劉曉瑞 楊淑芳 曾 崢 丁然然 趙 宇 由彩云

非感染性葡萄膜炎是一類常見的、嚴(yán)重威脅視力的炎癥性眼病,好發(fā)于青壯年,可造成沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或生物制劑是目前治療非感染性葡萄膜炎的主要方式,但這些藥物長期使用時(shí)療效局限并可能產(chǎn)生局部或全身副作用[2-3]。因此,尋求一種毒副作用小,療效確切且穩(wěn)定的治療藥物成為當(dāng)前非感染性葡萄膜炎研究的重點(diǎn)。

利妥昔單抗(RTX)是一種人鼠嵌合型抗CD20單克隆抗體,可特異性地與前體B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞膜表面CD20受體結(jié)合,已被批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Wegener肉芽腫和尋常型天皰瘡等自身免疫性疾病[4]。在炎癥性眼病治療方面有少數(shù)應(yīng)用RTX的病例報(bào)道,包括周邊潰瘍性角膜炎[5-6]、難治性葡萄膜炎[7]、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性葡萄膜炎[8]和視網(wǎng)膜血管炎[9-10]等,但其中的具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過構(gòu)建與非感染性葡萄膜炎致病機(jī)制相似的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠模型[11],探討RTX對(duì)EAU小鼠的抗炎作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取SPF級(jí)6～8周齡健康雌性C57BL/6J小鼠27只,體重18～20 g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)條件:溫度20～26 ℃,相對(duì)濕度30%～70%,最低工作照度150 lx,晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h,自由飲水,使用滅菌墊料與鼠糧進(jìn)行喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作符合天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物保護(hù)與倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。本研究方案經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批文號(hào):IRB2022-DW-31)。

1.1.2 試劑及儀器光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白1-20(IRBP1-20)多肽、特異性引物(上海生工生物工程股份有限公司),完全弗氏佐劑(美國Sigma公司),結(jié)核分枝桿菌(美國Difco公司),百日咳毒素(美國List Biological Laboratories公司),RTX注射液、SYBR(瑞士Roche公司),Trizol(美國Thermo公司),cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司),FAS眼球固定液、蘇木素、伊紅染液(武漢賽維爾生物科技有限公司);小動(dòng)物視網(wǎng)膜成像儀(美國Phoenix Research Labs公司),PCR熱循環(huán)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 EAU模型的建立及分組將含有300 μg IRBP1-20多肽的PBS溶液與等體積含有300 μg結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑溶液充分混合為油包水狀態(tài)的乳化劑,在每只小鼠四肢根部皮下注射50 μL,同時(shí)腹腔注射0.5 μg百日咳毒素以增強(qiáng)免疫,建立EAU小鼠模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將EAU小鼠隨機(jī)分為PBS對(duì)照組、50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組和100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組,每組各9只小鼠,PBS對(duì)照組小鼠腹腔注射PBS,50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組和100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組小鼠每千克體重分別腹腔注射50 mg RTX和100 mg RTX,從造模后第1天至第21天對(duì)各組小鼠進(jìn)行連續(xù)干預(yù)。

1.2.2 EAU小鼠眼底圖像采集及臨床評(píng)分于造模后第21天,使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳,貝復(fù)舒凝膠涂眼,通過小動(dòng)物視網(wǎng)膜成像儀采集各組小鼠眼底圖像并參照Caspi臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行炎癥評(píng)分[12]。

1.2.3 EAU小鼠視網(wǎng)膜組織HE染色及組織病理學(xué)評(píng)分于造模后第21天,頸椎脫臼法處死小鼠,取一側(cè)眼球置于FAS眼球固定液固定24 h,之后進(jìn)行梯度酒精脫水,石蠟包埋,再沿瞳孔-視神經(jīng)軸連續(xù)切片,切片厚度為4 μm。然后,將石蠟切片依次進(jìn)行二甲苯脫蠟,酒精脫水,流水沖洗,HE染色,再經(jīng)脫水、透明,最后中性樹膠封片,完成視網(wǎng)膜組織的HE染色。將HE染色切片置于顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照,參照Caspi組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[12]。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠視網(wǎng)膜組織白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-6和IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量,使用Trizol試劑提取視網(wǎng)膜組織總RNA,NanoDrop one超微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反應(yīng)體系將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后以cDNA和基因特異性引物(表1)為模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,58 ℃退火+延伸1 min,共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因表達(dá)水平。

表1 特異性引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, GraphPad Prism 9軟件制作統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)即Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠眼底圖像及臨床評(píng)分比較眼底圖像顯示:PBS對(duì)照組EAU小鼠眼底出現(xiàn)多發(fā)性血管炎,血管擴(kuò)張,視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜出現(xiàn)多發(fā)病灶及少量線樣病變;50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠眼底發(fā)生輕度血管炎,視網(wǎng)膜出現(xiàn)個(gè)別局部病灶,無線樣病變;100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠視網(wǎng)膜局部出現(xiàn)個(gè)別病灶,無線樣病變(圖1)。PBS對(duì)照組、50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組和100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠眼底圖像Caspi臨床評(píng)分分別為(1.944±0.808)分、(1.667±0.791)分、(1.667±0.829)分,三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組EAU小鼠眼底圖像 A:PBS對(duì)照組;B:50 mg· kg-1 RTX實(shí)驗(yàn)組;C:100 mg·kg-1 RTX實(shí)驗(yàn)組。

