劉敏潔,黃 琪,2,吳德玲,2,趙宏蘇,金傳山,2,許鳳清,2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230012;2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地, 安徽 合肥 230038)

蒲黃(PollenTyphae)為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.、東方香蒲TyphaorientalisPresl或同屬植物的干燥花粉,具有止血、化瘀、通淋之功效[1]。蒲黃中主要化學(xué)成分有黃酮類、甾醇類、烷烴類、有機(jī)酸類等,具有止血、抗血栓形成、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[2-4]。蒲黃炭(PollenTyphaeCarbonisata)是中醫(yī)臨床常用品種,由蒲黃按炒炭法炒制成棕褐色或黑褐色。蒲黃因質(zhì)地疏松,炒炭過程中受溫度、投料量、翻炒頻率及炒制時(shí)間等因素的影響,難以把握其準(zhǔn)確的炮制程度,容易造成飲片炮制“不及”或“太過”,影響藥材質(zhì)量及臨床療效。隨著色差儀在中藥領(lǐng)域質(zhì)量控制中的應(yīng)用[5-8],Ren等[9]用其成功區(qū)分干燥箱制備的3種不同程度的蒲黃炭。目前,關(guān)于傳統(tǒng)炮制工藝炮制的蒲黃炭及其整個(gè)炒炭過程中飲片顏色和成分含量變化的關(guān)聯(lián)性未見報(bào)道。本研究采用傳統(tǒng)炮制工藝制備蒲黃炭,測(cè)定不同炮制程度蒲黃炭有效成分含量及色度值,結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法,對(duì)蒲黃炭炮制過程中外觀顏色與內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行相關(guān)性分析,為蒲黃炭的炮制識(shí)別模式提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 SHIMADZU-LC-2030C高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20AC,二極管陣列檢測(cè)器SPD-20AV,柱溫箱CTO-20AC,色譜工作站):日本島津公司;Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm):美國安捷倫科技有限公司;KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器:江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;十萬分之一電子天平(AB135-S):瑞士梅特勒-托利多公司;色差儀(IRIS VA400視覺分析儀):法國ALPHA M.O.S公司。

香蒲新苷對(duì)照品(批號(hào) MUST-20081902,純度 99.42%)、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品(批號(hào) MUST-20082104,純度 99.45%):四川省成都曼思特生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純):上海躍勝貿(mào)易有限公司;冰醋酸(分析純):上海阿拉丁生化科技有限公司;超純水:浙江娃哈哈宏振飲用水有限公司。

1.2 藥材 9批蒲黃藥材來源信息見表1,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山副教授鑒定為香蒲科植物水燭香蒲TyphaangustifoliaL.的干燥花粉。

表1 蒲黃基本信息表

2 方法

2.1 蒲黃藥材指紋圖譜的建立

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取生蒲黃0.5 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲(功率250 W,頻率40 kHz)提取30 min,放冷,再稱質(zhì)量,以提取溶劑補(bǔ)足所減失的質(zhì)量,過濾,濾液過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取香蒲新苷對(duì)照品、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對(duì)照品適量,精密稱定,置10 mL容量瓶中加入70%甲醇,溶解,定容至刻度線,制成每毫升含有香蒲新苷0.259 mg、異鼠李素-3-O-新橙皮苷0.263 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);檢測(cè)波長:254 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;流速:1.0 mL/min;以0.2%冰醋酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0～5 min,5%～10% B;5～15 min,10%～14% B;15～35 min,14% B;35～40 min,14%～20% B;40～55 min,20%～24% B;55～60 min,24%～35% B;60～65 min,35%～40% B;65～67 min,40%～5% B)。

2.1.4 蒲黃藥材指紋圖譜的建立 取9批蒲黃藥材,按照“2.1.1”中方法制備成供試品溶液,按照“2.1.3”中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。將所測(cè)得的色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”,對(duì)蒲黃藥材進(jìn)行色譜峰匹配,以中位數(shù)矢量法生成對(duì)照?qǐng)D譜(R),并計(jì)算與對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度。

