尹 伊 徐 瑩 趙玉澤 王晨旭 肖培倫 李曉雙 王曉莉 趙巖松

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(RIRI)是眼科常見的一種病理生理過程,其與急性閉角型青光眼、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞有M1型(促炎型)和M2型(抑炎型)兩種激活狀態(tài)[2]。有研究報道[3-5],腦缺血后大鼠腦組織中JAK2/STAT3信號通路被激活,加重腦缺血后炎癥反應(yīng)。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素(CUR)可通過血腦屏障,有效減少腦損傷后激活的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量,且可促進M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化,減輕缺血性腦卒中誘發(fā)的腦損傷,推測CUR可通過JAK2/STAT3信號通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化,進而減輕RIRI。因此,本研究通過高眼壓法建立大鼠RIRI模型,觀察CUR對RIRI大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化的影響,并從JAK2/STAT3信號通路探討其機制,為CUR的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組處理健康雄性成年Sprague Dawley大鼠(購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司)36只,體重200～220 g。實驗前將大鼠隨機分為假手術(shù)(Sham)組、RIRI組與CUR組,每組各12只。其中,RIRI組和CUR組大鼠采用高眼壓法建立大鼠RIRI模型,Sham組僅將針頭刺入大鼠右眼前房,不升高眼壓。CUR組于造模前30 min腹腔注射CUR(100 mg·kg-1),RIRI組和Sham組腹腔注射等劑量生理鹽水。實驗動物操作均符合國家科學(xué)技術(shù)委員會制定的《實驗動物管理條例》,且已獲得濰坊醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號:2019SDL099)。

1.1.2 主要試劑CUR粉末(美國MCE公司);兔抗Iba-1抗體(日本W(wǎng)ako公司);鼠抗Arg1抗體、鼠抗GAPDH抗體(武漢Proteintech Group公司);鼠抗Iba-1抗體(美國Santa Cruz公司);兔抗CD16抗體、兔抗p-STAT3抗體、兔抗STAT3抗體、兔抗JAK2抗體、兔抗p-JAK2抗體(江蘇Affinity Biosciences公司);山羊抗兔二抗試劑盒、山羊抗小鼠二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);HE染色試劑盒(北京Solarbio有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RIRI模型的建立采用前房高眼壓法建立大鼠右眼RIRI模型[6]。10 g·L-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,鹽酸奧布卡因滴眼液局部麻醉,針頭沿右眼顳側(cè)角膜緣刺入前房并固定,升高生理鹽水瓶,使眼壓增加至110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg),此時,大鼠前房加深,球結(jié)膜蒼白,直接檢眼鏡下發(fā)現(xiàn)大鼠眼底蒼白;持續(xù)60 min后拔除針頭,視網(wǎng)膜血流恢復(fù),造模成功,滴加抗生素眼液預(yù)防感染。

1.2.2 標(biāo)本的采集及石蠟切片的制作造模后24 h,各組隨機選取6只大鼠腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉麻醉后處死,完整取出右眼球,固定液中固定約24 h,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟包埋,平行于視神經(jīng)矢狀軸切片,制成厚4 μm的石蠟切片。

