劉燁妹，李夢玲，吳勝男，李思宇，趙闖

（中國醫(yī)科大學 1.附屬盛京醫(yī)院藥學部，沈陽 110004；2.附屬第一醫(yī)院臨床流行病學與循證醫(yī)學教研室，沈陽 110001；3.附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科二病房，沈陽 110001；4.附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學教研室，沈陽 110001；5.附屬盛京醫(yī)院普通外科，沈陽 110004）

肺腺癌是最常見的肺癌類型，約占非小細胞肺癌的50%。早期肺腺癌往往沒有明顯癥狀，因此很難發(fā)現(xiàn)。許多患者確診時已是晚期，嚴重影響患者的生存質(zhì)量。目前，對于驅(qū)動基因突變的治療僅適用于少數(shù)肺腺癌患者，由于腫瘤異質(zhì)性和易產(chǎn)生耐藥性等因素，其治療效果不佳或者難以維持。免疫治療已經(jīng)在肺腺癌治療中取得了很大的進展，但是并非所有患者都能夠從免疫治療中受益［1］。腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment，TME）是指腫瘤細胞周圍的組織環(huán)境，包括免疫細胞、炎癥細胞、血管、基質(zhì)細胞、生長因子等多種成分以及它們之間的相互作用。TME中的免疫細胞類型、數(shù)量以及它們與腫瘤細胞之間的相互作用，都會對肺腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)產(chǎn)生影響［2］。因此，探究肺腺癌TME具有重要意義。

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICB）治療是一種新型的肺腺癌治療方法，它是通過抑制免疫檢查點分子（PD-1、PD-L1等）來增強免疫系統(tǒng)對肺腺癌的攻擊能力。肺腺癌細胞會利用免疫檢查點分子來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，使得免疫細胞無法識別和攻擊癌細胞，從而導(dǎo)致肺腺癌進展。ICB通過阻止免疫檢查點分子的作用使免疫細胞能夠再次識別和攻擊癌細胞，從而抑制肺腺癌進展［3］。因此，明確肺腺癌的TME可以為肺腺癌患者的治療和預(yù)后評估提供準確的依據(jù)。本研究利用生物信息學探討肺腺癌TME特征基因以及相關(guān)基因?qū)颊呱鏁r間及ICB療效的預(yù)測價值，構(gòu)建免疫治療以及預(yù)測免疫治療療效的相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集和預(yù)處理

使用2個具有ICB治療信息的非小細胞肺癌公開測序數(shù)據(jù)集：（1）基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫中GSE136961微陣列數(shù)據(jù)集（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE136961）；（2）癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者的數(shù)據(jù)樣本（TCGA-LUAD測序數(shù)據(jù)集，https：//portal.gdc.cancer.gov/projects/TCGA-LUAD）。使用Oncomine Immune Response Research Assay篩選出與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因并下載以便進一步分析。

使用篩選出的免疫應(yīng)答相關(guān)基因?qū)CGA-LUAD測序數(shù)據(jù)集進行基因表達的非負矩陣分解（non-negative matrix factorization，NMF）聚類分析，通過Kaplan-Meier生存分析繪制聚類分析結(jié)果的生存曲線，然后使用基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）對C1、C2 2種免疫亞型進行活性評分。

1.2 免疫浸潤分析

應(yīng)用R語言中ESTIMATE［4］包來估計C1、C2 2種免疫亞型的腫瘤純度（樣本中腫瘤細胞的比例）；TIDE［5］包進行免疫應(yīng)答評分（TIDE評分）來預(yù)測潛在的ICB療效，評分較低提示免疫應(yīng)答效果較好；maftools［6］包進行腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）分析以及基因組DNA拷 貝數(shù)變異（copy number variations，CNV）分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）［7］可以將基因表達數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為共表達網(wǎng)絡(luò)來分析基因間的關(guān)系。WGCNA將相似表達模式的基因分組，并對它們進行功能注釋。利用WGCNA對GSE136961微陣列數(shù)據(jù)集中篩選出的免疫應(yīng)答相關(guān)基因進行分析，找到與PD-1免疫應(yīng)答最相關(guān)的基因模塊，同時對TCGA-LUAD測序數(shù)據(jù)集中篩選出的免疫應(yīng)答相關(guān)基因進行批量生存分析，取兩者交集，使用R語言中Cluster-Profile［8］包進行基因本體（Gene Onotology，GO）富集分析和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，利用Cytoscape的regulon［9］模塊進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件繪制Kaplan-Meier曲線，log-rank檢驗方法計算P值并進行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫亞型聚類分析

