楊月美,宋曉萌,吳煜農(nóng)

頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)起源于口腔、咽部和喉部的黏膜上皮,是頭頸部最常見的惡性腫瘤。作為人類第六大常見癌癥,5年生存率<50%[1]。其中口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)簡稱口腔鱗癌,約占HNSCC的50%以上,常見的致病因素包括吸煙、飲酒、咀嚼檳榔等不良習慣[2]。目前OSCC的治療主要以手術(shù)治療為主,需要尋找新的治療靶點。Notch蛋白作為高度保守的細胞表面配體,其正常功能是維持細胞增殖、分化所必需的。作為Notch家族成員之一,相較于Notch2～4受體而言,Notch1突變率更高。T細胞急性淋巴細胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukaemia,T-ALL)的特征是Notch1的激活突變,約有50%的T-ALL患者存在Notch1的突變[3-5]。實體腫瘤中,來自高加索患者的13種HNSCC細胞系中檢測到6處核苷酸突變;四分之一的突變位于異二聚化結(jié)構(gòu)區(qū)域(HD區(qū)域氨基酸1570—1734區(qū)域)[6]。我國51例口腔癌患者中檢測到156處核苷酸突變,在22例患者中發(fā)現(xiàn)42處非同義突變,其中8例患者發(fā)現(xiàn)12處突變位于HD區(qū)域,5例患者的突變位于HD區(qū)域的1641位點氨基酸。3例患者的3處氨基酸突變位于1133位點氨基酸。研究中發(fā)現(xiàn)相較于Notch1未突變者,Notch1突變患者的總生存期和無病生存率明顯縮短[7]。1133位點突變可促進OSCC細胞的增殖及侵襲。為此,本實驗擬探究在OSCC中,1641位點的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸后的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑耗材

人口腔鱗狀細胞癌細胞系CAL27(購自美國ATCC生物標準品資源中心),人舌鱗癌細胞系HSC3(南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院袁華課題組惠贈),DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(CellMax,中國),胰蛋白酶、青/鏈霉素雙抗(碧云天,中國),對照組空載質(zhì)粒PEGFP-N1、野生型質(zhì)粒PEGFP-Notch-WT(Notch1WT)和突變型質(zhì)粒PEGFP-Notch1-P1641S(Notch1P1641S)(捷瑞公司,中國),RNA提取相關(guān)試劑(Trizol等)(諾唯贊公司,中國),CCK-8試劑盒(APExBIO,美國),Transwell小室、PVDF膜(Millipore,美國),一抗:NICD(abcam,英國),pEGFR、EGFR、PI3K、PDK1、pAkt、Akt、pmTOR、mTOR、pErk1/2、Erk1/2(CST,美國),Ki67、β-actin(proteintech,中國),p70S6(Santa,美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)及細胞轉(zhuǎn)染

將CAL27及HSC3細胞以1×105個/孔接種于六孔板中,待細胞密度長至約70%時,按照ExFect Transfection Reagent說明書轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。實驗共分為3組:空白對照組轉(zhuǎn)染PEGFP-N1(N1-N1)、野生型實驗組轉(zhuǎn)染PEGFP-Notch-WT(N1-WT)、基因突變組轉(zhuǎn)染PEGFP-Notch1-P1641S(N1-P1641S),轉(zhuǎn)染質(zhì)粒6～8 h后更換新鮮完全培養(yǎng)液,2 d后提取細胞RNA,應用qPCR檢測Notch1轉(zhuǎn)錄組表達量。3 d后提取細胞內(nèi)的蛋白檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 實時定量PCR實驗

轉(zhuǎn)染質(zhì)粒2 d后,將處于對數(shù)生長期的口腔鱗癌細胞使用Trizol試劑進行總RNA分離,利用5×Prime Script RT Master Mix合成cDNA,使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行實時定量qPCR。以GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT基因進行實時定量。引物序列如下。GAPDH,F:5′-GAGAAGTATG-ACAACAGCCTCAA-3′,R:GCCATCACGCCACAGTTT-3′;PI3K,F:5′-CCACGACCATCATCAGGTGAA-3′,R:5′-CCTCACGGAGGCATTCTAAAGT-3′;Notch1,F:5′-TATTTGGACTTTGCGACAAGACT-3′,R:5′-TCGAA-CGTACTGGTCTGGATAG-3′。

1.4 CCK-8增殖實驗

轉(zhuǎn)染后72 h的細胞計數(shù)后按照每孔2×103個的密度置于96孔板中,每個實驗組重復3次,待細胞貼壁后,檢測第0天初始細胞增殖效率。按照說明書,將CCK-8溶液用新鮮培養(yǎng)液稀釋成10%的濃度,孵育2 h后,在450 nm波長濃度下檢測吸光度。連續(xù)測量4 d,繪制曲線。

