王奇林,董昌武,徐 慧,劉 陽,李 茜,宋 敏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥 230012)

自發(fā)性高血壓是一種由多種因素引起的血壓升高的全身性疾病,是心腦血管疾病最主要的誘發(fā)因素,可對多個重要臟器造成損害,如心、腦、腎,并可最終導(dǎo)致這些臟器衰竭[1-2]。高血壓病引起的心肌病變是導(dǎo)致心臟受損的主要因素,中國每年約有200萬患有高血壓病的個體發(fā)生心功能損傷[3],其中自發(fā)性高血壓約占40%。目前,自發(fā)性高血壓的治療方式主要使用一線降壓藥控制血壓,如臨床常用鈣離子拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等,用藥時間幾乎貫穿整個發(fā)病過程,長時間的高血壓狀態(tài)所產(chǎn)生的并發(fā)癥對機體造成的傷害遠大于高血壓本身。

中藥治療自發(fā)性高血壓有降壓后不易反彈的優(yōu)勢。因此,尋找行之有效的中藥治法或中西藥結(jié)合治法將有助于降低高血壓及其并發(fā)癥對人體的損害。自發(fā)性高血壓損傷心臟的主要方式是心室重構(gòu),心室重構(gòu)最主要的病理變化是心肌纖維化[4],故預(yù)防心肌纖維化是防治自發(fā)性高血壓并發(fā)癥的一個重要方向。研究[5-7]顯示,心肌纖維細胞的增殖、轉(zhuǎn)分化在心肌纖維化中具有重要作用,在轉(zhuǎn)分化的心肌成纖維細胞內(nèi)可進一步激活結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ,Col-Ⅰ)[7]、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等心肌纖維化的相關(guān)因子,從而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。

滋陰潛陽方[8]是臨床治療自發(fā)性高血壓的有效方,其主要由龜板、石決明、煅牡蠣、制何首烏、鉤藤、熟地黃、生地黃、川芎等組成。前期研究[9]發(fā)現(xiàn),滋陰潛陽方具有改善“兩腎一夾”高血壓大鼠左心室重構(gòu)的作用,但其對心肌纖維化的影響機制尚未明確。本研究建立自發(fā)性高血壓大鼠模型,觀察滋陰潛陽方對自發(fā)性高血壓大鼠左心室重構(gòu)的改善作用并探究其抑制心肌纖維化的機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性自發(fā)性高血壓大鼠40只,12周齡,體質(zhì)量為(230±20)g,SPF級Wistar雄性大鼠10只,體質(zhì)量為(230±20)g。所有動物均購自維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0011。所有大鼠均飼養(yǎng)于安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動物實驗中心,室溫為(23±3)℃,濕度控制為(45±5)%,12 h光暗循環(huán)。本研究由安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準,證明號:2022021。

1.2 藥物 滋陰潛陽方藥物組成:龜板、石決明(先煎)、煅牡蠣(先煎)各30 g,制何首烏、鉤藤(后下)各20 g,熟地黃、生地黃、川芎各15 g,以上藥物均購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。煎煮方法:連續(xù)2次煎藥,取2次過濾液,再置于低溫恒溫水浴中濃縮至含生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL,藥液裝瓶,4 ℃存儲。依那普利(江蘇制藥股份有限公司生產(chǎn),國藥準字號H32026567,每片10 mg),購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房。

1.3 儀器 大鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(NS60):上海玉研科學(xué)儀器有限公司;電泳儀(型號 EPS300)、電泳槽(型號 VE-180)、轉(zhuǎn)膜儀(型號 VE-186):上海天能科技有限公司;高速冷凍離心機(型號 JW-3021HR):安徽嘉文儀器裝備有限公司;熒光定量PCR儀(型號 PIKOREAL 96):Thermo Scientific。

1.4 試劑 α-SMA抗體(批號 AF10212367P)、Col-Ⅰ抗體(批號 AI04234760)、CTGF抗體(批號 AD19286640):Bioss;GAPDH(批號210040421):Zsbio;PVDF膜(批號R7SA9081E):Millipore;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號AL50947A):TaKaRa。

2 方法

2.1 動物分組及給藥 根據(jù)《實驗動物學(xué)》[10],以大鼠收縮壓高于115 mmHg判定為高血壓模型復(fù)制成功;以性情易激惹、飲水量增加判定大鼠證型為陰虛陽亢;綜合以上標準,判斷自發(fā)性高血壓大鼠是否符合陰虛陽亢型高血壓模型。