共獲得395個免疫應(yīng)答相關(guān)基因。將395個免疫應(yīng)答相關(guān)基因作為輸入數(shù)據(jù)，對來自TCGA-LUAD測序數(shù)據(jù)集中的510例原發(fā)性肺腺癌患者進行NMF聚類，獲得C1和C2 2種免疫亞型（圖1A）。通過Kaplan-Meier生存分析繪制C1、C2 2種免疫亞型患者的生存曲線。結(jié)果顯示，與C1免疫亞型患者比較，C2亞型患者具有更好的生存預(yù)后（圖1B）。GSEA分析結(jié)果顯示，C2免疫亞型相對于C1免疫亞型表現(xiàn)出更高的得分（圖2），可見C2亞型患者的免疫系統(tǒng)更加活躍，并且對于腫瘤免疫更敏感，這也可能是C2亞型患者具有更好生存預(yù)后的原因之一。

圖1 TCGA-LUAD測序數(shù)據(jù)集中510例原發(fā)性肺腺癌患者NMF聚類分析結(jié)果（A）和C1和C2 2種免疫亞型的Kaplan-Meier生存分析（B）Fig.1 NMF clustering results of 510 primary lung adenocarcinoma patients from the TCGA-LUAD sequencing dataset（A）and Kaplan-Meier survival analysis for two immune subtypes，C1 and C2（B）

圖2 C1、C2 2種免疫亞型的基因集富集分析GSEA分析Fig.2 Gene set enrichment analysis of the two immune subtypes C1 and C2 GSEA analysis

通過SITMATE和CIBERSORT對TCGA-LUAD測序數(shù)據(jù)量化的結(jié)果顯示，2種免疫亞型中22種免疫細胞類型相對豐度不同。免疫細胞中巨噬細胞M2比例最高，多數(shù)免疫細胞在2種免疫亞型間存在差異分布（圖3A）。為了進一步明確2種免疫亞型在免疫治療過程中的反應(yīng)，本研究使用R語言中ESTIMATE包來評估2種免疫亞型的免疫和基質(zhì)評分。結(jié)果顯示，C2亞型免疫評分顯著高于C1亞型（P<0.05，圖3B）。利用TIDE算法對TCGA-LUAD測序數(shù)據(jù)集中的ICB反應(yīng)進行評估，結(jié)果顯示，C2亞型的TIDE評分顯著低于C1亞型（P<0.05，圖4A），TIDE評分越低表示免疫系統(tǒng)在腫瘤內(nèi)部更加活躍，更容易對免疫治療產(chǎn)生響應(yīng)，C2亞型的腫瘤具有更好的免疫治療響應(yīng)能力。TMB是腫瘤細胞中突變的數(shù)量，是衡量腫瘤免疫治療響應(yīng)能力的指標，高TMB通常與更好的免疫治療響應(yīng)相關(guān)。與C2亞型比較，C1亞型具有更高的TMB（Wilcoxon秩和檢驗，P<0.001，圖4B），說明C1亞型可能對ICB治療亦具有良好的響應(yīng)能力。但是與C2亞型相比，C1亞型TIDE評分相對較高，這意味著C1亞型的腫瘤內(nèi)部免疫系統(tǒng)相對不活躍，可能需要更多的免疫刺激來激發(fā)對免疫治療的響應(yīng)。另外，CNV分析結(jié)果顯示，2種免疫亞型中鑒定出 20 個顯著突變基因，其中TTN、TP53、MUC16在C1亞型中突變頻率更高。見圖5。

