鐘嘉偉,潘 劍,2,郭雨晨,2

頜骨作為顱頜面的基本硬組織框架,是口頜系統(tǒng)功能及外形的基礎。但是,全球有超過35億人受到口頜系統(tǒng)疾病的影響。其中,發(fā)育畸形、牙周病、外傷、癌癥等疾病均導致顱頜面骨的損傷[1]。目前,上述病損的修復僅局限于手術及假體的修復,缺乏有效的生物學重建手段[2]。研究頜骨的穩(wěn)態(tài)以及損傷修復機制是尋找新治療靶點的突破口。

骨骼是一個動態(tài)變化的系統(tǒng),在整個生命過程中不斷重塑[3]。機體通過復雜的機制對這一過程進行精密調(diào)控,其中免疫系統(tǒng)在骨穩(wěn)態(tài)和損傷修復中起著關鍵的作用。2000年,Arron和Choi首次提出骨免疫學的概念,強調(diào)骨骼和免疫系統(tǒng)之間的雙向動態(tài)作用關系[4]。隨著研究深入,骨和免疫系統(tǒng)的相互作用逐步明確。骨免疫是指骨代謝過程受到免疫反應的調(diào)節(jié);同時,骨細胞對免疫系統(tǒng)也有著調(diào)節(jié)作用。這樣的一個雙向調(diào)控作用稱為骨免疫。

免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞和免疫活性物組成。其中對骨穩(wěn)態(tài)和修復發(fā)揮調(diào)控作用的主要是免疫細胞。免疫細胞系來源于多能干細胞,其中造血多能干細胞產(chǎn)生兩種前體細胞,一種是淋巴樣前體細胞,另一種是髓系前體細胞。淋巴樣前體細胞主要分化為T細胞(T-lymphocyte)、B細胞(B-lymphocyte)、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)和樹突狀細胞;而髓系前體細胞主要分化為紅母細胞、巨核細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和粒-單核干細胞,其中粒-單核干細胞可進一步分化為中性粒細胞、單核細胞和樹突狀細胞。T細胞、B細胞等數(shù)種免疫細胞對骨穩(wěn)態(tài)的作用已有較多研究,但是,上述免疫細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)和損傷修復的調(diào)控作用及機制還尚處于研究起始階段。本文系統(tǒng)性回顧免疫細胞對骨穩(wěn)態(tài)的作用機制,并結合目前骨免疫在頜骨穩(wěn)態(tài)中的研究進展,旨在為后續(xù)的研究提供思路。

1 T細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)的作用

T細胞是細胞免疫的主導細胞,由淋巴樣前體細胞分化而來。前體T細胞遷移到胸腺內(nèi),在胸腺內(nèi)分化為成熟的具有免疫活性的T細胞。根據(jù)功能和表面標志不同,T細胞可分為輔助性T細胞(helper T cell,Th)、細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells,Tc)、調(diào)節(jié)T細胞(regulatory T cell,Treg)和記憶T細胞。

1.1 Th細胞

Th細胞可以通過RANK/RANKL/OPG 信號軸對骨細胞發(fā)揮調(diào)控作用。早在上世紀90年代,Yoshida課題組和Wiktor-Jedrzejczak課題組就報道了3號染色體上Csfm基因隱性突變的小鼠因缺乏巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)導致體內(nèi)缺少成熟的巨噬細胞和破骨細胞,其骨改建速率顯著降低,表現(xiàn)出骨硬化癥[5-6]。RANK(receptor activator of nuclear factor κB)是位于破骨細胞表面的受體。RANKL(RANK ligand)作為RANK配體,在M-CSF的協(xié)調(diào)作用下與RANK結合,促使前體細胞分化為破骨細胞[7]。后來的研究表明RANKL作用于破骨前體細胞,可激活Src蛋白,從而激活其下游的Akt及mTOR蛋白分子,促使破骨細胞分化[8]。骨保護素(osteoprotegerin,OPG)配體是一種調(diào)節(jié)破骨細胞分化和活化的細胞因子,能與RANKL結合以降低RANK結合率,從而抑制破骨細胞分化,降低骨吸收速率[7]。這些研究表明破骨細胞是在M-CSF存在下由RANKL刺激的骨髓單核細胞/巨噬細胞譜系細胞分化而來的。

Th細胞也通過其他途徑調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)。Weitzmann等發(fā)現(xiàn),CD4+和CD8+T細胞的免疫重建會引起小鼠骨小梁丟失[9]。與健康人群相比,類風濕性關節(jié)炎的病例中衰老的CD4+CD28-T淋巴細胞分泌大量RANKL,展現(xiàn)出更強的破骨誘導和促進骨吸收能力[10]。對于成骨細胞,Deng等發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細胞分泌的γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)等細胞因子可促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化,而其分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)活性與成骨細胞分化呈負相關[11]。

