沙夢(mèng)香 李聰穎 張藝 張靜

【摘要】目的：針對(duì)羌藥五轉(zhuǎn)七現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)缺乏問(wèn)題，對(duì)五轉(zhuǎn)七藥材進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。方法：對(duì)五轉(zhuǎn)七藥材進(jìn)行性狀、顯微及薄層色譜（TLC）定性鑒別；按《中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）》（四部）通則方法檢查藥材中的水分、總灰分、酸不溶性灰分，測(cè)定醇溶性浸出物的含量；采用HPLC法，以獐牙菜苷、馬錢(qián)苷酸、綠原酸為指標(biāo)，建立多成分含量測(cè)定方法。結(jié)果：10批五轉(zhuǎn)七藥材有相似的性狀及顯微特征；薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好；10批五轉(zhuǎn)七藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量分別為6.71%～9.36%、2.59%～6.56%、0.64%～2.59%、8.37%～13.55%；獐牙菜苷、馬錢(qián)苷酸、綠原酸線性關(guān)系范圍分別在101.05～606.3 μg·mL-1、26.9～323.7 μg·mL-1、5.06～101.2 μg·mL-1 （r=0.9995、r=1.0000、r=0.9999）線性關(guān)系良好，儀器精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率的RSD值均符合要求；3種成分含量分別為0.0172%～0.0611%、0.0043%～0.0405%、0.0956%～0.2234%。結(jié)論：基于研究結(jié)果，初步擬定羌藥五轉(zhuǎn)七中水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過(guò)10.0%、7.0%、3.0%，醇溶性浸出物不得低于8.0%，獐牙菜苷的含量不得低于0.10%。

【關(guān)鍵詞】羌藥五轉(zhuǎn)七；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；顯微鑒別；TLC；HPLC；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）10-0028-06

Study on? Quality Standard of Qiang Medicine WuzhuanqiSHA Mengxiang1，2LI Congying1，2ZHANG Yi1，2*ZHANG Jing1，2

1.School of Ethnic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China；

2.Academic Inheritance and Innovation Research Center of Ethnic Medicine，Chengdu University

of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，ChinaAbstract：Objective Aiming at the lack of the current standard of Qiang medicine “Wuzhuanqi”， study on the quality standard of Wuzhuanqi.Method To identify the characters， microscopic and TLC of Wuzhuanqi medicinal materials; According to the general principles of Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China （2020 Edition） （Part IV）， check the water， total ash and acid-insoluble ash in medicinal materials， and determine the content of alcohol-soluble extract; HPLC method was used to establish a multi-component content determination method with swertiamarin， loganin and chlorogenic acid as indicators.Result Ten batches of Wuzhuanqi medicinal materials have similar characters and microscopic characteristics; Thin-layer chromatographic spots are clear and the resolution is good; The contents of water， total ash， acid-insoluble ash and alcohol-soluble extract in 10 batches of Wuzhuanqi were 6.71%-9.36%，2.59%-6.56%， 0.64%-2.59% and 8.37%-13.55% respectively.The linear relationships of swertiamarin， loganic acid and chlorogenic acid were 101.05-606.3 μg·mL-1， 26.9-323.7 μg·mL-1 and 5.06-101.2 μg·mL-1（r=0.9995，r=1.0000，r=0.9999），respectively.The contents of three components are 0.0172%-0.0611%， 0.0043%-0.0405%， 0.0956%-0.2234% respectively.Conclusion Based on the results of this study， it is preliminarily determined that the water content， total ash content and acid-insoluble ash content of Qiang medicine Wuzhuanqi should not exceed 10.0%， 7.0% and 3.0% respectively， the alcohol-soluble extract should not be lower than 8.0%， and the content of Swertiamarin should not be lower than 0.10%.