圖3 2種免疫亞型的22種免疫細胞比例和免疫、基質(zhì)評分Fig.3 Proportions of 22 immune cells and scores of immunity and matrix for the two immune subtypes

圖4 C1、C2 2種免疫亞型的免疫應(yīng)答TIDE評分和腫瘤突變負荷TMB分析Fig.4 TIDE scores of immune responses and TMB analysis for C1 and C2 immune subtypes

圖5 CNV分析結(jié)果Fig.5 R esults of CNV analysis

2.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析

利用GSE136961微陣列數(shù)據(jù)集中395個免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達矩陣及其樣本類別（免疫應(yīng)答和非免疫應(yīng)答）進行WGCNA分析，構(gòu)建無標度共表達網(wǎng)絡(luò)，生成了5個基因模塊，以2 的冪作為最佳軟閾值。在這些模塊中，棕色模塊與免疫耐受樣本的相關(guān)性最高（|r|=0.51，P=0.02），被認為是“免疫耐受模塊”（圖6）。另一方面，對TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集中的395個免疫應(yīng)答相關(guān)基因進行批量生存分析，篩選出49個與生存有關(guān)的基因，將“免疫耐受特定模塊”基因與這49個基因取交集，最后得到10個與免疫耐受以及生存相關(guān)的基因，分別為BRCA2、FOXM1、MELK、BRCA1、TUBB、CD52、SDHA、MIF、IRS1、NFATC1。這10個交集基因的KEGG和GO富集分析結(jié)果顯示，主要與DNA損傷以及細胞周期的通路相關(guān)，見圖7。

圖6 GSE136961微陣列數(shù)據(jù)集的免疫應(yīng)答相關(guān)模塊WGCNA分析Fig.6 WGCNA analysis of the immune response-related modules in the GSE136961 microarray dataset

圖7 10個交集基因的KEGG和GO富集分析Fig.7 KEGG and GO enrichment analysis of the 10 intersection genes

2.3 生存分析

利用Cytoscape的Regulon調(diào)控分析工具對BRCA2、FOXM1、MELK、BRCA1、TUBB、CD52、SDHA、MIF、IRS1、NFATC110個基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析，結(jié)果顯示，E2F4是調(diào)控BRCA1、BRCA2、FOXM1、MELK、TUBB5個靶基因的轉(zhuǎn)錄因子；這5個與免疫耐受相關(guān)的靶基因在C1亞型顯著高表達（圖8）。

圖8 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F4及5個靶基因在C1、C2 2種免疫亞型的表達Fig.8 Expression of transcription factor E2F4 and its five target genes in C1 and C2 subtypes

對TCGA-LUAD數(shù)據(jù)集的E2F4轉(zhuǎn)錄因子以及篩選出的5個與免疫耐受有關(guān)的靶基因（BRCA1、BRCA2、FOXM1、MELK、TUBB）進行生存分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F4的高表達與肺腺癌預(yù)后不良有關(guān)，5個與免疫耐受相關(guān)基因（BRCA1、BRCA2、FOXM1、MELK、TUBB）高表達患者預(yù)后差（均P<0.05，圖9）。

圖9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F4及5個靶基因的生存分析Fig.9 Survival analysis of the transcriptional regulator E2F4 and its five target genes

3 討論

正常細胞變成癌細胞既需要內(nèi)在因素（驅(qū)動基因的激活、無限制的增殖和對細胞凋亡的抵抗等），也需要外部因素（逃避免疫殺傷等）。當癌細胞形成并發(fā)展時會繼續(xù)逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，從而形成惡性腫瘤［10］。另一方面，免疫細胞在TME內(nèi)發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，防止癌癥生長。因此，可以通過增強免疫監(jiān)視來抑制腫瘤的發(fā)生和進展。目前，靶向PDL1/PD-1 ICB治療可以在非小細胞肺癌治療領(lǐng)域使用［11］。然而，肺腺癌患者并非都對ICB治療有良好的反應(yīng)［12］。