2.2 蒲黃中有效成分含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液依次稀釋,制成含香蒲新苷259 μg/mL→4.05 μg/mL,異鼠李素-3-O-新橙皮苷263 μg/mL→4.11 μg/mL等7個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液。精密吸取20 μL,依法測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。依據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》,進(jìn)行精密度(對(duì)照品混合溶液)、穩(wěn)定性(S4)、重復(fù)性(S4)和準(zhǔn)確度(S4)試驗(yàn)。

2.2.2 含量測(cè)定 取9批不同批次的蒲黃藥材適量,依照上述“2.1.1”中方法制備成供試品溶液,按照上述“2.1.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2.3 顏色測(cè)定

2.3.1 不同程度蒲黃炭飲片樣品的制備 取蒲黃藥材9批(編號(hào)S1—S9),按照2020年版《中華人民共和國藥典》(通則0213)中炒炭法[1]制備蒲黃炭,炮制過程中,通過測(cè)溫槍測(cè)得鍋中溫度為160～200 ℃時(shí),取蒲黃藥材至熱鍋內(nèi),每隔65 s 取樣1次,分別制成不同程度蒲黃炭。在此炮制過程中,取樣編號(hào)記作TP(代表生蒲黃)和TPC1—TPC6(分別代表6種炮制程度的蒲黃炭),備用。見圖1。

圖1 生蒲黃(TP)和不同炮制程度蒲黃炭(TPC1—TPC6)飲片

2.3.2 色彩分析儀參數(shù)設(shè)置 開啟IRIS VA400型視覺分析儀,開始預(yù)熱,待指示燈顯示綠燈時(shí),表示預(yù)熱結(jié)束且系統(tǒng)穩(wěn)定,再對(duì)儀器鏡頭的曝光度和焦距進(jìn)行校準(zhǔn),并使用標(biāo)準(zhǔn)比色板對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)完成后將照明模式設(shè)置為頂部照明,拍照模式為單一快照。

2.3.3 樣品顏色測(cè)定 取蒲黃樣品粉末(過四號(hào)篩)適量,于載玻片上壓制成厚度為1 mm左右的薄片,將載玻片置于儀器白色底板上,變換位置,平行拍照3次,根據(jù)色彩編碼記錄樣品色度空間參數(shù)L、a、b值,并依據(jù)公式Eab=(L2+a2+b2)1/2計(jì)算樣品的平均總色度值Eab值。其中L值反映亮度(黑白),a代表紅綠色相(正數(shù)表示偏紅,負(fù)數(shù)表示偏綠),b值代表黃藍(lán)色相(正數(shù)表示偏黃,負(fù)數(shù)表示偏藍(lán))。

2.3.4 建立顏色判別函數(shù) 將樣本數(shù)據(jù)分為生品、輕炭、標(biāo)炭、重炭4組,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行Kruskal-wallisH檢驗(yàn),對(duì)不同組間顏色差異性進(jìn)行分析,利用判別分析方法建立基于色度空間參數(shù)的數(shù)學(xué)函數(shù)。

2.4 不同炮制程度蒲黃炭含量測(cè)定及相關(guān)性分析

2.4.1 不同炮制程度蒲黃炭兩種成分含量測(cè)定 取生蒲黃及不同炮制程度蒲黃炭樣品,按照“2.1.1”項(xiàng)制備供試品溶液,按上述“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件,記錄色譜峰面積,計(jì)算香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量。

2.4.2 顏色與有效成分含量相關(guān)性分析 將蒲黃中有效成分香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量與色度值L、a、b、Eab相關(guān)聯(lián),使用SPSS 23.0軟件作相關(guān)性分析。