將40只符合模型標準的自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為模型組,滋陰潛陽方高、低劑量組,依那普利組,每組10只,另取10只Wistar大鼠作為正常組。模型組和正常組大鼠每日給予0.9% NaCl溶液10 mL/kg灌胃。根據(jù)《實驗動物學(xué)》[10]中常用實驗動物與人的體表面積比例換算方法,依那普利組給予依那普利1.05 mg/(kg·d),滋陰潛陽方低、高劑量組分別給予大鼠5.85、23.4 g/(kg·d)(分別相當于成人臨床用藥的等效劑量1、4倍劑量)滋陰潛陽方湯劑灌胃,每日2次,連續(xù)給藥6周。

2.2 血壓測量 用無創(chuàng)血壓采集系統(tǒng)分別測量各組大鼠尾動脈收縮壓4次,依次為給藥前,給藥2、4、6周后。每次每只大鼠測量3次,取平均值。

2.3 取材 藥物干預(yù)6周后,用20%烏拉坦對大鼠進行腹腔注射麻醉。迅速處死大鼠,開胸,取出心臟。一部分心肌組織用預(yù)冷的生理鹽水沖洗殘留血液后固定于4%多聚甲醛溶液中,24 h后進行組織脫水、包埋及切片處理。另一部分心肌組織用PBS洗滌血液后,用組織剪剪成小拇指指甲蓋大小的小塊,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

2.4 Masson染色觀察大鼠心肌纖維化情況 心肌組織切片后脫蠟至水,進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。顯微鏡下觀察各組切片染色情況,膠原纖維呈藍色,肌纖維呈紅色,隨機選取5個視野留取圖像進行分析。

2.5 Western blot法檢測大鼠心肌組織CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA蛋白表達水平 每組各取3只大鼠左心室組織樣本100 mg,加入RIPA細胞裂解液600 μL(內(nèi)含0.6 mmol PMSF)進行裂解。12 000 r/min離心15 min,收集上清液,即為總蛋白液。在SDS-PAGE膠中電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印到PVDF膜,轉(zhuǎn)印結(jié)束后將PVDF膜放入 Western封閉液(5%脫脂奶粉)中封閉2 h。按照合適的比例用一抗稀釋液進行稀釋,4 ℃緩慢搖動孵育過夜。加入PBST,每次洗滌10 min,共洗滌3次。洗膜結(jié)束后用二抗室溫孵育1.2 h,洗滌液將條帶放入ECL顯影液,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為蛋白相對表達量。

2.6 RT-PCR法檢測大鼠心肌組織CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA mRNA表達水平 每組各取3只大鼠左心室組織100 mg,加入1 mL TRIzol裂解。待裂解完全后室溫放置5 min。12 000 r/min離心10 min,取上清液,加入適量無水乙醇?；靹蚝蠹尤氲絉NA提取柱中,依次加入反應(yīng)液,提取總RNA溶液,測定總RNA濃度及純度后逆轉(zhuǎn)錄,即為cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR檢測,以正常組為參照組,β-actin為內(nèi)參,以2-ΔΔCT法計算各組大鼠心肌組織CTGF、Col-Ⅰ及α-SMA mRNA的表達量。引物合成序列見表1。

表1 β-actin、α-SMA、Col-Ⅰ、CTGF引物合成序列

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠收縮壓比較 與正常組比較,各時點各組大鼠尾部收縮壓顯著升高(P<0.05),表明模型復(fù)制成功;模型組大鼠收縮壓隨時間而逐漸升高。與模型組比較,給藥2周后依那普利組與滋陰潛陽方高劑量組大鼠收縮壓均顯著降低(P<0.05),其中滋陰潛陽方高劑量組收縮壓降低更明顯(P<0.05);與模型組比較,給藥4、6周后依那普利組,滋陰潛陽方高、低劑量組大鼠收縮壓均顯著降低(P<0.05),其中以滋陰潛陽方高劑量組降低作用最明顯,依那普利組次之(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠收縮壓比較

3.2 各組大鼠心肌組織纖維化情況比較 模型組大鼠心肌組織可見大量藍色心肌膠原纖維增生,心肌纖維化明顯;與模型組相比,滋陰潛陽方高劑量組與依那普利組大鼠心肌組織藍色心肌膠原纖維明顯減少,而滋陰潛陽方低劑量組大鼠心肌組織仍可見大量藍色心肌膠原纖維增生。見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.滋陰潛陽方高劑量組;D.滋陰潛陽方低劑量組;E.依那普利組圖1 各組大鼠心肌組織纖維化情況比較(Masson染色,10×20倍)

