戴文濤,武 瑞,張亞南,侯欣宇,彭代銀,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012;3.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 合肥 230012)

桃紅四物湯(Taohong Siwu Decoction,THSWD)出自清代吳謙等所著的《醫(yī)宗金鑒》,全方由桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎6味藥組成。桃仁、紅花是辛潤通絡(luò)藥,熟地黃為補(bǔ)血要藥,當(dāng)歸補(bǔ)血活血,川芎活血行氣,白芍養(yǎng)血益陰。四物湯四味藥配伍桃仁、紅花使用,共奏活血化瘀、祛瘀生新的功效。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明,THSWD對腦缺血疾病損傷有顯著的治療作用。課題組前期研究[1-5]發(fā)現(xiàn),THSWD具有增強(qiáng)腦缺血再灌注大鼠的抗氧化能力,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腦內(nèi)缺血區(qū)的血管新生,改善腦損傷等多種效應(yīng)。THSWD的成分復(fù)雜,藥物靶點(diǎn)眾多,體內(nèi)過程尚缺乏研究。體內(nèi)過程是藥物發(fā)揮療效的基礎(chǔ),腦卒中的病位雖在于腦,但其病機(jī)是多個臟腑相互影響的結(jié)果,因此對組織分布的研究有助于闡明其物質(zhì)作用基礎(chǔ)與方劑組方原理[6-7]。課題組前期分析了THSWD入血和入腦的原型成分和代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)黃酮類、芳香有機(jī)酸類和揮發(fā)油類等化合物可能是THSWD治療腦卒中的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[8],藁本內(nèi)酯、苦杏仁苷、芍藥苷、羥基紅花黃色素A、阿魏酸等主要活性成分均可在血中被檢出[9]。

本實(shí)驗(yàn)基于大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,建立UPLC-MS分析方法,檢測THSWD中5種主要活性成分在MCAO模型大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織的分布特征,為進(jìn)一步明確THSWD的作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 桃仁為薔薇科植物桃(Prunuspersica(L.)Batsch)或山桃(Prunusdavidiana(Carr.)Franch.)的干燥成熟的種子(批號 100152),紅花為菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花(批號 170025),川芎為傘形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根莖(批號 17010335),熟地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的干燥塊根(批號 250092),當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根(批號 161108),白芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根(批號 1711014),以上藥材均購自安徽省亳州市滬譙藥業(yè)有限公司,并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室鑒定,符合2020年版《中華人民共和國藥典》一部相關(guān)規(guī)定。

1.2 儀器 ExionLC AD超高效液相色譜儀:日本Shimadzu;ABSciex QTRAP 5500三重四極桿-線性離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國SCIEX;AB135-S型十萬分之一電子分析天平:德國METTLER TOLEDO公司;CP2250分析天平:上海越平科學(xué)儀器有限公司;TG16-WS臺式高速離心機(jī):長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Cascada Ⅲ超純水儀:美國PALL公司;T18 ΜLTRA-TURRAX組織勻漿機(jī):德國IKA公司;MTN-2800D型氮吹儀:天津金貝爾科技有限公司。

1.3 試劑 芍藥苷、苦杏仁苷、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、羥基紅花黃色素A均購于成都德思特生物技術(shù)有限公司,批號分別為DSTDS007001、DST200710-004、DSTDH000702、DST210901-081、DSTDQ001703;其他試劑均為分析純。

1.4 動物 60只SPF級健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量(220±20)g,購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(魯)2019-0006]。飼養(yǎng)室溫度為(25±2)℃,相對濕度為40%～65%,通風(fēng)良好,所有大鼠均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行喂養(yǎng),自由飲水。

2 方法

2.1 THSWD乙醇提取物的制備 各藥材按《方劑學(xué)》教材中復(fù)方配伍比例,即m(熟地黃)∶m(當(dāng)歸)∶m(白芍)∶m(川芎)∶m(桃仁)∶m(紅花)=4∶3∶3∶2∶3∶2,加入75%乙醇回流提取2 h(乙醇加入量為所加藥物質(zhì)量總和的10倍量),過濾,收集濾液,濾渣加入75%乙醇回流提取2 h(乙醇加入量為所加藥物質(zhì)量總和的8倍量),過濾,將2次濾液合并,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮制成生藥含量50 g/kg的濃縮液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 腦缺血再灌注大鼠模型的建立 取60只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn),大鼠于模型建立前一晚禁食,參照線栓法[10]構(gòu)建MCAO模型,再灌注24 h后,參照Zea Longa評分法[10],對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分,驗(yàn)證模型是否成功。

2.3 動物分組、給藥與組織樣品采集 取腦缺血再灌注大鼠模型建立3 d后的大鼠36只,分為6組,每組6只,單次給藥THSWD(36 g/kg),給藥容積按10 mL/kg,給藥前12 h禁食不禁水,于給藥后0.5、1、2、4、8、12 h 6個時間點(diǎn)進(jìn)行腹主動脈取血,然后分批取出組織(心、肝、脾、肺、腎、腦),將組織放入生理鹽水中洗去血液,再置于干凈濾紙上吸干水分,放入塑封袋中,于-80 ℃冰箱冷凍保存。