3 結(jié)果

3.1 蒲黃藥材指紋圖譜分析 測(cè)得9批蒲黃藥材指紋圖譜(見圖2),相似度結(jié)果見表1。對(duì)照品指紋圖譜見圖3。通過比較各色譜峰的保留時(shí)間,確定指紋圖譜中香蒲新苷(10號(hào)峰)和異鼠李素-3-O新橙皮苷(12號(hào)峰)的位置。其中10號(hào)峰色譜響應(yīng)值較高,保留時(shí)間適中,故選擇10號(hào)峰為參照峰。按照相關(guān)方法進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果顯示,精密度試驗(yàn)中,17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.15%,各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為0.02%～2.54%;穩(wěn)定性試驗(yàn)中,共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.26%,各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為0.06%～2.99%;重復(fù)性試驗(yàn)中,測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.17%,各共有峰相對(duì)峰面積的RSD為0.03%～1.14%。結(jié)果表明,所建立的指紋圖譜可用于蒲黃的定性分析。

圖2 9批蒲黃藥材(S1—S9)的高效液相色譜指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜(R)

注:1.香蒲新苷;2.異鼠李素-3-O-新橙皮苷?qǐng)D3 對(duì)照品的高效液相色譜指紋圖譜

3.2 含量測(cè)定 方法學(xué)考察結(jié)果顯示,香蒲新苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1 428 923.5x-69 316.3,線性范圍為0.081～5.180 μg(r=0.999 3);異鼠李素-3-O-新橙皮苷回歸方程為y=1 825 126.9x-102 083.4,線性范圍為0.082～5.260 μg(r=0.999 2)。精密度試驗(yàn)中,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.19%、0.20%(n=6);在穩(wěn)定性試驗(yàn)中,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.23%、0.27%(n=6);在重復(fù)性試驗(yàn)中,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量的RSD值分別為2.09%、2.27%,平均回收率分別為101.50%、98.02%,RSD分別為2.07%、1.62%(n=9)。結(jié)果表明,該方法準(zhǔn)確、可行。9批蒲黃藥材含量測(cè)定結(jié)果見表2。不同炮制程度蒲黃炭中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果(見表3)顯示,隨著炮制時(shí)間的延長,炭品中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì),綜合外觀、性狀將樣品TPC4和TPC5標(biāo)注為標(biāo)炭,TPC1、TPC2、TPC3為輕炭,TPC6因炮制時(shí)間過長,樣品完全炭化,此時(shí)香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的色譜峰未檢測(cè)到,標(biāo)注為重炭。

表2 9批蒲黃藥材中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

表3 9批次不同炮制程度蒲黃炭中香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果

3.3 不同炮制程度蒲黃炭顏色值與成分之間的相關(guān)性

3.3.1 不同炮制程度蒲黃炭色度值比較及其判別函數(shù)的建立 9批次不同炮制程度蒲黃炭的L、a、b、Eab值比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為50.331、15.342、45.087、53.929,均P<0.05),提示不同炮制程度蒲黃炭的顏色有顯著差異。見表4。

表4 不同炮制程度蒲黃炭色度值比較

將數(shù)據(jù)分為生品、輕炭、標(biāo)炭、重炭4類,以類別為組變量,色度值L、a、b、Eab為自變量,并且作為訓(xùn)練集樣本,采用SPSS 23.0軟件建立以L、a、b、Eab值為輸入變量的判別函數(shù)。再將訓(xùn)練樣本回代[10-11],驗(yàn)證判別函數(shù)的準(zhǔn)確性良好。

根據(jù)組平均值的同等檢驗(yàn)結(jié)果可見,L、a、b、Eab值的P值均<0.05,表明在判別函數(shù)中,L、a、b、Eab值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Wilk’s Lambda檢驗(yàn)結(jié)果顯示,3個(gè)典則判別函數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(λ值分別為0.060、0.564、0.898,均P<0.05)。