1.2.3 HE染色石蠟切片脫蠟至水,蘇木素液染色10 min,去離子水沖洗,分化液分色后,去離子水沖洗,伊紅染色2 min,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化,計數(shù)視網(wǎng)膜單位面積內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)數(shù)量并測量內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度(內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度為從內(nèi)界膜到內(nèi)核層的距離),測量3次,取平均值記錄。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色石蠟切片脫蠟至水,抗原修復(fù),體積分?jǐn)?shù)3% H2O2中37 ℃孵育 30 min。50 g·L-1牛血清白蛋白(BSA)-磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉后,分別加入兔抗JAK2抗體(1180)、兔抗p-JAK2抗體(1180)、兔抗STAT3抗體(1200)、兔抗p-STAT3抗體(1180)、鼠抗 Brn-3a抗體(1100),4 ℃冰箱過夜;37 ℃組織復(fù)溫,滴加二抗試劑,37 ℃孵育60 min,滴加適量試劑3(增強酶標(biāo)羊抗兔IgG聚合物),DAB顯色,蘇木素染核,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。正置光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)視網(wǎng)膜單位面積內(nèi)GCL及內(nèi)核層(INL)p-JAK2+、p-STAT3+細(xì)胞數(shù),以及GCL中Brn-3a+細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 免疫熒光雙標(biāo)染色石蠟切片脫蠟至水,抗原修復(fù),體積分?jǐn)?shù)0.3% TritonX-100透膜,體積分?jǐn)?shù)5% BSA-PBS 37 ℃條件下封閉孵育,依次滴加兔抗Iba-1抗體(1150)、鼠抗Arg1抗體(1200)或鼠抗Iba-1抗體(1150)、兔抗CD16抗體(175),4 ℃冰箱過夜;37 ℃組織復(fù)溫,滴加二抗(1200)試劑,避光37 ℃孵育,含DAPI熒光防淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)視網(wǎng)膜單位面積GCL及INL中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞(即Iba-1+CD16+細(xì)胞)及M2型小膠質(zhì)細(xì)胞(即Iba-1+Arg1+細(xì)胞)的個數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測造模后24 h,將剩余6只大鼠腹腔注射麻醉后,摘除右眼眼球并分離視網(wǎng)膜組織,稱重,加入RIPA組織細(xì)胞裂解液,破碎后離心靜置取上清液,測定蛋白濃度。制備100 g·L-1分離膠和50 g·L-1濃縮膠,進行電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉,加入兔抗STAT3抗體(12000)、兔抗p-STAT3抗體(12000)、兔抗JAK2抗體(12000)、兔抗p-JAK2抗體(12000)、鼠抗GAPDH抗體(110 000),4 ℃冰箱孵育過夜。次日,將目的條帶置入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗(11000)試劑中,高性能成像系統(tǒng)曝光、拍照。應(yīng)用ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度值分析,以目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CUR可減輕大鼠RIRIHE染色結(jié)果顯示,Sham組大鼠視網(wǎng)膜組織各層細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,視網(wǎng)膜厚度適中,可見較多神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;造模后24 h,RIRI組大鼠視網(wǎng)膜組織各層細(xì)胞排列松散紊亂,出現(xiàn)視網(wǎng)膜嚴(yán)重水腫,內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度顯著增加,RGC數(shù)顯著減少;CUR組大鼠再灌注后24 h視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列較為規(guī)整,內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度較RIRI組變薄,且GCL中RGC數(shù)較RIRI組顯著增多(均為P<0.05)(圖1、表1)。

表1 造模后24 h各組大鼠RGC數(shù)及內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度

圖1 HE染色示造模后24 h各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,Sham組大鼠視網(wǎng)膜GCL見大量Brn-3a+細(xì)胞,為(470.23±36.94)個·mm-2;與Sham組相比,造模后24 h,RIRI組大鼠Brn-3a+細(xì)胞數(shù)[(300.78±61.56)個·mm-2]顯著減少,而CUR組大鼠視網(wǎng)膜Brn-3a+細(xì)胞數(shù)[(380.49±44.62)個·mm-2]顯著多于RIRI組(均為P<0.05)(圖2)。

2.2 免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物,CD16是M1型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物,Arg1是M2型小膠質(zhì)細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物,因此,Iba-1/CD16免疫熒光染色法可雙重標(biāo)記M1型小膠質(zhì)細(xì)胞,Iba-1/Arg1免疫熒光染色法可雙重標(biāo)記M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,Sham組大鼠視網(wǎng)膜組織偶見少量Iba-1+CD16+細(xì)胞,為(103.69±19.01)個·mm-2;造模后24 h,RIRI組大鼠視網(wǎng)膜Iba-1+CD16+細(xì)胞數(shù)[(285.26±48.12)個·mm-2]增加,顯著高于Sham組;CUR組大鼠視網(wǎng)膜Iba-1+CD16+細(xì)胞數(shù)[(201.39±29.53)個·mm-2]較Sham組增加,但顯著少于RIRI組(均為P<0.05)。Sham組大鼠視網(wǎng)膜GCL及INL中偶見少量Iba-1+Arg1+細(xì)胞,為(143.90±39.87)個·mm-2;RIRI組大鼠視網(wǎng)膜Iba-1+Arg1+細(xì)胞數(shù)[(231.26±60.35)個·mm-2]增加,顯著高于Sham組; CUR組大鼠視網(wǎng)膜Iba-1+Arg1+細(xì)胞數(shù)[(336.46±53.78)個·mm-2]增加,且顯著高于RIRI組(均為P<0.05)(圖3)。