1.5 EdU標記增殖細胞

轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的舌鱗癌細胞經(jīng)細胞計數(shù),1×104個細胞培養(yǎng)至24孔板中,過夜培養(yǎng)且恢復至正常形態(tài)后,按說明書配制EdU工作液加入至孔內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)2 h,棄培養(yǎng)液后,細胞經(jīng)過固定、洗滌、通透,加入反應液后,洗滌、核染,顯微鏡下觀察并分析細胞染色。

1.6 集落形成實驗

轉(zhuǎn)染72 h后的細胞,經(jīng)過計數(shù),將2×103個的細胞置于中皿中,每3 d換1次液,培養(yǎng)2周后觀察每個細胞團塊大小,每個細胞團塊中細胞數(shù)量>50個終止培養(yǎng),4%多聚甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色15 min,流水輕輕沖洗,干燥后使用掃描儀拍攝。

1.7 劃痕實驗

轉(zhuǎn)染72 h的細胞,重新鋪板置于24孔板中,以200 μL的黃色槍頭在孔板底部正中進行劃痕,各組間保持力度一致,PBS清洗兩遍,顯微鏡觀察。若實驗組與N1-N1組初始寬度相同,則攝取圖片,待一組細胞閉合時再次攝取圖片。劃痕閉合率=(初始寬度-終末寬度)/初始寬度×100%。

1.8 Transwell細胞侵襲實驗

將Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1∶6的比例配制稀釋液,取50 μL稀釋液加入Transwell上室中,轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)箱中4 h待基質(zhì)膠凝固,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的CAL27、HSC3細胞經(jīng)過計數(shù),取含5×104個細胞的無血清培養(yǎng)基單細胞懸液150 μL加入Transwell上室。24孔板加入800 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)36 h后取出Transwell小室,甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色15 min,鏡下觀察下室細胞,使用Image J分析細胞數(shù)量。

1.9 蛋白提取及蛋白印跡實驗

按照說明書,將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的六孔板置于冰上,RIPA蛋白裂解液與磷酸酶抑制劑(碧云天)加入六孔板的每個孔中,靜置15 min,吸取細胞與蛋白裂解液的混合溶液,離心取上清液,加入四分之一體積的SDS-PAGE上樣緩沖液,100 ℃加熱15 min。取適量的上樣量于提前制備的蛋白凝膠中,90 V恒壓電泳,300 mA恒流轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,封入相應的一抗中,4 ℃過夜,蛋白條帶置于二抗(抗鼠+抗兔)中,室溫孵育2 h,TBST清洗3遍,使用ECL發(fā)光液試劑盒(天能)成像顯色。使用Image J軟件分別對目標條帶及β-actin條帶灰度值進行量化,通過標準化計算得到最終量化結(jié)果。

1.10 動物實驗

15只5周齡BALB/c裸鼠購自南京醫(yī)科大學動物實驗中心,適應性培養(yǎng)1周后用于后續(xù)實驗。15只裸鼠隨機分為3組,每組5只,分別為空白對照組:N1-N1組,野生型組:N1-WT組,基因突變組:N1-P1641S組。將轉(zhuǎn)染Notch1N1、Notch1WT、Notch1P1641S三種質(zhì)粒的HSC3細胞,制備成50 μL,細胞量約為5×106個,與50 μL的基質(zhì)膠等體積混合均勻后分別注射至3組裸鼠背部。經(jīng)過24 d,處死小鼠,取背部腫瘤拍照稱重,測量腫瘤長度a、寬度b,計算體積V,V=(a×b2)/2并進行免疫組化。

1.11 免疫組化

取小鼠背部腫物,經(jīng)4%多聚甲醛浸泡,流水沖洗過夜,脫水包埋后為石蠟包塊。石蠟切片機切片,梯度脫蠟、水化,抗原修復后一抗過夜,PBS洗3遍后封二抗,室溫下孵育30 min,PBS洗3遍,按照說明書經(jīng)DAB顯色,蘇木素染色,梯度脫水,干燥后中性樹膠封片留存。

1.12 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 8.0版本進行分析,多組比較采用one-way ANOVA單因素方差分析,組間比較采用Dunnett檢驗。P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞轉(zhuǎn)染效率驗證

CAL27和HSC3細胞轉(zhuǎn)染Notch1N1、Notch1WT、Notch1P1641S三種質(zhì)粒,采用PCR在轉(zhuǎn)錄水平驗證轉(zhuǎn)染效率,在CAL27細胞中,野生型組和基因突變組Notch1基因RNA的表達水平分別是空白對照組(2 089.14±134.42)、(4 365.28±385.02)倍。在HSC3細胞中,野生型組和基因突變組Notch1基因RNA的表達水平分別是空白對照組(1 873.25±218.29)和(4 527.19±297.16)倍,如圖1所示,使用Graphpad Prism 8.0 軟件Dunnett檢驗方法分析結(jié)果顯示,兩種細胞中轉(zhuǎn)染Notch1WT、Notch1P1641S質(zhì)粒后Notch1基因轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比轉(zhuǎn)染效率具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

