趙 研,甘芮溪,張小月,程曉昱,葛 嵐,彭代銀,王紅松,陳衛(wèi)東,3,4,5

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012; 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230031;3.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 合肥 230012;4.中藥飲片制造新技術(shù)與研發(fā)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;5.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

心肌纖維化是心功能障礙時心臟自身的代償反應(yīng),是許多心臟疾病終末期的共同病理生理機制[1]。纖維化的特點是成纖維細(xì)胞過度繁殖,導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積增加,雖然輕度的纖維化對心臟起到一定的保護作用,但是過度增殖和沉積會使心臟擴展下降,心臟的舒張活動降低,心肌僵硬,最終導(dǎo)致患者心律失?；蛐牧λソ遊2]。目前,還沒有治療心肌纖維化的最佳治療方案,如果能夠早發(fā)現(xiàn)、早對癥治療,可能會極大提高患者的生命安全。

二參真武湯是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)合多年臨床用藥經(jīng)驗[3],基于《傷寒論》真武湯增加紅參、丹參組成的中藥復(fù)方。二參真武湯能顯著改善心腎陽虛型慢性心力衰竭患者心功能,降低醛固酮、活性氧、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)水平[4]。二參真武湯也可抑制免疫炎癥反應(yīng),抑制心肌細(xì)胞凋亡,保護心肌細(xì)胞,改善慢性心力衰竭患者心肌纖維化[5]。但是,其治療心肌纖維化的作用機制仍不清楚。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是一種常見的細(xì)胞信號通路,參與哺乳動物多種病理生理過程,并參與細(xì)胞周期和細(xì)胞生長的過程。有研究表明,硫化氫通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路,增加細(xì)胞自噬而減輕阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化[6],芪參益氣丸通過PI3K/AKT/mTOR通路激活自噬而減輕心肌纖維化[7],姜辣素通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制細(xì)胞凋亡和自噬從而改善心肌纖維化[8]。PI3K/AKT/mTOR信號通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、凋亡、生長及心肌收縮甚至相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄等參與調(diào)控心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展和病理形成,通過調(diào)節(jié)自噬減輕心肌纖維化,在心血管疾病的發(fā)病機制中具有重要的作用。基于上述原因,本實驗將PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白及其mRNA作為心肌纖維化的特異性指標(biāo),采用原代心肌成纖維細(xì)胞進行實驗研究,以二參真武湯含藥血清進行干預(yù),并以貝那普利作為陽性對照,探究二參真武湯治療心肌纖維化的機制。

1 材料

1.1 試劑 附子、紅參、茯苓、白術(shù)、白芍、丹參購于安徽普仁公司,生姜自制,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定可用。貝那普利(批號 H200533390):中國成都地奧制藥集團有限公司;膠原蛋白(Collagen,Col)-Ⅰ(批號 ED-30514)、Col-Ⅲ(批號 ED-30513):中國廈門侖昌碩公司;GAPDH(批號 A01020)、山羊抗兔IgG(批號 BS13278)、山羊抗鼠IgG(批號 A21010):美國Abbkin;α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)(批號 ab283851)、PI3K/AKT/mTOR(批號 ab283852):美國Abcam公司;TRIzol(批號 15596-026):美國Invitrogen;SYBR PreMix Ex TaqTMⅡ試劑盒(批號 201):日本Takara;DMEM高糖培養(yǎng)基(批號 11995040):美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 儀器 全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum):賽默飛公司;高速冷凍離心機(Centrifuge 5810R):上海天美有限公司;倒置光學(xué)顯微鏡(DMI6000B):麥克奧迪;超靈敏多功能成像儀(Amersham Image 600):美國GE;qRT-PCR儀(MX3000P):美國安捷倫。