2.4 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC CSHTM C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm),流速0.2 mL/min,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量為2 μL,進(jìn)樣時間24 min,流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脫:0～5 min,90%～83% A;5～15 min,83%～75% A;15～18 min,75%～58% A;18～20 min,58%～30% A;20～24 min,30%～10% A。

2.5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源(electrospray ionization,ESI),正、負(fù)離子模式同時掃描;噴霧電壓5 500 V;離子化溫度550 ℃;Gas為241.3 kPa,Gas 1為379.2 kPa,Gas 2 為379.2 kPa。另外對碰撞電壓(collision energy,CE)、去簇電壓(declustering potential,DP)以及檢測離子對優(yōu)化處理,優(yōu)化后的條件參數(shù)見表1。

表1 5種成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件

2.6 對照品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱量5種標(biāo)準(zhǔn)品:羥基紅花黃色素A 2.33 mg、苦杏仁苷2.64 mg、芍藥苷2.3 mg、阿魏酸2.45 mg、藁本內(nèi)酯2.20 mg,分別用甲醇溶解在5 mL容量瓶中并定容,用甲醇梯度稀釋至所需濃度。準(zhǔn)確稱取原兒茶酸1.52 mg,用甲醇溶解在5 mL容量瓶中并定容,取內(nèi)標(biāo)儲備液適量,再用甲醇稀釋,得最終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.7 樣品的處理 取大鼠組織樣本200 mg,加入生理鹽水600 μL制成勻漿液,置于5 mL EP管中。加入800 μL的甲醇和50 μL內(nèi)標(biāo)進(jìn)行萃取,振蕩5 min后,3 000 r/min離心5 min,吸取上層萃取液置于2 mL EP管中,置于通風(fēng)櫥中氮?dú)獯蹈?。?00 μL甲醇溶解殘留物,混勻后以15 000 r/min離心10 min,0.22 μm膜過濾器過濾準(zhǔn)備進(jìn)樣。

2.8 質(zhì)控樣品的制備 取空白組織按“2.6”項(xiàng)下操作,制備含羥基紅花黃色素A、苦杏仁苷、芍藥苷、阿魏酸、藁本內(nèi)酯的低濃度(0.2、0.05、0.5、0.1、0.05 μg/g)、中濃度(5、5、10、5、5 μg/g)、高濃度(10.0、10.0、40.0、10.0、10.0 μg/g)質(zhì)量控制(quality control,QC)樣品用于組織分布研究。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性 取空白肝組織樣品,加有混標(biāo)溶液的空白肝組織樣品,以及灌胃THSWD后的肝組織樣品,按照“2.6”項(xiàng)下生物樣品處理方法處理后,按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明該方法專屬性良好,空白組織中的內(nèi)源性成分不干擾待測成分的檢測。見圖1。

注:A.空白組織;B.空白組織加對照品;C.實(shí)測樣品;1.苦杏仁苷;2.芍藥苷;3.羥基紅花黃色素A;4.阿魏酸;5.藁本內(nèi)酯;6.原兒茶酸圖1 5種成分和內(nèi)標(biāo)的專屬性色譜圖

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 取空白組織樣品,按照“2.6”項(xiàng)下方法處理,加入8個不同濃度的混標(biāo)溶液,最后每個濃度樣品平行進(jìn)樣6次。以各分析物的溶液濃度為橫坐標(biāo)(x),分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性回歸,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,5種成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,滿足體內(nèi)藥物分析方法的要求。見表2。

表2 組織中5種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量下限和線性范圍

3.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 取空白組織樣品按“2.6”項(xiàng)下方法處理,制備高、中、低3個不同濃度的QC樣品各6份,在同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次計(jì)算日內(nèi)精密度,連續(xù)測定3 d計(jì)算日間精密度。見表3。結(jié)果表明,5種成分在各組織中的準(zhǔn)確度和精密度均小于15%,符合生物樣品測試要求。

表3 組織中5種成分的精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

3.1.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取空白組織樣品,加入高、中、低3個濃度的混標(biāo)溶液,按“2.6”項(xiàng)下方法處理,進(jìn)樣分析得到各分析物的色譜峰面積A;另取空白組織樣品按“2.6”項(xiàng)下方法處理后,加入與上述濃度相同的混標(biāo)溶液,同法操作得到各分析物的色譜峰面積B;再取與上述濃度相同的混標(biāo)溶液直接進(jìn)樣分析,得到各分析物的色譜峰面積C。以“A/B×100%”計(jì)算回收率,以“B/C×100%”計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。見表3。結(jié)果顯示,5種成分在各組織中的提取回收率為83.68%～104.67%,RSD均小于15%,基質(zhì)效應(yīng)為82.40%～103.59%,RSD均小于15%,符合生物樣品測試要求。