圖3 免疫熒光雙標(biāo)染色示各組大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞極化情況 A:Iba-1+CD16+細(xì)胞(箭頭);B:Iba-1+Arg1+細(xì)胞(箭頭)。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜p-STAT3、p-JAK2蛋白表達(dá)的變化免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,p-STAT3、p-JAK2陽性細(xì)胞的細(xì)胞漿、細(xì)胞核均呈棕黃色染色,主要表達(dá)于各組大鼠視網(wǎng)膜GCL和INL中。Sham組大鼠視網(wǎng)膜偶見p-STAT3+、p-JAK2+細(xì)胞,分別為(204.21±40.65)個·mm-2、(131.49±29.09)個·mm-2;與Sham組相比,RIRI組大鼠視網(wǎng)膜p-STAT3+、p-JAK2+細(xì)胞數(shù)[(433.30±63.00)個·mm-2、(317.46±53.60)個·mm-2]顯著增多,CUR組大鼠視網(wǎng)膜p-STAT3+、p-JAK2+細(xì)胞數(shù)[(345.59±43.96)個·mm-2、(199.30±49.18)個·mm-2]較Sham組增多,但仍少于RIRI組(均為P<0.05)(圖4)。

圖4 免疫組織化學(xué)染色示造模后24 h各組大鼠視網(wǎng)膜p-STAT3、p-JAK2蛋白表達(dá) A:p-STAT3+細(xì)胞(箭頭);B:p-JAK2+細(xì)胞(箭頭)。

Western blot檢測結(jié)果顯示,Sham組大鼠視網(wǎng)膜p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)微弱;造模后24 h,RIRI組大鼠視網(wǎng)膜p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)較Sham組明顯升高,CUR組較RIRI組明顯下降,但仍高于Sham組(均為P<0.05)(圖5)。

圖5 Western blot檢測示造模后24 h各組大鼠視網(wǎng)膜p-STAT3、p-JAK2蛋白表達(dá) 與Sham組比較,aP<0.05;與RIRI 組比較,bP<0.05。

3 討論

臨床上急性視網(wǎng)膜缺血后,在有限的治療時間窗內(nèi),缺血再通雖然可挽救瀕死的RGC,但缺血再灌注后視網(wǎng)膜微環(huán)境失衡,小膠質(zhì)細(xì)胞活化,調(diào)控炎癥介質(zhì)的分泌,往往導(dǎo)致RIRI,是目前眼科致盲的主要原因及亟待解決的科學(xué)問題。已有研究發(fā)現(xiàn),RIRI后24 h視網(wǎng)膜損傷最為嚴(yán)重,JAK2/STAT3信號通路在大鼠RIRI過程中起著至關(guān)重要的作用,該通路激活后在24 h達(dá)到高峰[7]。本研究通過前房高眼壓法建立大鼠RIRI模型,并采用HE染色及Brn-3a免疫組織化學(xué)法觀察視網(wǎng)膜厚度并比較RGC數(shù)以鑒定模型。本研究發(fā)現(xiàn),造模后24 h,大鼠視網(wǎng)膜水腫,內(nèi)層視網(wǎng)膜增厚,且RGC數(shù)減少;免疫組織化學(xué)結(jié)果進一步證明RIRI大鼠視網(wǎng)膜GCL中Brn-3a+數(shù)減少,提示大鼠RIRI模型建立成功。