A:CAL27細胞Notch1基因mRNA水平;B:HSC3細胞Notch1基因mRNA水平;與N1組相比,Dunnett檢驗,**:P<0.01;***:P<0.001

2.2 表型實驗

2.2.1 細胞增殖實驗

CCK-8實驗結(jié)果如圖2顯示,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的舌鱗癌腫瘤細胞連續(xù)培養(yǎng)4 d,每天同一時間點使用CCK-8檢測試劑檢測細胞的OD值,CAL27與HSC3細胞在培養(yǎng)第4天時,與空白對照組相比,基因突變組細胞的吸光度提高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示其細胞增殖能力提高。

A:CAL27細胞增殖曲線;B:HSC3細胞增殖曲線;**:細胞培養(yǎng)至第4天時,與N1-N1組相比,Dunnett檢驗,P<0.01

EdU熒光實驗如圖3顯示,轉(zhuǎn)染Notch1N1、Notch1WT、Notch1P1641S三種質(zhì)粒,在保證細胞數(shù)量基本相同的情況下,突變組舌鱗癌細胞的EdU染色陽性細胞數(shù)量更多,表明基因突變組細胞的增殖能力增強。

A:CAL27細胞EdU染色后的鏡下圖; B:HSC3細胞EdU染色后的鏡下圖;比例尺=100 μm( ×100)

平板克隆形成實驗結(jié)果如圖4顯示,初始細胞數(shù)量相同的情況下,培養(yǎng)相同時間,基因突變組腫瘤細胞由單個細胞形成的細胞團更多,表明在相同時間內(nèi),基因突變組腫瘤細胞的分裂能力增強,細胞增殖能力增強。

A:CAL27細胞培養(yǎng)14 d平板克隆形成結(jié)晶紫染色后掃描圖; B:HSC3細胞培養(yǎng)14 d平板克隆形成結(jié)晶紫染色后掃描圖

2.2.2 細胞遷移侵襲能力檢測

劃痕實驗結(jié)果如圖5顯示,CAL27細胞轉(zhuǎn)染Notch1N1、Notch1WT、Notch1P1641S三種質(zhì)粒后細胞劃痕閉合率百分比分別為(75.37±0.42)%、(86.93±0.56)%、(92.31±0.39)%;與對照組相比,野生型組和基因突變組腫瘤細胞的遷移能力增強(P<0.001);HSC3細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后劃痕閉合百分比分別為(65.32±0.54)%、(78.81±0.37)%、(91.43±0.23)%, 與對照組相比, 野生型組與基因突變組腫瘤細胞的遷移能力均增強(P<0.001)。

A:CAL27細胞遷移18 h鏡下圖;B:HSC3細胞遷移24 h鏡下圖;比例尺=100 μm( ×100)

Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果如圖6顯示,通過比較相同時間單位面積內(nèi)下室細胞的數(shù)量觀察細胞的侵襲能力。CAL27細胞轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后每個視野中下室細胞的數(shù)量分別為(283.48±21.37)個、(496.42±20.81)個、(636.26±54.62)個;與對照組相比,野生型組和基因突變組腫瘤細胞的侵襲遷移能力均增強(P<0.001)。HSC3細胞轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒后每個視野中下室細胞數(shù)量分別為(155.43±29.36)個、(213.29±16.52)個、(526.31±34.04)個。與對照組相比,野生型組腫瘤細胞的侵襲遷移能力未見明顯增強(P=0.07),基因突變組細胞的侵襲遷移能力增強(P<0.001)。

CAL27、HSC3細胞侵襲實驗結(jié)晶紫染色后鏡下圖;比例尺=100 μm( ×100)

以上結(jié)果表明,Notch1P1641S突變后,細胞的增殖、遷移及侵襲能力均增強。

2.3 Notch1突變后激活PI3K/Akt信號通路

轉(zhuǎn)染72 h后,CAL27及HSC3細胞提取蛋白。經(jīng)Westen blot蛋白分析發(fā)現(xiàn),圖7所示,與空白對照組相比,轉(zhuǎn)染Notch1WT質(zhì)粒后,細胞內(nèi)的NICD表達量升高,但轉(zhuǎn)染Notch1P1641S質(zhì)粒的腫瘤細胞內(nèi)NICD的表達量并未升高,考慮Notch1P1641S質(zhì)粒并未激活經(jīng)典的Notch1信號通路。與轉(zhuǎn)染Notch1N1質(zhì)粒相比,轉(zhuǎn)染Notch1P1641S質(zhì)粒后pErk1/2、pmTOR、pAkt、PDK1及pEGFR蛋白表達量升高,表明Notch1P1641S基因突變后在一定程度上激活了PI3K/Akt信號通路。