Th細胞包括Th1、Th2、Th17細胞等幾類亞型。Th1分泌的白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1(interleukin-1,IL-1)在炎性骨吸收中起著關鍵作用[12]。這些炎性細胞因子可以通過刺激RANK,上調(diào)RANKL的表達,或抑制OPG的表達來促進破骨細胞生成和骨吸收[13]。其中IFN-γ可以通過抑制RANKL 信號通路直接抑制破骨細胞的生成[14]。此外,IFN-γ 在炎癥或 T 細胞過度激活的狀態(tài)下能通過 RANKL 非依賴性通路促進破骨細胞的生成[15]。最新研究表明,這種抑制作用是通過誘導轉(zhuǎn)錄合成短型色氨酸-tRNA合成酶(mini tryptophanyl-tRNA synthetase,mini-TrpRS)繼而刺激單核細胞的多核化實現(xiàn)的[16]。Th2細胞可以通過產(chǎn)生IL-4和IL-13作用于破骨前體細胞,從而抑制破骨細胞的生成[17-18]。Th17細胞能產(chǎn)生白介素-17(interleukin-17,IL-17)。IL-17不僅能通過上調(diào)破骨前體細胞上的RANK受體來促進破骨細胞的生成,還能促進TNF-α、IL-6和IL-1等破骨細胞因子的表達[19-20]。IL-17還與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)有很強的協(xié)同作用,兩者結合后能誘導間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[21-22]。

1.2 Tc細胞

Tc細胞也通過多個途徑調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)。Tc細胞產(chǎn)生的多種細胞因子,例如IL-12、IL-1、IL-6、IL-17、IL-18和TNF-α[23],參與調(diào)節(jié)RANK信號傳導[24],并激活NFATc1(nuclear factor of activated T-cells,cytoplasmic 1)[25],從而促進破骨細胞分化。此外,T細胞還可以通過CD40抑制B細胞OPG的表達,從而增加破骨細胞的生成[26],導致全身及局部骨丟失[27]。

研究表明對小鼠進行細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(systemic administration of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4-Ig)的全身給藥可抑制小鼠實驗性牙周炎模型中的骨吸收,這可能是通過抑制破骨細胞的分化和活化而發(fā)揮作用的[28],它可以以CD80/CD86依賴的方式誘導破骨細胞前體細胞凋亡直接抑制破骨細胞分化[29]。

1.3 Treg細胞

Treg細胞也在骨的穩(wěn)態(tài)中起著調(diào)控作用。Tregs是以Foxp3表達為特征的CD4+CD25+T細胞亞群[30]。研究表明Treg通過分泌TGF-β,IL-10,IL-5和IL-4抑制外周單核細胞的破骨分化[31-32]。此外,Treg細胞可以通過與細胞毒性T細胞相互作用影響骨的穩(wěn)態(tài)和修復。Treg細胞與CD8+T細胞相互作用,能上調(diào)成骨因子Wnt10b的表達,促進骨生成[33]。Treg細胞還能抑制CD4+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α,促進骨再生[34]。在絲線結扎誘導的小鼠牙周炎模型中,局部誘導增加Treg細胞可以減少炎癥性的骨喪失[35]。研究發(fā)現(xiàn)與沒有新骨形成的強直性脊柱炎患者相比,有新骨形成的強直性脊柱炎患者的Th17/Treg比值顯著降低,而IL-10的mRNA表達與Th17/Treg的比值呈顯著正相關,提示Treg可通過分泌IL-10抑制Th17,在強直性脊柱炎病例中促進新骨形成[36]。Treg細胞在腭快速擴張早期階段通過抑制Th1和Th17細胞的功能進而抑制破骨細胞生成[37]。而在實驗性牙周炎期間,Treg細胞因表型不穩(wěn)定失去抗破骨細胞生成的特性,促進了Th17主導的骨喪失[38]。在自身免疫性關節(jié)炎和實驗性牙周炎的小鼠模型中,Foxp3+Treg細胞亞群還被發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)化為自身反應性Foxp3-TH17細胞發(fā)揮作用[38-39]。