小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的第一反應(yīng)細(xì)胞,參與視網(wǎng)膜的損傷修復(fù)和炎癥狀態(tài)。在激活狀態(tài)下,小膠質(zhì)細(xì)胞主要位于視網(wǎng)膜GCL和INL,其作用靶點主要為RGC。視網(wǎng)膜缺血后,RGC破壞,小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)[8-9],激活的小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜局部缺氧微環(huán)境的作用下發(fā)生極化,加重視網(wǎng)膜損傷。CUR具有抗炎、抗氧化、抗血管生成及抗凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[10-12]。近年來研究表明,CUR治療有助于維持血腦屏障的完整性和穩(wěn)定性,可有效抑制腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞激活,并促進M2型小膠質(zhì)的極化,從而減少缺血性腦卒中誘發(fā)的腦損傷[4-5]。研究表明,CUR干預(yù)可通過抑制小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的激活而延緩視網(wǎng)膜變性[13]。本研究發(fā)現(xiàn),CUR干預(yù)后,RIRI大鼠視網(wǎng)膜水腫減輕,RGC數(shù)增加,提示CUR對大鼠RIRI具有神經(jīng)保護作用,這與文獻(xiàn)[4-5,13]報道一致;本研究分別采用Iba-1/CD16、Iba-1/Arg1免疫熒光雙標(biāo)法雙重標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞M1及M2表型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CUR干預(yù)后,RIRI大鼠視網(wǎng)膜Iba-1+CD16+細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞M1型)數(shù)減少,而Iba-1+Arg1+細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞M2型)數(shù)增多,提示CUR干預(yù)可通過抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞極化、促進M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化減輕大鼠RIRI,起到神經(jīng)保護作用,但CUR調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的機制尚有待于進一步研究。

JAK/STAT與缺血、缺氧和氧化應(yīng)激等應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān),由 JAKs 蛋白家族(JAK1、JAK2、JAK3、 TYK2) 和 STATs蛋白家族(STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6)組成[14-16]。研究表明,JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程[15]。JAKs被激活后發(fā)生磷酸化,STATs作為潛伏在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子,其含有的酪氨酸殘基可被JAKs磷酸化,磷酸化的STATs發(fā)生核轉(zhuǎn)位,與目的基因結(jié)合從而啟動轉(zhuǎn)錄[14-15],參與疾病的發(fā)生[17]。JAK2/STAT3信號通路與小膠質(zhì)細(xì)胞極化密切相關(guān)[18],但CUR干預(yù)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化是否與JAK2/STAT3信號通路有關(guān)尚不清楚。研究表明,CUR干預(yù)可通過JAK/STAT通路發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞活性[19-20],還可以調(diào)控JAK2/ STAT3,減輕心肌缺血再灌注損傷,且CUR干預(yù)對腦缺血損傷具有神經(jīng)保護作用,其機制可能亦與JAK2/STAT3信號通路有關(guān)[3,21]。近年來,CUR在視網(wǎng)膜疾病中的應(yīng)用成為當(dāng)前研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn),CUR可通過上調(diào)p-STAT3減輕RIRI后視網(wǎng)膜神經(jīng)元和微血管損傷[22]。而JAK2/STAT3信號通路與小膠質(zhì)細(xì)胞極化密切相關(guān)[18],且CUR干預(yù)可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化,推測CUR對RIRI大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞的保護作用可能與JAK2/STAT3通路有關(guān)。本研究采用免疫組織化學(xué)結(jié)合Western blot的檢測方法,發(fā)現(xiàn)CUR干預(yù)后,大鼠視網(wǎng)膜組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達(dá)均下調(diào),由此推測,CUR調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化、減輕大鼠RIRI的機制可能與JAK2/STAT3通路的激活有關(guān)。

綜上所述,CUR可抑制RIRI大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化,促進其M2型極化,從而減輕大鼠RIRI,具有神經(jīng)保護作用,其機制可能與下調(diào)JAK2/STAT3信號通路有關(guān),從而為CUR的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。CUR如何下調(diào)JAK2/STAT3信號通路,進而調(diào)控RIRI大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞極化的機制尚有待于進一步研究。