本研究利用NMF算法，在TCGA-LUAD測序數(shù)據(jù)集中獲得C1和C2 2種免疫亞型，并且這2種亞型呈現(xiàn)出不同的免疫活性［13］。本研究使用不同的算法來評估樣本中異質(zhì)免疫細胞的免疫評分、基質(zhì)評分、絕對或相對浸潤豐度，發(fā)現(xiàn)C2亞型的免疫評分更高，這意味著C2亞型患者具有更強的免疫反應(yīng)；使用TIDE算法預(yù)測C2亞型中ICB治療反應(yīng)更敏感。這表明2種免疫亞型對ICB治療的潛在反應(yīng)不同。然而本研究結(jié)果顯示2種免疫亞型中，C1亞型的TMB明顯高于C2亞型，表明在肺腺癌數(shù)據(jù)集中TMB升高也許并不意味ICB治療效果較好，TMB可能不是肺腺癌ICB治療的生物學標志物［14］。

WGCNA分析結(jié)果顯示，共獲得10個與免疫耐受以及生存相關(guān)的基因，分別為BRCA2、FOXM1、MELK、BRCA1、TUBB、CD52、SDHA、MIF、IRS1、NFATC1。對這10個與免疫耐受以及生存相關(guān)的基因KEGG和GO富集分析結(jié)果顯示，主要與DNA損傷以及細胞周期的通路相關(guān)。對這10個基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析發(fā)現(xiàn)E2F4是調(diào)控5個靶基因（BRCA1、BRCA2、FOXM1、MELK、TUBB）的轉(zhuǎn)錄因子，對2種免疫亞型中E2F4和調(diào)控的5個靶基因（BRCA1、BRCA2、FOXM1、MELK、TUBB）進行表達及生存分析結(jié)果顯示，E2F4和調(diào)控的5個靶基因高表達的肺腺癌患者生存時間較短，ICB治療療效較差。

研究發(fā)現(xiàn)E2F4上調(diào)與TP53失活顯著相關(guān)，而TP53突變可能是ICB治療耐藥性差的機制之一［15］。另有研究［16］表明E2F4與肝癌的免疫細胞浸潤顯著相關(guān)，但E2F4表達與免疫純度呈負相關(guān)。因此，E2F4可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式影響肺腺癌免疫微環(huán)境，從而影響肺腺癌免疫應(yīng)答敏感性［16］。E2F4是調(diào)節(jié)BRCA1、BRCA2、FOXM1、MELK、TUBB5個與免疫耐受相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；這5個與免疫耐受相關(guān)基因高表達與預(yù)后不良、免疫活性低和免疫應(yīng)答率低的C1亞型相關(guān)。其中，BRCA1和BRCA2是與遺傳性乳腺癌和卵巢癌有關(guān)的重要基因，同時BRCA1調(diào)節(jié) RAD51的活性，而RAD51在同源DNA序列重組中具有催化活性［17］。TUBB的過表達與肺癌化療耐藥性有關(guān)，β-微管蛋白在細胞周期中發(fā)揮著重要的作用，同時TUBB的過表達與實體瘤的預(yù)后不良以及微管蛋白結(jié)合藥物的耐藥性有關(guān)［18］。FOXM1激活會促進免疫細胞功能受到抑制，F(xiàn)OXM1編碼的蛋白在細胞的代謝、增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程中均起重要的作用［19］。

綜上所述，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F4及與免疫耐受相關(guān)的5個靶基因可以作為臨床免疫治療用藥以及預(yù)后不良的標靶基因。本研究基于生物信息學分析對肺腺癌的免疫應(yīng)答和免疫浸潤進行了全面論證，但還需要進行組織病理學檢查和臨床試驗等進一步驗證，以明確其作為生物標志物的臨床效用［20］。另外，免疫逃避機制也是免疫系統(tǒng)失調(diào)的特征，在肺腺癌的進展中起重要作用。因此，今后研究應(yīng)綜合考慮免疫細胞浸潤和癌癥免疫逃避對肺腺癌的影響。