邱輝，周佳任

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產科，沈陽 110004）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，85%～90%的卵巢癌來源于上皮細胞。卵巢癌早期癥狀不明顯，大部分患者確診時已是晚期，且預后較差，5年生存率約為30%。卵巢癌致死率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中高居首位［1］。因此，尋找卵巢癌新的生物標志物對明確臨床診斷及卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制意義重大。

近年來研究［2-3］發(fā)現長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。lncRNA MALAT1位于染色體11q13.1，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移相關。肝癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、宮頸癌以及結直腸癌等多種腫瘤組織中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達均升高［4］。已有研究［5］顯示，MALAT1在卵巢癌組織中高表達，與卵巢癌FIGO分期、淋巴結轉移和組織分期及預后密切相關。

人微RNA 218（microRNA 218，miR-218）是腫瘤抑制因子，位于染色體4p15.31，在多種腫瘤中通過調控靶基因的表達，影響腫瘤增殖、凋亡和遷移等生物學行為［6-8］。臨床研究［9］表明，miR-218在卵巢癌中低表達，與卵巢癌惡性程度、腫瘤分化程度以及腫瘤轉移相關。同時，miR-218在卵巢癌干細胞中表達降低，轉染miR-218 模擬物后卵巢癌干細胞增殖減慢，腫瘤球形成能力下降［10］。已有研究［11］顯示，lncRNA MALAT1能夠通過與miR-218相互作用調節(jié)絨毛膜癌的生長。MALAT1在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制尚未明確。本研究探討lncRNA MALAT1靶向miR-218對卵巢癌細胞OVCAR3增殖、侵襲及凋亡的影響及其作用機制，旨在為尋找卵巢癌新的生物學標志物提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑來源

人卵巢癌癌細胞系OVCAR3 和人正常卵巢上皮細胞系HOSE購自上海通派生物科技有限公司，RPMI 1640、胎牛血清、青鏈霉素、細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和實時PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，MALAT1抑制物、熒光報告載體質粒、lncRNA MALAT1、miR-218檢測引物購自上海生工生物工程股份有限公司，熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京Promega 公司，GAPDH和Runx2 抗體購自美國 Santa公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉染及分組

人正常卵巢上皮細胞系HOSE和人卵巢癌細胞系OVCAR3于37℃、5% CO2含10% 胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞生長融合70%～80%時，更換為不含FBS的培養(yǎng)基，同步化12 h后按照lipofectamine3000說明書進行轉染，細胞分為轉染無意義序列陰性對照（si-NC）組、轉染MALAT1干擾序列（si-MALAT1）組、si-MALAT1+miR-218抑制劑組，培養(yǎng)6 h，更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 實時PCR檢測

應用TRIzol法提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，實時PCR試劑盒檢測MALAT1、miR-218的表達。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 50 s，72 ℃30 s，30個循環(huán)，72 ℃，10 min。引物序列：MALAT1，正向5’-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3’，反向5’-C CAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3’；miR-218，正向5’-TTGTGCTTGATCTAACCATGT-3，反向5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6，正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH，正向5’-CGCGGGCTCCAGAACATCA T-3’，反向5’-CCAGCCCCAGCGTCAAAGGTG-3’。實驗重復3次，以U6和GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達。

1.4 Western blotting檢測

收集各組細胞，在冰上用蛋白裂解液提取各組細胞的總蛋白，應用BCA試劑盒對提取的蛋白定量，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，室溫條件5%脫脂奶粉液封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜2次，二抗室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光顯色，用Quantity One圖像分析軟件測量條帶灰度值，以GAPDH為內參分析Runx2蛋白的相對表達。

1.5 MTT法檢測細胞增殖情況

各組細胞培養(yǎng)至24、48、72 h，每孔加入MTT 溶液（20 μL），孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩反應10 min使沉淀溶解，用酶標儀于波長 490 nm處檢測吸光度（optical density，OD）值，實驗重復3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

胰酶消化細胞，離心、收集細胞后采用4 ℃的PBS洗滌細胞，使用Annexin V/PI 檢測試劑盒避光孵育15 min，流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況，實驗重復3次。

1.7 Transwell檢測細胞侵襲情況

取1×105個細胞加入預先鋪好基質膠的Transwell 小室的上室，將含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液加入下室，常規(guī)培養(yǎng)24 h，用棉簽輕輕擦去未穿膜的細胞，多聚甲醛固定下室中的細胞，結晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照計數。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證MALAT1與miR-218的靶向關系。將HEK-293細胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后用lipofectamine2000將含有野生型（WT）或突變型（MUT）MALAT1的pGL3質粒同miR-218模擬物或對照序列進行共轉染48 h，雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 卵巢癌細胞中 MALAT1、miR-218的表達

結果顯示，與人正常卵巢上皮細胞系HOSE比較，卵巢癌OVCAR3細胞中MALAT1表達升高（P<0.05），miR-218表達下降（P<0.05），見圖1。

圖1 MALAT1、miR-218在卵巢癌細胞中的表達Fig.1 Expression of MALAT1 and miR-218 in ovarian cancer cells

2.2 抑制lncRNA MALAT1對OVCAR3細胞增殖、侵襲及凋亡的影響

實時PCR檢測轉染效率結果顯示，與si-NC組比較，si-MALAT1組細胞中MALAT1的表達明顯下降（P<0.05，圖2A），表明轉染成功。

圖2 si-MALAT1對OVCAR3細胞增殖、侵襲以及凋亡的影響Fig.2 Effects of si-MALAT1 on the proliferation，invasion，and apoptosis of OVCAR3 cells

