-rTMS治療可提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬及皮層中BDNF的表達(dá)。Shang等[16]研究發(fā)現(xiàn),HF-rTMS治療可提高正常大鼠的認(rèn)知功能和海馬區(qū)BDNF的表達(dá);Ma等[17]通過(guò)對(duì)衰老的昆明小鼠進(jìn)行HF-rTMS治療發(fā)現(xiàn),其改善了老年小鼠的認(rèn)知缺陷,提高了海馬區(qū)BDNF的表達(dá)。長(zhǎng)期失重可造成小鼠的學(xué)習(xí)和記憶缺陷,Zhai等[18]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)HF-rTMS治療長(zhǎng)期失重可使受試對(duì)象記憶受損減輕,海馬區(qū)BDNF表達(dá)升高。Zhang等[19]通過(guò)對(duì)血管性癡呆大鼠模型進(jìn)行HF-rTMS治療發(fā)現(xiàn),血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力提高,海馬區(qū)BDNF的表達(dá)水平上升。而對(duì)于更嚴(yán)重的大腦中動(dòng)脈堵塞大鼠模型,Cui等[20]通過(guò)有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合HF-rTMS進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn),大鼠運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位提高、梗死面積減少、皮質(zhì)中BDNF的表達(dá)明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn),HF-rTMS治療后,大鼠視皮層BDNF蛋白及mRNA表達(dá)增加,提示HF-rTMS改善弱視大鼠視功能的作用機(jī)制和提高BDNF表達(dá)有關(guān)。

凋亡是一種程序性死亡,通常發(fā)生在細(xì)胞發(fā)育和衰老過(guò)程中。而弱視屬于神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。研究發(fā)現(xiàn),弱視的發(fā)生可導(dǎo)致視皮層凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯增加[21],本研究發(fā)現(xiàn),MD組大鼠視皮層凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯多于NC組,與既往研究結(jié)果一致。既往研究發(fā)現(xiàn),HF-rTMS治療具有抗凋亡作用,Yoon等[22]對(duì)缺血模型大鼠進(jìn)行HF-rTMS治療發(fā)現(xiàn),缺血區(qū)域Bcl2蛋白表達(dá)升高,促凋亡蛋白Bax表達(dá)下降。Guo等[23]對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞模型進(jìn)行HF-rTMS治療發(fā)現(xiàn),模型動(dòng)物海馬區(qū)Bcl2蛋白表達(dá)升高,Bax蛋白表達(dá)以及凋亡陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)降低。Yan等[24]對(duì)抑郁大鼠模型進(jìn)行HF-rTMS治療發(fā)現(xiàn),海馬區(qū)Bcl2蛋白表達(dá)升高,Bax蛋白表達(dá)以及凋亡陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)降低。本研究發(fā)現(xiàn),MD+HF-rTMS組大鼠視皮層凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯低于MD組,提示HF-rTMS可改善弱視大鼠視皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。

此外, 有學(xué)者發(fā)現(xiàn),BDNF可通過(guò)拮抗N-甲基-D-天冬氨酸受體的興奮性毒性作用,促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞再生而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,并通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl2蛋白和/或通過(guò)Bad和Bim等凋亡相關(guān)蛋白的翻譯后修飾而發(fā)揮抗凋亡作用[10]。本研究結(jié)果顯示,HF-rTMS治療后大鼠視皮層BDNF表達(dá)升高,神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)降低,推測(cè)HF-rTMS的作用機(jī)制可能是通過(guò)提高BDNF的表達(dá),激活下游抗凋亡通路,進(jìn)而減少視皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡,最終參與神經(jīng)重塑過(guò)程。