3.1.5 穩(wěn)定性 取大鼠空白組織按“2.6”項(xiàng)下方法處理,配置高、中、低3個濃度的6個重復(fù)QC樣品,考察在室溫放置12 h、-20 ℃冰箱放置1個月、凍融3次條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,各樣品在3種條件下RSD值均小于15%,符合生物樣品測定要求。見表4。

表4 組織中5種成分的穩(wěn)定性(n=6)

3.2 組織分布結(jié)果 大鼠灌胃THSWD后,被測成分在MCAO模型組大鼠體內(nèi)不同時間點(diǎn)各組織中的濃度見圖2。結(jié)果顯示,各成分在組織中0.5 h或1 h左右快速達(dá)到最高濃度。藁本內(nèi)酯在各組織中均有分布,存在時間長,肝、腎組織中濃度較高,腦中也有較高分布。阿魏酸在腎組織中濃度最高,肝組織次之,脾、肺、心組織中濃度較低,存在時間短,腦組織中未見分布?？嘈尤受赵诜谓M織具有較高分布比例,腎組織中濃度最高,心、肝、脾組織濃度較低,腦組織中可見分布。芍藥苷在肝、脾、肺組織濃度較高,腎組織中濃度最高,心、腦組織中濃度較低,腦組織中可見分布。羥基紅花黃色素A在肝、脾、肺組織濃度較高,腎組織中濃度最高,心組織1 h后未見分布,腦組織中可見分布。

圖2 5種主要成分的組織分布特征

4 討論

本研究結(jié)果表明,經(jīng)灌胃給藥后各成分可快速吸收并分布至組織內(nèi),在給藥12 h后多數(shù)組織中的成分基本代謝完全。

藁本內(nèi)酯是川芎和當(dāng)歸主要的揮發(fā)油成分,分子量小,穿透力強(qiáng),能通過血腦屏障,在體內(nèi)分布廣泛,肝臟是其主要的代謝器官,腦組織中有較高分布,具有抗氧化、抗炎、降低血腦屏障通透性等多種藥理活性,是THSWD治療缺血性腦卒中的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究[11]表明,藁本內(nèi)酯通過下調(diào)大鼠水通道蛋白4以及緊密連接蛋白Claudin-5和Zo-1的表達(dá)水平,降低血腦屏障通透性,發(fā)揮治療腦缺血的功效。藁本內(nèi)酯還可以通過激活PI3K/Akt信號通路、抑制Akt/Fox01通路減少氧化應(yīng)激反應(yīng),減少腦梗死體積,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。研究表明藁本內(nèi)酯可能透過血腦屏障,發(fā)揮對腦缺血的治療作用。

阿魏酸是川芎和當(dāng)歸活血祛瘀生新的主要活性成分,具有很強(qiáng)的抗氧化活性和抗血栓作用,可用于治療心腦血管疾病,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞損傷等[13]。腎臟是其主要的代謝器官,在除肝、腎的組織中分布較少,存在時間短,且難以透過血腦屏障,說明阿魏酸在體內(nèi)吸收、分布、消除快,起效迅速。

羥基紅花黃色素A和苦杏仁苷是桃仁、紅花發(fā)揮活血化瘀功效的主要活性成分,在各組織中均有分布,其中肝、腎、肺組織中濃度較高,說明其對血流豐富的組織具有親和性。其發(fā)揮藥理作用的機(jī)制涉及抗氧化、抗血栓、保護(hù)心腦血管等[14]。其中苦杏仁苷在肺部濃度較高,可能與桃仁鎮(zhèn)咳平喘的藥理作用有關(guān)[15]。

白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛,其主要活性成分芍藥苷在體內(nèi)分布廣泛,在各組織中濃度均較高,其中肝、脾、肺組織中濃度最高,可能與白芍養(yǎng)血益陰柔肝的功效有關(guān),有藥理研究[16]表明,芍藥苷可以調(diào)節(jié)血虛肝郁模型大鼠的信號傳導(dǎo),通過抗炎,防止血小板凝聚、自由基損傷等途徑發(fā)揮柔肝解郁的作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腦卒中是由于肝風(fēng)內(nèi)動、肝陰虛所致,腦卒中的發(fā)生與肝密切相關(guān),然而這種效應(yīng)機(jī)制是否與腦缺血的治療有關(guān)仍需要進(jìn)一步研究。

本研究首次建立了UPLC-MS同時測定THSWD中5種主要成分在大鼠組織中的含量分析方法,并研究了口服THSWD后,5種主要成分在腦缺血再灌注模型大鼠心、肝、脾、肺、腎、腦組織中的分布情況,5種成分在體內(nèi)吸收迅速,在不同時間點(diǎn)的器官的分布趨勢存在較大差異。