3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù):

y1=3.149L+1.059a+0.505b-1.728Eab;

y2=10.327L+1.984a+1.257b-9.492Eab;

y3=2.965L-0.318a+0.149b-2.647Eab。

3個(gè)未標(biāo)準(zhǔn)化典則判別函數(shù):

y1=0.384L+0.366a+0.069b-0.212Eab-12.429;

y2=1.260L+0.687a+0.172b-1.167Eab-8.005;

y3=0.362L-0.110a+0.020b-0.326Eab+0.279。

根據(jù)典則判別函數(shù)建立的典則判別函數(shù)圖(見圖4),提示不同炮制程度的蒲黃炭顏色差異較明顯,并且在系數(shù)1上呈現(xiàn)一定的規(guī)律。

注:1.生品;2.輕炭;3.標(biāo)炭;4.重炭圖4 4種炮制程度蒲黃炭的典則判別函數(shù)圖

4個(gè)Fisher線性判別函數(shù):

F生品=9.840L+12.084a+0.190b-5.801Eab-173.454;

F輕炭=11.015L+12.147a+0.293b-7.202Eab-149.928;

F標(biāo)炭=9.904L+11.161a+0.098b-6.705Eab-108.731;

F重炭=6.637L+8.757a-0.413b-4.082Eab-68.201。

將未知樣本的色度值分別代入4個(gè)函數(shù)中進(jìn)行計(jì)算,將樣本判入所得函數(shù)值最大的分組中。

3.4 色度值與有效成分含量相關(guān)性分析 香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量與L、a、b、Eab值均不符合正態(tài)分布,故選擇Spearman相關(guān)分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,結(jié)果見表5。從表5可看出,L值與香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈正相關(guān)(P<0.05),表明在一定程度上,L值越小,亮度越低,蒲黃炒炭程度越高,香蒲新苷含量、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量越低。a值與香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量均無相關(guān)性(P>0.05)。b值與香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈正相關(guān)(P<0.05),表明在一定程度上b值越大,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量越高。Eab值與香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05),表明Eab值越大,香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量較高。

表5 香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量與L、a、b、Eab值的相關(guān)性

4 討論

蒲黃質(zhì)地疏松,炒制過程中易灰化,其炮制程度難以把握,容易造成“不及”或“太過”,從而影響飲片質(zhì)量。本研究基于9批蒲黃藥材,建立蒲黃藥材的高效液相色譜指紋圖譜,9批蒲黃藥材相似度均大于0.98,表明9批蒲黃藥材與對(duì)照?qǐng)D譜具有較好的一致性,飲片批次間差異較小。并對(duì)指標(biāo)性成分香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量進(jìn)行測(cè)定。在此基礎(chǔ)上,取9批蒲黃藥材,分別炮制不同程度蒲黃炭,并且通過對(duì)不同炮制程度蒲黃炭的色度值進(jìn)行測(cè)定和分析,發(fā)現(xiàn)不同炮制程度蒲黃炭的色度值L、a、b、Eab差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著炮制時(shí)間的延長,蒲黃炭飲片色度值L、b、Eab均逐漸減小。將不同炮制程度蒲黃炭的色澤與內(nèi)在成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)色度值L、b、Eab值均與香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量呈顯著正相關(guān),a值與兩種成分含量均無相關(guān)性。以上結(jié)果表明,色度值可作為判斷生蒲黃及蒲黃炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法之一,同時(shí)色度值與指標(biāo)性成分之間具有顯著的相關(guān)性。

顏色是傳統(tǒng)中藥炭藥炮制程度最主要的判別依據(jù),色差計(jì)將顏色數(shù)字化、精準(zhǔn)化,將這一技術(shù)與中藥中指標(biāo)性成分分析技術(shù)相結(jié)合,建立判別函數(shù)并對(duì)成分與色度進(jìn)行相關(guān)性分析,最終形成中藥炭藥炮制適中的識(shí)別模式,為中藥炭藥進(jìn)行精確客觀的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。