2 B細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)的作用

B細胞在生理狀態(tài)下通過分泌骨保護素抑制破骨細胞的生成,而在病理狀態(tài)下能激活NF-κB配體受體激活因子繼而通過RANK/RANKL軸而刺激破骨細胞的生成[40]。B細胞表達CCL3和TNF等成骨細胞抑制因子,直接抑制間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[41]。在牙周炎動物模型中,牙周炎組局部記憶B細胞表達的RANKL顯著升高,且上述細胞可在體外以RANKL依賴性方式支持破骨細胞分化[42]。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是促進紅細胞生成的關鍵因子,其受體(EPO-Rs)也在髓系細胞、骨細胞和免疫細胞等非紅系細胞中表達。EPO能誘導小鼠前體B細胞CD115表達并促進破骨發(fā)生,而特異性敲除小鼠B細胞中的EPO-R使小鼠骨量增加。這表明B細胞產(chǎn)生的促紅細胞生成素可能上調(diào)破骨信號[43]。

3 單核/巨噬細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)的作用

單核細胞系是一類髓系細胞群,是破骨細胞和巨噬細胞的共同來源。巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)刺激單核細胞分化為巨噬細胞,后者激活后根據(jù)功能和表面標志物不同,可以分為M1和M2兩種亞型。而RANKL則促使單核細胞向破骨細胞分化[44]。

在特定的免疫微環(huán)境中,巨噬細胞可以轉(zhuǎn)分化為破骨細胞。巨噬細胞經(jīng)M-CSF、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-4、IL-13刺激后,可形成類似破骨細胞的多核巨細胞[45-47]。M2巨噬細胞在RANKL的刺激下可以形成破骨細胞[48]。

巨噬細胞也能分泌IL-1、IL-6、IL-18、IL-23、IL-27和TNF-α等細胞因子[49],影響RANK/RANKL/OPG 破骨細胞調(diào)控軸,調(diào)控破骨細胞的分化。其中,TNF-α、IL-1β和IL-6可促進破骨細胞的分化和活化[50]。IL-18可能調(diào)節(jié)Th1細胞分化和IFN-γ的生成,是破骨生成的抑制因子[51-53]。研究還表明IL-18在體外通過c-MYC途徑激活SLC7A5以增強人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[54]。IL-23能激活破骨細胞[17]。IL-6在與破骨前體細胞結合后會促進破骨生成[55]。這些細胞因子也可以影響其他細胞的功能,如IL-27可抑制Th17細胞和CD4+T細胞RANKL的表達,減少破骨細胞生成[56-57]。

巨噬細胞與成骨細胞間存在調(diào)控關系。骨組織中存在常駐巨噬細胞,即骨巨噬細胞。骨巨噬細胞在組織學上位于成骨細胞附近,與成骨細胞相互作用[58-59]。研究表明,骨巨噬細胞和炎性巨噬細胞能影響膜內(nèi)成骨細胞的合成功能,其中骨巨噬細胞起到主導作用。此外,巨噬細胞在軟骨內(nèi)成骨過程中是必需細胞[60]。研究證實,在骨折修復的過程中,巨噬細胞與早期的修復密切相關[61-62]。

與野生型小鼠相比,巨噬細胞缺陷型小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化潛能顯著下降[63-64]。后續(xù)研究證實,巨噬細胞分泌的IL-17和IL-23可以促進骨髓間充質(zhì)細胞成骨分化[65]。同時巨噬細胞分泌的IL-27能通過增加早期生長反應因子2(early growth response-2,Egr-2)的表達而抑制成骨細胞凋亡,還能以Egr-2 依賴的方式上調(diào)Id2,進一步抑制破骨細胞生成[66]。另外,研究人員通過對比年輕小鼠和老齡小鼠巨噬細胞分泌性蛋白的差異,發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體相關蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP 1)是導致兩者骨損傷修復差異的關鍵,阻斷LRP1導致小鼠骨折修復能力消失,而利用重組LRP1治療老年小鼠能促進骨折愈合[67]。

巨噬細胞還可以通過分泌OSM調(diào)節(jié)骨的穩(wěn)態(tài)。制瘤素 M(oncostatin M,OSM)是IL-6家族細胞因子之一,可抑制人骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂分化并刺激其成骨分化[68]。后續(xù)研究證明OSM通過JAK3/STAT3信號通路促進牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)的成骨分化和成骨相關基因的表達,阻斷STAT3信號通路能抑制DPSCs成骨分化,并導致基質(zhì)礦化受到顯著影響[69]。巨噬細胞可通過OSM-STAT3/YAP1 信號軸調(diào)節(jié)成骨[70],在大鼠的腰椎退行性疾病模型中,使用抗OSM中和抗體阻斷OSM可預防骨硬化。

