賈安 茹國(guó)華 黃小強(qiáng) 黃濤 王彩霞 張世宇 張廷茹

【摘要】目的：建立同時(shí)測(cè)定貞芪扶正顆粒中4種成分含量的高效液相色譜法。方法：采用HPLC法，色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6mm×150 mm，4 μm），流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm，體積流量為1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：紅景天苷、酪醇、蘆丁和特女貞苷質(zhì)量濃度分別在0.524～52.4 μg·L-1、0.908～90.8 μg·L-1、1.656～165.6 μg·L-1和8.376～837.6 μg·L-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為0.9997、0.9997、0.9996和0.9993，平均加樣回收率分別為96.58%、101.21%、99.47%和102.53%；RSD分別為3.56%、1.29%、2.67%和3.68%。結(jié)論：該分析方法適用于貞芪扶正顆粒中特女貞苷、紅景天苷、蘆丁和酪醇的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】貞芪扶正顆粒；HPLC；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）10-0034-05

Determination of Four Components in Zhen Qi Fu Zheng Granules by HPLCJIA An1RU Guohua1，2HUANG Xiaoqiang1HUANG Tao1*WANG Caixia1ZHANG Shiyu1ZHANG Tingru1

1.Medical School， Huanghe Science & Technology College， Zhengzhou 450063， China；

2.College of Pharmacy， Henan Uinversity， Kaifeng 475004， ChinaAbstract：Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of four components in Zhen Qi Fu Zheng granules.Methods The chromatographic column was Agilent poroshell 120 ec-C18 （4.6 mm×150 mm，4 μ m） ， the mobile phase acetonitrile water， gradient elution; The detection wavelength is 216 nm; The volume flow rate is 1 mL·min-1， The column temperature is 30 ℃， and the injection volume is 10 μ L. Results? The mass concentrations of Salidroside， Tyrosol， Rutin and Ligustrum lucidum glycoside showed a good linear relationship with the peak area in the range of 0.524-52.4 μg·L-1， 0.908-90.8 μg·L-1， 1.656-165.6 μg·L-1 and 8.376-837.6 μg·L-1， respectively.The correlation coefficients were 0.9997， 0.9997， 0.9996 and 0.9993， and the average recoveries were 96.58%， 101.21%， 99.47% and 102.53% respectively; RSD was 3.56%， 1.29%， 2.67% and 3.68% respectively.Conclusion The analytical method established in this experiment is applicable to the determination of Ligustrum lucidum glycoside， salidroside， rutin and tyrosol in Zhen Qi Fu Zheng granules.

Keywords：Zhen Qi Fu Zheng Granules; HPLC ; Content Determination

貞芪扶正顆粒由黃芪和女貞子兩味常見中藥組成，具有提高人體免疫功能、保護(hù)骨髓和腎上腺皮質(zhì)的功效［1］。貞芪扶正顆?？捎糜诟鞣N疾病引起的機(jī)體損傷，有利于促進(jìn)機(jī)體正常功能的恢復(fù)［2-4］。黃芪具有健脾補(bǔ)中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿、托毒生肌的功效，其主要成分為黃芪總苷，黃芪總苷具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)，提高機(jī)體抗氧化能力的作用［5］。女貞子具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效［6］，女貞子的化學(xué)成分主要有紅景天苷、特女貞苷、酪醇［7-8］。紅景天苷有抗炎、抗氧化、抗癌等作用［7］。特女貞苷有保肝、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等作用［8］。酪醇又稱羥基苯乙醇，有抗氧化應(yīng)激、神經(jīng)保護(hù)、抗炎等作用［9］。蘆丁又名蕓香苷，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用［10］。目前關(guān)于貞芪扶正顆粒質(zhì)量控制的研究多集中在單一或兩個(gè)成分的測(cè)定及其指紋圖譜的研究，尚未見到同時(shí)對(duì)貞芪扶正顆粒4種化學(xué)成分含量測(cè)定的報(bào)道。為了能夠更加全面地對(duì)貞芪扶正顆粒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，本研究采用HPLC法對(duì)5個(gè)不同廠家的8批次貞芪扶正顆粒中的紅景天苷、特女貞苷、蘆丁和酪醇進(jìn)行含量測(cè)定，以期為貞芪扶正顆粒的質(zhì)量控制提供參考。紅景天苷、酪醇、蘆丁和紅景天苷的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