1.3 動物 將大鼠置于溫度(20±2)℃、相對濕度(50±5)%的環(huán)境中飼養(yǎng)1周。本實驗所用動物由河南省鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場[生產(chǎn)許可證號為SCXK(豫)2019-0002]提供。實驗程序按照《實驗動物護理和使用指南》進行,并獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批文編號:AHUCM-rats-2021032)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 按照文獻[4]制備含藥血清。采用水提回流法提取二參真武湯(丹參30 g,白芍、焦白術(shù)、茯苓各10 g,生姜、紅參各6 g,制附子5 g),加入10倍量去離子水,制附子武火先煎0.5 h,文火煎1 h,再加入其他6味藥共煎0.5 h,過濾,濾渣再加8倍量去離子水,煎煮0.5 h,沉降過濾后,將每次煮出的藥液合并,濃縮后備用。

將18只SPF大鼠平均分為3組:空白血清組(生理鹽水10 mL/kg),二參真武湯含藥血清組(二參真武湯15.84 g/kg),貝那普利組(貝那普利0.5 mg/kg),灌胃給藥,每日1次,共7 d,最后1次灌胃后1 h取血,室溫放置30 min后,4 ℃離心,取血清,56 ℃水浴鍋滅菌,過0.45 μm濾頭除菌,備用。

2.2 原代心肌成纖維細(xì)胞的提取 按照文獻[9]方法提取原代心肌成纖維細(xì)胞。在無菌房內(nèi),取出乳鼠心臟剪碎,加入0.1%膠原酶Ⅱ,放置在4 ℃冰箱靜置4 h,取上清鋪板,放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置,等待貼壁,1 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)皿,顯微鏡下觀察貼壁情況,貼壁細(xì)胞即為心臟成纖維細(xì)胞,后續(xù)實驗使用2～4代細(xì)胞。

2.3 免疫熒光檢測波形蛋白(Vimentin) 將第3次傳代的細(xì)胞以每孔1.2×104接種至裝有細(xì)胞爬片的6孔板上,用多聚甲醛固定。滴加一抗波形蛋白(Vimentin),4 ℃過夜,取出,在室溫下等待30 min,洗片后二抗孵育3 min,PBS洗片5 min,使用透明指甲油封片,熒光顯微鏡觀察拍照,使用美國國立衛(wèi)生研究院Image J軟件(版本號1.6.0)進行免疫熒光分析,得到抗體陽性面積。

2.4 臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞成活率 將原代心肌成纖維細(xì)胞消化,制備成2×105的細(xì)胞懸液,在9 mL細(xì)胞懸液中滴加1 mL 0.4%臺盼藍(lán)溶液,在3～5 min內(nèi)使用顯微鏡觀察計數(shù),帶有藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞,將圖片中死細(xì)胞和總細(xì)胞進行計數(shù)。細(xì)胞成活率=(總細(xì)胞數(shù)量-死細(xì)胞數(shù)量)/總細(xì)胞數(shù)量×100%。

2.5 細(xì)胞活力檢測 將原代心肌成纖維細(xì)胞置于96孔板中(每孔1×104個,100 μL),在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)24 h,用CCK-8法檢測細(xì)胞活力,根據(jù)結(jié)果選擇最佳的含藥血清濃度。首先加入含有0、2.5%、5%、10%、15%、20%含藥血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,加入CCK-8試劑,每孔加10 μL,等待反應(yīng)1 h后在酶標(biāo)儀450 nm下測定吸光度。用CCK-8法檢測細(xì)胞活力,根據(jù)細(xì)胞活力優(yōu)選復(fù)制心肌纖維化模型所使用的AngⅡ濃度和作用時間,加入含有不同濃度(0.1、1、10 μmol/L)的Ang Ⅱ培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)胞12、24、48 h,每孔加10 μL CCK-8試劑,反應(yīng)1 h后在酶標(biāo)儀450 nm下測定吸光度。

2.6 分組與給藥 將原代心肌成纖維細(xì)胞分為正常組(加入含有10%空白血清的培養(yǎng)基)、模型組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后加入含有10%空白血清的培養(yǎng)基)、二參真武湯組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后加入含有10%二參真武湯含藥血清的培養(yǎng)基)、貝那普利組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后,加入含有10%貝那普利含藥血清的培養(yǎng)基)。