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果及組織病理學(xué)評(píng)分比較HE染色結(jié)果顯示:PBS對(duì)照組EAU小鼠玻璃體內(nèi)及視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤,視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)部分紊亂,存在大量視網(wǎng)膜皺褶,部分光感受器細(xì)胞破壞;50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠玻璃體內(nèi)及視網(wǎng)膜組織中有少量炎癥細(xì)胞浸潤;100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠視網(wǎng)膜組織中出現(xiàn)少數(shù)炎癥細(xì)胞浸潤(圖2)。PBS對(duì)照組、50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組和100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)評(píng)分分別為(1.563±1.116)分、(1.063±0.623)分、(1.250±0.655)分,三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組EAU小鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果(×200) A:PBS對(duì)照組;B:50 mg· kg-1 RTX實(shí)驗(yàn)組;C:100 mg·kg-1 RTX實(shí)驗(yàn)組。

2.3 各組小鼠視網(wǎng)膜組織炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組和100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量以及IL-10/IL-6比值均高于PBS對(duì)照組(均為P<0.05);100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組小鼠視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量以及IL-10/IL-6比值均高于50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組(均為P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

葡萄膜炎是一類嚴(yán)重威脅視力的眼病,目前仍有部分難治型非感染性葡萄膜炎患者沒有合適的治療方法。少數(shù)臨床病例報(bào)道RTX對(duì)葡萄膜炎[13]有一定療效,但缺乏相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的證據(jù)。本研究通過構(gòu)建EAU小鼠模型探討不同劑量的RTX在緩解EAU炎癥中的作用及機(jī)制。研究結(jié)果顯示,腹腔注射RTX后,不同劑量RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)及IL-10/IL-6比值均顯著升高(均為P<0.05),且100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)及IL-10/IL-6比值均高于50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組(均為P<0.05)。但不同劑量RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠眼底臨床評(píng)分與組織病理學(xué)評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)合視網(wǎng)膜組織IL-6與IL-10細(xì)胞因子水平的變化與RTX劑量相關(guān),我們考慮給藥劑量與取材時(shí)間是影響EAU眼底臨床表現(xiàn)的主要因素。研究結(jié)果顯示,腹腔注射RTX可調(diào)節(jié)EAU小鼠視網(wǎng)膜組織IL-10與IL-6之間的平衡,使IL-10/IL-6比值顯著升高且與劑量相關(guān),表明RTX在改善EAU小鼠視網(wǎng)膜組織的炎癥性病變中起正向調(diào)節(jié)作用。

IL-6由內(nèi)皮細(xì)胞和眼實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,可促進(jìn)巨噬細(xì)胞激活和B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化,在包括葡萄膜炎在內(nèi)的多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腹腔注射RTX后EAU小鼠視網(wǎng)膜組織IL-6 mRNA表達(dá)升高,我們考慮這可能與給藥方式、給藥劑量以及取材時(shí)間相關(guān)。IL-10是一種重要的抗炎多功能細(xì)胞因子,可由多種免疫細(xì)胞分泌,可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖及抗體分泌,促進(jìn)非單核細(xì)胞依賴性T淋巴細(xì)胞增殖成熟[15]。已有文獻(xiàn)證明,IL-10的產(chǎn)生與疾病的消退有關(guān),提示其在EAU病情的緩解中可能具有重要意義[16]。Sun等[17]研究發(fā)現(xiàn),在重癥肌無力患者中,對(duì)RTX治療反應(yīng)良好的患者體內(nèi)B細(xì)胞增殖明顯,這些B細(xì)胞能快速地產(chǎn)生IL-10。Chocova等[18]發(fā)現(xiàn),在抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎中,應(yīng)用RTX治療的患者在緩解期產(chǎn)生IL-10的單核細(xì)胞比例會(huì)保持穩(wěn)定。在本研究中,不同劑量RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠視網(wǎng)膜組織IL-10 mRNA表達(dá)均顯著高于PBS對(duì)照組,且100 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組IL-10 mRNA表達(dá)顯著高于50 mg·kg-1RTX實(shí)驗(yàn)組,表明RTX在EAU小鼠的炎癥緩解中發(fā)揮正向作用。

IL-6和IL-10的表達(dá)水平常被用于衡量炎癥和抗炎的平衡情況。研究表明,在HLA- B27陽性葡萄膜炎患者以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中,IL-6/IL-10比值與疾病活動(dòng)程度呈正相關(guān)且對(duì)患者的預(yù)后具有臨床指導(dǎo)意義[14,19]。Talaat等[20]研究發(fā)現(xiàn),與健康對(duì)照組相比,白塞病患者血清中IL-6/IL-10比值顯著升高。本研究結(jié)果顯示不同劑量RTX實(shí)驗(yàn)組EAU小鼠視網(wǎng)膜組織IL-10/IL-6比值均顯著升高,提示RTX可通過調(diào)節(jié)IL-10/IL-6比值改善EAU小鼠視網(wǎng)膜組織的炎性環(huán)境且作用強(qiáng)度與RTX劑量相關(guān)。

綜上所述,我們探討了不同劑量的RTX對(duì)EAU小鼠的抗炎作用及其機(jī)制,結(jié)果表明,腹腔注射RTX可一定程度緩解EAU小鼠視網(wǎng)膜組織的炎性病變,其機(jī)制可能與RTX提高小鼠視網(wǎng)膜組織IL-10/IL-6比值有關(guān)。