2.4 動物實驗

HSC3細胞Notch1N1、Notch1WT、Notch1P1641S三種質(zhì)粒注射到裸鼠背部皮下,觀察24 d后,取下小鼠背部腫瘤組織,實驗結(jié)果顯示,三組小鼠成瘤體積分別為(80.41±2.46)mm3、(139.74±14.29)mm3、(291.53±31.28)mm3,與對照組相比,N1-P1641S組小鼠皮下成瘤體積更大(P<0.01)(圖8)。Ki67作為細胞增殖的核抗原,已成為檢測細胞增殖的常用指標。免疫組化結(jié)果顯示,DAB顯色相同時間內(nèi)突變組小鼠腫瘤組織切片內(nèi)Ki67染色陽性細胞數(shù)量增多表明細胞的增殖能力增強。pAkt染色結(jié)果顯示,相較于N1-N1組及N1-WT組小鼠腫瘤相比,N1-P1641S組小鼠腫瘤的pAkt表達更強,提示激活PI3K/Akt信號通路在一定程度上可以促進腫瘤生長(圖9)。

圖8 轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

圖9 HSC3 細胞移植瘤免疫組化染色

3 討 論

Notch1作為跨膜受體,在細胞的增殖分化過程中發(fā)揮著重要作用,當Notch1與相應受體結(jié)合被激活后,Notch1經(jīng)過相應的剪切,釋放NICD,NICD轉(zhuǎn)移到細胞核中并激活下游靶點[8]。在T-ALL中,Notch1激活突變導致下游的HES1及Myc等下游蛋白的表達顯著減少[9-11]。在實體腫瘤中,Notch1的角色一直存在爭議,一方面,Notch1信號表現(xiàn)出多種致癌作用,如誘導耐藥[12]、抑制細胞凋亡、誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[13-14]、誘導血管生成等促癌表型;另一方面,Notch1又可以作為腫瘤抑制因子。在Notch1基因條件敲除小鼠中,可以觀察到基底層增生及基底細胞癌樣病變[15]。

本實驗中,轉(zhuǎn)染Notch1質(zhì)粒,在轉(zhuǎn)染效率差異有統(tǒng)計學意義的情況下,通過表型實驗發(fā)現(xiàn)突變后細胞的增殖、遷移、侵襲能力增強。蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)突變后細胞中PI3K/Akt信號通路表達增強。體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn),突變細胞的成瘤體積增大,Ki67及pAkt的表達增強。Akt作為PI3K/Akt信號通路的中心節(jié)點,在口腔癌中被頻繁激活[16-17]。在T-ALL中,Notch1信號通路與PI3K/Akt信號通路之間的關(guān)系被廣泛研究,Notch1信號下游分子HES1的激活抑制了磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN的表達,導致PI3K的激活[18]。本實驗中,Notch1P1641S轉(zhuǎn)染后NICD的表達并未增多,說明并未激活經(jīng)典的Notch1信號通路,而是通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用。因此,我們做出推測:Notch1的促癌作用與此次突變的位點有關(guān)。在T-ALL中HD結(jié)構(gòu)域突變與Notch1信號通路異常關(guān)系密切,突變后的Notch1信號異常導致S1切割效率降低,細胞表面表達減少[19]。先前研究發(fā)現(xiàn)Notch1在實體瘤中是細胞膜靶向的跨膜受體,我們猜測突變后的Notch1蛋白未表達在細胞膜上,這可能解釋裸鼠成瘤后野生型組內(nèi)角化珠表達明顯增多。另一種原因可能與突變后氨基酸的種類有關(guān),在相同的實驗條件下,脯氨酸突變?yōu)榱涟彼岵⑽幢憩F(xiàn)出相同的生物學表型[20],為此我們猜想這一表型是由于脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸形成的。在宏觀層面上,早期的研究發(fā)現(xiàn),飲食中缺乏絲氨酸可以降低血漿中絲氨酸的含量,從而減少某些類型腫瘤的生長。微觀層面分析,腫瘤的快速增殖需要大量的絲氨酸,絲氨酸在線粒體中的分解代謝提供了大部分的一碳單位,作為原料進一步為腫瘤進展提供原料[21]。雖然這種絲氨酸突變形成的一系列生物學表型是否為Notch1-HD區(qū)域所特有的,我們不得而知,但可以肯定的是,絲氨酸在維持細胞功能方面發(fā)揮著重要作用。

綜上所述,Notch1P1641S的突變與舌鱗狀細胞癌的增殖、侵襲、遷移有關(guān),可為頭頸鱗癌的治療提供靶點,但Notch1-HD區(qū)域的突變是否產(chǎn)生同樣的生物學作用有待進一步探究。