2.7 ELISA檢測Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量 將原代心肌成纖維細(xì)胞以1×106/mL的密度接種在6孔板上,加入10%含有不同含藥血清的培養(yǎng)基刺激24 h后,取細(xì)胞上清液,根據(jù)ELASA試劑盒說明書檢測Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量。

2.8 Western blot法檢測α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)水平 將原代心肌成纖維細(xì)胞以1×106/mL的密度接種在6孔板上,使用1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后分為4組,加入10%含有不同含藥血清的培養(yǎng)基刺激24 h后,配置含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液,提取細(xì)胞蛋白,每個培養(yǎng)皿加入1 mL配置好的裂解液,等待30 min后,吸出混合液,離心,取上清,上清液以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液,將混合液體樣品煮沸12 min,蛋白定量以后進行電泳,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,放在一抗中過夜,二抗孵育2 h后曝光出現(xiàn)條帶,使用Image J進行蛋白定量。

2.9 qRT-PCR法檢測α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)水平 將原代心肌成纖維細(xì)胞以每毫升1×106個的密度接種于6孔板上,使用1 μmol/L AngⅡ刺激24 h后分為4組,加入10%含有不同含藥血清的培養(yǎng)基刺激24 h后,在培養(yǎng)皿中加入1 mL Trizol,提取細(xì)胞中總RNA,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用Master Mix試劑盒進行檢測。將3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作對照。引物序列見表1。

表1 RT-PCR基因引物信息

3 結(jié)果

3.1 原代心肌成纖維細(xì)胞的鑒定與模型復(fù)制 免疫熒光檢測原代心肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Vimentin,結(jié)果顯示Vimentin單抗染色陽性大于95%(見圖1)。臺盼藍(lán)染色檢測原代心肌成纖維細(xì)胞的存活率,根據(jù)計數(shù)得知細(xì)胞存活率在98%以上(見圖2)。分別采用含有0.1、1、10 μmol/L的AngⅡ培養(yǎng)基刺激細(xì)胞12、24、48 h,結(jié)果顯示1 μmol/L AngⅡ刺激細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力最強(P<0.05)(見圖3)。采用Western blot法檢測纖維化標(biāo)志物α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平(見圖4),結(jié)果顯示模型組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h組)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組(0 μmol/L AngⅡ刺激24 h組)(P<0.05),說明心肌細(xì)胞纖維化模型復(fù)制成功。

注:A.被DAPI染色的細(xì)胞核;B.被Vi-mentin染色的細(xì)胞質(zhì);C.同時被DAPI和Vi-mentin染色的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)圖1 原代心肌成纖維細(xì)胞純度(免疫熒光染色,10×20倍)

圖2 原代心肌成纖維細(xì)胞成活率(臺盼藍(lán)染色,10×20倍)

注:與0 μmol/L AngⅡ組比較,*P<0.05;與1 μmol/L AngⅡ刺激0 h組比較,#P<0.05圖3 不同濃度AngⅡ刺激24 h(A)和1 μmol/L AngⅡ刺激不同時間(B)后原代心肌成纖維蛋白表達(dá)水平比較

注:A.正常組(0 μmol/L AngⅡ刺激24 h);B. 模型組(1 μmol/L AngⅡ刺激24 h);與正常組比較,#P<0.05圖4 原代心肌成纖維細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA細(xì)胞成活率比較

3.2 二參真武湯含藥血清的最佳濃度 隨著二參真武湯含藥血清濃度升高,原代心肌成纖維細(xì)胞活力降低,由于15%和20%二參真武湯含藥血清的抑制作用過強,對原代心肌成纖維細(xì)胞的傷害過大,故選擇10%二參真武湯含藥血清進行后續(xù)實驗。見圖5。

注:與不含二參真武湯含藥血清組比較,#P<0.05圖5 不同劑量二參真武湯含藥血清組原代心肌成纖維細(xì)胞活力比較

3.3 ELISA法檢測的4組原代心肌成纖維細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量比較 模型組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量顯著高于正常組(P<0.05),經(jīng)過10%二參真武湯含藥血清處理后,Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量顯著降低(P<0.05)。見圖6。