1儀器與材料

1.1儀器 Agilent 1260液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；十萬分之一電子天平，梅特勒-托利儀器上海有限公司；EPED-Z1-10T超純水機(jī)，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；KQ-300W型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2材料 貞芪扶正顆粒（無糖型）6個(gè)廠家，8樣品批次，見表1；特女貞苷（批號(hào)：39011-92-2，HPLC≥98%）、紅景天苷（批號(hào)：10338-51-9，HPLC≥98%）、蘆丁（批號(hào)：153-18-4，HPLC≥98%）和酪醇（批號(hào)：501-94-0，HPLC≥98%）標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海源葉生物科技有限公司；色譜乙腈和色譜甲醇均購自德國(guó)默克公司；其他試劑均為分析級(jí)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件 ［11-12］色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水溶液（B），梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：216 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。洗脫條件見表2。

2.2溶液制備

2.2.1混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 分別精密稱取適量特女貞苷、紅景天苷、蘆丁和酪醇4種對(duì)照品，置于10 mL容量中，加入甲醇制成每1 mL含有紅景天苷52.4 μg、特女貞苷837.6 μg、蘆丁165.6 μg和酪醇90.8 μg的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2供試品溶液 ［13］分別取適量貞芪扶正顆粒樣品置于研磨中，充分研磨成細(xì)粉，并分別精密稱取細(xì)粉2 g，置于50 mL錐形瓶中，加入甲醇20 mL。稱定重量，超聲30 min，放冷，再次稱定，加甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過0.45 μm濾頭，備用。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在該色譜條件下紅景天苷、酪醇、蘆丁和特女貞苷的色譜峰與相鄰峰達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，分離效果良好。1.紅景天苷；2.酪醇；3.蘆??；4.特女貞苷

2.3.2線性關(guān)系考察 分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品母液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL和2.00 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液。按照“2.1”色譜條件依次進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（μg·L-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。結(jié)果見表3。

2.3.3儀器精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.1”條色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，測(cè)得紅景天苷、酪醇、蘆丁和特女貞苷色譜峰峰面積的RSD分別為2.7%、2.8%、1.3%和0.5%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批貞芪扶正顆粒（批號(hào)：20201104），按“2.2.2”方法制備供試品溶液，平行制備6份，在“2.1”條色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算結(jié)果顯示，紅景天苷的平均含量為0.3173 mg·g-1，RSD為2.1%；酪醇的平均含量為0.0996 mg·g-1，RSD為0.3%；蘆丁的平均含量為0.3084 mg·g-1，RSD為0.7%；特女貞苷的平均含量為4.2947 mg·g-1，RSD為0.5%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批貞芪扶正顆粒（批號(hào)：20201104），室溫放置，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12和24 h，按“2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計(jì)算樣品中紅景天苷、酪醇、蘆丁和特女貞苷的RSD分別為2.2%、0.7%、0.6%和0.8%。結(jié)果表明樣品室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的貞芪扶正顆粒（批號(hào)：20201104）6份，每份約1.0 g，精密稱定。分別精密加入等量的對(duì)照品，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，在“2.1”條色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算得出4個(gè)成分的平均回收率分別為99.82%、99.90%、100.09%和100.41%；RSD分別為1.81%、2.51%、2.44%和1.80%。結(jié)果見表4。

2.4樣品含量測(cè)定 精密稱定貞芪扶正顆粒粉末2 g，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，在“2.1”條色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。采用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算紅景天苷、酪醇、蘆丁和特女貞苷的含量。結(jié)果見表5。

3討論

3.1提取條件的考察 首先對(duì)無水乙醇、水、甲醇三種提取溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)使用甲醇作提取溶劑時(shí)，提取出的供試液中四種成分的綜合含量最高；然后考察加熱回流和超聲波法提取兩種提取方式，提取時(shí)間為30 min，發(fā)現(xiàn)超聲波提取法提取出的供試液中四種成分含量高于加熱回流提取，接著采用不同時(shí)間超聲（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)超聲波處理30 min的供試液中四種成分含量高于10 min和20 min，但是超聲處理30 min、40 min和50 min的供試液中四種成分提取含量無明顯差異性。綜合以上情況本研究選擇超聲處理 30 min提取。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的考察 本實(shí)驗(yàn)分別考察了檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm、240 nm和250 nm時(shí)各標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm時(shí)，各峰的分離度較好，基線較平，而且峰面積也較大，所以本研究選擇在216 nm處對(duì)四種成分進(jìn)行含量檢測(cè)。