結果顯示，與si-NC組比較，si-MALAT1組卵巢癌細胞的增殖能力顯著抑制（P<0.05，圖2B），侵襲能力顯著下降（P<0.05，圖2C），凋亡率顯著升高（P<0.05，圖2D），說明沉默MALAT1可以抑制OVCAR3細胞的增殖和侵襲，促進細胞的凋亡。

2.3 lncRNA MALAT1靶向調控miR-218表達的驗證

使用生物信息學軟件miRanda預測MALAT1與miR-218的靶向關系，結果顯示miR-218可以靶向結合MALAT1，見圖3A。實時PCR檢測結果顯示，干擾MALAT1表達后卵巢癌OVCAR3細胞中miR-218的表達增加（P<0.05，圖3B）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與MALAT1-WT/miR-NC組比較，MALAT1-WT/miR-218 mimics組細胞熒光素酶活性明顯降低（P<0.05，圖3C），提示MALAT可負調控miR-218的表達。

圖3 lncRNA MALAT1靶向調控 miR-218的表達Fig.3 lncRNA MALAT1 regulates the expression of miR-218

2.4 抑制miR-218的表達逆轉了抑制MALAT1表達對OVCAR3細胞增殖、侵襲及凋亡的作用

結果顯示，與si-MALAT1組比較，si-MALAT1+miR-218抑制劑組OVCAR3細胞中miR-218的表達水平降低（P<0.05，圖4A）；細胞增殖和侵襲能力升高，凋亡率降低（均P<0.05，圖4B～4D）。提示抑制miR-218的表達逆轉了抑制MALAT1表達對OVCAR3細胞增殖、侵襲及凋亡的作用。

圖4 抑制miR-218的表達逆轉了抑制MALAT1表達對OVCAR3細胞增殖、侵襲及凋亡的作用Fig.4 Reversed inhibition of MALAT1 expression on the proliferation，invasion，and apoptosis of OVCAR3 cells owing to interference by miR-218 expression

Western blotting檢測結果顯示，與si-NC組（1.00±0.00）比較，si-MALAT1組（0.15±0.02）細胞中Runx2蛋白表達降低；與si-MALAT1組比較，si-MALAT1+miR-218抑制劑組（0.67±0.06）細胞中Runx2蛋白的表達升高（P<0.05，圖5）。

圖5 應用Western blotting檢測Runx2蛋白表達Fig.5 Runx2 protein expression detected by Western blotting

3 討論

研究［12-13］顯示，lncRNA在癌癥發(fā)生中發(fā)揮調節(jié)作用，一些lncRNA可以作為卵巢癌的分子標志物和治療靶點。lncRNA MALAT1可調節(jié)多種腫瘤的遷移和增殖［14-16］。有研究［17-18］顯示，MALAT1在人卵巢惡性腫瘤組織和細胞中的表達分別高于正常卵巢組織和非腫瘤性人卵巢表面上皮細胞，其表達量與生存期密切相關，說明MALAT1發(fā)揮癌基因的作用，調節(jié)細胞增殖、遷移和凋亡。本研究應用實時PCR檢測MALAT1和miR-218在人卵巢癌細胞系和正常人卵巢上皮細胞系中的表達，發(fā)現與人正常卵巢上皮細胞系比較，在卵巢癌OVCAR3細胞中MALAT1表達升高（P<0.05），miR-218表達下降（P<0.05），與以往研究結果一致，提示MALAT1在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用。本研究將MALAT1干擾序列轉染卵巢癌細胞，通過細胞增殖實驗、流式細胞術和Transwell實驗檢測細胞增殖、凋亡和侵襲能力。結果顯示，干擾MALAT1可以抑制卵巢癌OVCAR3細胞的增殖和侵襲，促進OVCAR3細胞凋亡。

研究［19-20］顯示，MALAT1可以靶向海綿吸附眾多目標微RNA，調控下游靶基因表達，從而影響卵巢癌的增殖和凋亡等生物學行為。卵巢癌中miR-218可以通過調節(jié)靶基因Runx2、Wnt2B抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移［21-22］，在卵巢癌細胞中過表達miR-218可以抑制細胞增殖并促進細胞凋亡［23］。Runx2是多瘤病毒增強子結合蛋白2/核心結合因子轉錄因子家族的成員之一，在成骨過程及眾多腫瘤（乳腺癌、前列腺癌及甲狀腺癌等）的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。卵巢癌中Runx2表達升高，其高表達與腫瘤臨床分級、患者生存期密切相關，抑制卵巢癌中Runx2的表達可以抑制卵巢癌的增殖、侵襲和遷徙，促進卵巢癌細胞凋亡［24-26］。

本研究將MALAT1干擾序列與miR-218抑制物和對照序列分別共轉染卵巢癌細胞系OVCAR3，結果發(fā)現與轉染MALAT1干擾序列細胞比較，同時轉染miR-218干擾序列細胞的增殖和侵襲能力增強，細胞凋亡受到抑制，提示同時轉染miR-218干擾序列可以逆轉干擾MALAT1對卵巢癌細胞生物學行為的影響。進一步生物信息學網站分析及雙熒光素酶報告基因實驗研究結果顯示，MALAT1和miR-218存在靶向關系。實時PCR和Western blotting檢測結果表明MALAT1可以海綿吸附miR-218，轉染si-MALAT1可以增加卵巢癌細胞中miR-218的表達，同時抑制Runx2的表達。

綜上所述，lncRNA MALAT1在卵巢癌細胞中高表達，抑制MALAT1表達能夠制卵巢癌OVCAR3細胞的增殖和侵襲，并促進OVCAR3細胞凋亡，其機制可能與通過miR-218調控Runx2蛋白表達有關。本研究為卵巢癌的研究提供了新的方向，但其他下游靶基因及相關通路以及裸鼠荷瘤動物實驗尚未完成，因此須在未來研究中進一步論證。