4 中性粒細胞和肥大細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)的作用

中性粒細胞來源于骨髓,具有吞噬、殺菌和趨化作用。在骨組織炎性反應過程中,中性粒細胞最先到達病灶,并通過其趨化作用募集大量先天性和適應性免疫細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞,在IL-8的誘導作用下,啟動軟骨內(nèi)成骨的過程。在此過程中,N2極化的中性粒細胞介導巨噬細胞和CD4+T細胞向抗炎型轉(zhuǎn)化;還可以分泌SDF-1α進一步通過SDF-1/CXCR4通路及其下游PI3K/Akt通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞趨化[71]。

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是粒細胞增殖、分化和存活的關鍵調(diào)節(jié)因子。最近的研究表明,G-CSF對實驗動物和患者的骨骼健康都有不利的影響。與對照組相比,用G-CSF處理后,小鼠的成骨細胞和骨細胞數(shù)量明顯減少,而且成骨相關標志物表達量也下降。機制研究顯示這一作用是通過誘導細胞凋亡完成的。對小鼠使用一氧化氮抑制劑可以部分恢復G-CSF刺激后成骨細胞的數(shù)量和成骨相關指標。據(jù)此,G-CSF可通過上調(diào)中性粒細胞中一氧化氮的產(chǎn)生來抑制小鼠的成骨細胞和骨細胞的生長[72]。在大鼠和小鼠的衰老骨骼中,炎性細胞和衰老的免疫細胞,包括中性粒細胞和巨噬細胞會聚集在骨髓中,分泌大量的甘卡霉素,導致成骨和破骨的失衡。而具有甘卡霉素基因缺失的中性粒細胞和巨噬細胞的小鼠會表現(xiàn)出骨骼老化延遲[73]。

肥大細胞來源于髓樣細胞,參與免疫調(diào)節(jié),具有弱吞噬功能,也對骨穩(wěn)態(tài)有著調(diào)控作用。肥大細胞能通過細胞表面RANKL誘導破骨細胞生成[74],還能通過分泌組胺、TNF和IL-6等促進破骨細胞的生成或通過分泌IL-1抑制成骨細胞活性來發(fā)揮骨吸收的作用[74-75]。研究人員通過研究組胺對小鼠骨髓細胞的影響,發(fā)現(xiàn)肥大細胞分泌的組胺能通過H1受體誘導破骨細胞的生成[76]。在小鼠的顱骨缺損模型中,肥大細胞展現(xiàn)出了促進成骨的作用[77]。對于成骨細胞,肥大細胞介導肌動蛋白細胞骨架的重排改變成骨細胞形態(tài);并且可以下調(diào)細胞成骨分化相關mRNA的表達而抑制成骨細胞的功能[78]。最近發(fā)現(xiàn),肥大細胞分泌的糜酶被人原代成骨細胞攝取后,通過TGF-β相關信號通路影響成骨相關因子的表達,并影響成骨細胞胞外基質(zhì)的合成及分泌,從而抑制成骨細胞功能[79]。

目前,國內(nèi)學者用單細胞RNA測序構建了小鼠下頜骨的單細胞圖譜。數(shù)據(jù)分析表明,與長骨相比,小鼠牙槽骨中發(fā)現(xiàn)了更加活躍的免疫微環(huán)境。其中牙槽骨單核細胞/巨噬細胞表達更高水平的OSM,從而促進未分化間充質(zhì)細胞的成骨分化[80]。作為國內(nèi)首個小鼠頜骨免疫微環(huán)境的單細胞測序研究,該研究提示免疫細胞在頜骨可能發(fā)揮更加重要的調(diào)控作用。后續(xù)研究可以通過挖掘相應數(shù)據(jù),探究更多的作用細胞和效應細胞,并發(fā)掘更多的作用通路,為疾病治療的藥物研發(fā)開創(chuàng)新的切入靶點。同時,進行大動物以及人類樣本的深入研究,將進一步推進骨免疫研究數(shù)據(jù)向藥物研發(fā)和臨床應用的轉(zhuǎn)化。

綜上,免疫系統(tǒng)對于顱頜面的骨具有關鍵的調(diào)控作用。但是,目前的研究數(shù)據(jù)尚無法構建頜骨免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的完善的分子調(diào)控網(wǎng)絡機制。結合近年來單細胞組學技術、空間轉(zhuǎn)錄組技術等新一代研究技術的廣泛應用,有望發(fā)現(xiàn)更多的調(diào)控分子靶點,從而構建更為完善的分子調(diào)控網(wǎng)絡學說,同時為相關疾病治療藥物的研發(fā)提供更新的治療靶點和更加完善的理論基礎。