3.3流動(dòng)相的考察 本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水兩種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)的色譜分離情況，當(dāng)選擇甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)紅景天苷分離效果不佳，且雜峰較多；當(dāng)采用乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，四種化學(xué)成分均能夠達(dá)到良好分離，滿足分析要求。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水作為流動(dòng)相。

3.4不同廠家四種成分含量比較 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅景天苷含量最高的為廠家S1，S6次之，S5含量最低只有0.0036 mg·g-1，相差將近90倍；酪醇含量S6最高，S1次之，S5含量最低只有0.0099 mg·g-1，相差近27倍；蘆丁含量最高S3，S2次之，S5含量最低只有0.0127 mg·g-1，相差將近32倍；特女貞苷含量最高S1，S4次之，S5含量最低只有0.1832 mg·g-1，相差將近24倍。另外，也可以發(fā)現(xiàn)對(duì)于同一廠家（S2和S5）生產(chǎn)的貞芪扶正顆粒不同批次之間也是有一定差異。但從研究結(jié)果來看，S1、S6、S4廠家生產(chǎn)的貞芪扶正顆粒質(zhì)量較好，S5廠家產(chǎn)品最差。關(guān)于不同廠家生產(chǎn)的貞芪扶正顆粒藥效的評(píng)價(jià)，還需要進(jìn)一步通過藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

參考文獻(xiàn)

［1］黃鳳蕊，黎耀和.貞芪扶正顆粒對(duì)VIPD化療方案治療急性淋巴細(xì)胞白血病患者免疫功能及不良反應(yīng)的影響［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2022，41（11）：105-106.

［2］陳默，李青.貞芪扶正顆粒治療急性髓細(xì)胞白血病患兒應(yīng)用DA方案臨床療效觀察［J］.湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，23（5）：32-34.

［3］周熙祥，伍志偉，張錄梅，等.貞芪扶正顆粒輔助奧沙利鉑治療H_（22）移植瘤小鼠的療效及其對(duì)Bax、Bcl-2表達(dá)的影響［J］.中成藥，2021，43（7）：1746-1752.

［4］姜文月，韓淑麗，唐明哲，等.貞芪扶正顆粒HPLC指紋圖譜與其增強(qiáng)免疫功能的譜效關(guān)系分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2022，28（8）：123-130.

［5］胡妮娜，張曉娟.黃芪的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2021，38（1）：76-82.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典（一部） ［M］. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2020： 45.

［7］YANG Z， HUANG X， LAI W，et al. Synthesis and identification of a novel derivative of salidroside as a selective， competitive inhibitor of monoamine oxidase B with enhanced neuroprotective properties［J］. Eur J Med Chem， 2021（209）：112935.

［8］張柏生，李斌，李茜，等.不同產(chǎn)地酒女貞子紅景天苷、特女貞苷含量測(cè)定及聚類分析［J］.世界中醫(yī)藥，2021，16（3）：426-429.

［9］臧皓，徐倩，張露云，等.酪醇藥理作用研究的新進(jìn)展［J］.通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，38（12）：48-53.

［10］楊詩宇，宋基正，楊山景，等.蘆丁藥理作用與新劑型的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2022，39（10）：1360-1370.

［11］康凱，張靜嬌，趙月然，等.貞芪扶正顆粒（無糖型）HPLC指紋圖譜研究［J］.中國(guó)藥物評(píng)價(jià)，2017，34（1）：25-29，35.

［12］魏曉雨，姜國(guó)棟，陳泓，等.貞芪扶正顆粒的HPLC指紋圖譜研究［J］.中國(guó)藥房，2017，28（33）：4691-4694.

［13］王美慧，姜文月，高陸，等.不同廠家貞芪扶正顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)與藥效研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2020，31（2）：330-333.

（收稿日期：2022-09-08編輯：陶希睿）