注:A.正常組;B.模型組;C.二參真武湯組;D.貝那普利組;與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖6 4組原代心肌成纖維細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量比較

3.4 qRT-PCR檢測的4組原代心肌成纖維細(xì)胞中α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA表達(dá)水平比較 模型組α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA表達(dá)水平顯著高于正常組(P<0.05),經(jīng)過10%二參真武湯含藥血清處理后,α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA顯著降低(P<0.05)。見圖7。

注:A.正常組;B.模型組;C.二參真武湯組;D.貝那普利組;與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖7 4組α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA相對表達(dá)水平比較

3.5 Western blot檢測的4組原代心肌成纖維細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平比較 模型組p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組(P<0.05),經(jīng)過10%二參真武湯含藥血清處理后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖8。

注:A.正常組;B.模型組;C.二參真武湯組;D.貝那普利組;與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖8 4組原代心肌成纖維細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平比較

3.6 qRT-PCR檢測的4組原代成纖維細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)水平比較 模型組PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常組(P<0.05);經(jīng)過10%二參真武湯含藥血清處理后, PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)。見圖9。

注:A.正常組;B.模型組;C.二參真武湯組;D.貝那普利組;與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖9 4組原代成纖維細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

心肌纖維化的主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在心肌中過度沉積,導(dǎo)致α-SMA的過度表達(dá)和膠原的產(chǎn)生,主要為Col-Ⅰ與Col-Ⅲ比值增加[10]。心肌纖維化可使心肌興奮-收縮耦聯(lián)失調(diào),損害收縮和舒張功能,從而加快心臟疾病的進展,導(dǎo)致心力衰竭[11]。心臟病尤其是心力衰竭患者心肌纖維化嚴(yán)重程度與死亡率相關(guān)。本研究使用AngⅡ刺激原代心肌成纖維細(xì)胞建立細(xì)胞模型作為研究對象,結(jié)果表明,二參真武湯可以降低心肌纖維化細(xì)胞的標(biāo)志因子α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)水平,產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是二參真武湯可以減少膠原纖維的產(chǎn)生和沉積,抑制心肌成纖維細(xì)胞激活,減輕心肌纖維化,二參真武湯可以降低心肌纖維化細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá),改善心肌纖維化。

二參真武湯的有效成分含有三七皂苷,丹參酮,芍藥苷,人參皂苷Rg1、Re、Rb1[12]。三七皂苷Rg1可以增加細(xì)胞自噬,減少細(xì)胞增殖,是調(diào)控PI3K/AKT/m TOR信號通路實現(xiàn)的[13]。丹參酮ⅡA可抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,增強自噬,誘發(fā)自噬性死亡[14]。芍藥苷抑制PI3K/AKT信號通路增加細(xì)胞的自噬,減少炎癥因子產(chǎn)生[15]。PI3K/Akt/mTOR通路是細(xì)胞對細(xì)胞外刺激反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞級聯(lián),越來越多的證據(jù)表明,PI3K/Akt/mTOR通路參與細(xì)胞增殖、分化、代謝、細(xì)胞骨架重組和凋亡[16-17]。AngⅡ刺激原代心肌成纖維細(xì)胞,使PI3K增加,激活A(yù)KT,使AKT磷酸化,最后激活mTOR,使原代心肌成纖維細(xì)胞代謝和生長改變,增加Col-Ⅰ、Col-Ⅲ沉積,最后導(dǎo)致心肌纖維化。使用二參真武湯含藥血清干預(yù)后,PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯降低。已有研究[18]表明,一些關(guān)鍵分子和信號通路可以調(diào)節(jié)自噬,其中mTOR可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號通路和過程,如細(xì)胞凋亡和自噬。本研究發(fā)現(xiàn),用二參真武湯處理的模型細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低,心肌纖維化程度減輕,提示二參真武湯通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路增加細(xì)胞自噬抑制心肌纖維化。

綜上所述,二參真武湯可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá),增加自噬活性,誘導(dǎo)纖維化細(xì)胞自噬性死亡來改善心肌纖維化,對纖維化的原代心肌成纖維細(xì)胞起到保護作用。