3.3 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表達水平比較 與正常組比較,模型組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表達水平均升高(P<0.05);與模型組比較,滋陰潛陽方高劑量組和依那普利組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)。見表3、表4、圖2。

注:A.正常組;B.模型組;C.滋陰潛陽方高劑量組;D.滋陰潛陽方低劑量組;E.依那普利組圖2 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白表達電泳圖

表3 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白表達水平比較

表4 各組大鼠心肌組織Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA mRNA表達水平比較

4 討論

研究[12-14]表明,中醫(yī)藥在治療高血壓病及其并發(fā)癥方面確有良好療效。自發(fā)性高血壓屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”“頭痛”等范疇,由多種內(nèi)外因素相互影響而成,中醫(yī)認為,本病的病機以陰虛為主,尤以心、肝、腎三臟陰虛所致。肝腎陰虛致陽亢難制,腎水不足亦導(dǎo)致心陰不足、心腎不交,長期心陰不足造成心氣虧虛甚或心陽不振,導(dǎo)致水濕甚或瘀血的產(chǎn)生,水濕、瘀血內(nèi)阻則導(dǎo)致疾病發(fā)展及加重。本病病位在心,常累及肝、腎、脾、肺等臟器,臨床治療多采用滋陰、潛陽、祛濕、活血等方法。高爾鑫教授根據(jù)本病的病因病機,創(chuàng)制具有滋陰潛陽作用的中藥復(fù)方滋陰潛陽方,該方是在鎮(zhèn)肝息風湯和天麻鉤藤飲的基礎(chǔ)上化裁而來,臨床用于治療自發(fā)性高血壓療效良好[15-16]。滋陰潛陽方通過益陰補血、祛瘀通絡(luò)改善自發(fā)性高血壓造成的心臟損傷。方中重用龜板、生地黃、熟地黃滋養(yǎng)肝腎之陰,加入鉤藤降壓作用良好;石決明、牡蠣兩藥重鎮(zhèn)潛陽,川芎活血祛瘀通絡(luò),針對本病本虛標實之病機。諸藥共奏滋陰潛陽之功,從而有效治療陰虛陽亢型高血壓。自發(fā)性高血壓所致心肌纖維化的臨床癥狀可表現(xiàn)為心胸憋悶、疼痛,并伴有頭暈或頭痛。憋悶、疼痛多為血行不暢所致,陰血同源,長期心腎不交導(dǎo)致心血不足,滋陰潛陽方中用牡蠣、龜板兩藥補心血之虧兼養(yǎng)心神,再加生地黃、熟地黃兩藥以滋腎陰,共奏滋養(yǎng)心腎之功;頭暈、頭痛多為陽亢難制所致,方中鉤藤制風、川芎活血祛瘀通絡(luò)。諸藥共用,標本兼治,故藥味雖少,療效頗佳。滋陰潛陽方可有效改善自發(fā)性高血壓所致心肌纖維化。

心肌纖維化主要表現(xiàn)為膠原沉積、比例失調(diào)并伴有心肌成纖維細胞的增生[17]。血管緊張素Ⅱ、醛固酮等促成高血壓的因子可促進心肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,導(dǎo)致膠原蛋白被大量合成,從而導(dǎo)致和加重心肌纖維化[18]。α-SMA是肌成纖維細胞活化的標志性蛋白,肌成纖維細胞可大量合成Col-Ⅰ,導(dǎo)致膠原代謝異常[19]。CTGF作為促成纖維細胞分裂和膠原沉積的細胞因子,可介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子-β的部分生物效應(yīng),從而刺激心肌成纖維細胞增殖和細胞外膠原的沉積,在促進纖維化方面發(fā)揮重要作用[20]。

本研究結(jié)果顯示,滋陰潛陽方具有降低自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓的功效,隨著給藥時間的延長,大鼠的收縮壓呈持續(xù)降低狀況,與前期實驗結(jié)果一致[8]。滋陰潛陽方高劑量組和依那普利組可明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓(P<0.05),而低劑量組降壓作用不明顯。滋陰潛陽方高劑量組和依那普利組可明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織中Col-Ⅰ、CTGF、α-SMA蛋白及mRNA表達水平(P<0.05),而低劑量組作用不明顯。

綜上,滋陰潛陽方可能通過抑制心肌成纖維細胞的增殖和轉(zhuǎn)分化等過程,抑制自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的發(fā)展,其作用途徑有待進一步研究。