Keywords：Qiang Medicine Wuzhuanqi; Quality Standards; Microscopic Identification; TLC; HPLC; Content Determination

五轉(zhuǎn)七是羌族地區(qū)常用的民族藥，羌語(yǔ)為“mo te be”，音譯為“莫喆·補(bǔ)惹”，也稱“吾落哈”，為忍冬科植物穿心莛子藨Triosteum himalayanum Wall.的干燥全草。夏、秋二季采挖，除去雜質(zhì)，洗凈，曬干用［1］。性寒，味苦，具有利尿消腫、理氣活血、調(diào)經(jīng)的功效，主治小便不通、浮腫、月經(jīng)不調(diào)、勞傷疼痛等［2］。在羌醫(yī)藥臨床應(yīng)用中，五轉(zhuǎn)七與其他草藥配伍常用于治療“筋骨疼痛，跌打損傷”。五轉(zhuǎn)七始載于《陜西中草藥》（異名：包谷花、鉆子七、包谷陀子、達(dá)對(duì)月草）［3］，在《羌族醫(yī)藥》［1］《中國(guó)民族藥辭典》［2］《中國(guó)植物志》［4］《中華本草》［5］《全國(guó)中草藥匯編》［6］中均有記載。

目前未有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)收載五轉(zhuǎn)七，缺乏質(zhì)量控制；文獻(xiàn)研究方面只對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了研究，環(huán)烯醚萜類、黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類、糖類等化學(xué)成分為其主要活性成分［7-8］?；诖?，在“四川省藥品監(jiān)督管理局中藥（民族藥）標(biāo)準(zhǔn)提升”項(xiàng)目中增加了五轉(zhuǎn)七質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期對(duì)該藥材的質(zhì)量進(jìn)行全面控制。

1儀器與材料

1.1儀器 島津2030型高效液相色譜儀、DHG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、FA1004型萬(wàn)分之一分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）、BSA124S型十萬(wàn)分之一分析電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］、SB-8200DTS型雙頻超聲儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司，功率 400 W，頻率 40 kHz）、UPH-I型超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2藥品與試劑 五轉(zhuǎn)七藥材采自四川甘孜州、阿壩州等地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院張藝研究員鑒定為忍冬科植物穿心莛子藨Triosteum himalayanum Wall.的干燥全草，其信息來(lái)源詳見(jiàn)表1。馬錢(qián)苷酸對(duì)照品（批號(hào)PS010047，純度≥98.5%）、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)PS010694，純度≥98.5%）、獐牙菜苷對(duì)照品（批號(hào)PS010483，純度≥99%），均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1性狀鑒別 本品根狀莖呈不規(guī)則團(tuán)塊狀，表面棕褐色，密生莖痕及疣狀突起。主根不明顯，側(cè)根較多，密生須根，表面棕褐色，外表皮易脫落，皮層呈淺黃棕色，不易折斷。莖表面紅棕色，被毛，易折斷，斷面中空。葉多皺縮，灰綠色，上表面被白色長(zhǎng)剛毛，下表面脈上毛較密。偶見(jiàn)核果，卵形，表面黑棕色或黃棕色，被毛。如圖1、圖2所示。

2.2顯微鑒別 本品粉末為棕褐色。淀粉粒團(tuán)多；導(dǎo)管常見(jiàn)，螺紋導(dǎo)管和孔紋導(dǎo)管交互存在；非腺毛較多，單細(xì)胞，多碎斷，呈柱形；草酸鈣簇晶常見(jiàn)，獨(dú)立存在或聚集在一起。如圖3所示。1.非腺毛;2.導(dǎo)管;3.草酸鈣簇晶;4.淀粉粒團(tuán)

2.3TLC鑒別 取10批五轉(zhuǎn)七藥材粉末1 g，加入甲醇25 mL，超聲（功率400 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液干，用3 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取對(duì)照品熊果酸適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502），吸取上述供試品溶液3 μL和對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲烷-冰醋酸（20∶8∶5∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)。如圖4所示。

2.4檢查 考慮到藥材來(lái)源的差異，本研究水分、總灰分和酸不溶性灰分以略高于最高測(cè)定值設(shè)限，醇溶性浸出物、含量測(cè)定以略低于最低測(cè)定值設(shè)限［10］。

2.4.1水分 取10批五轉(zhuǎn)七藥材粉末適量，精密稱定，按2020年版《中國(guó)藥典》［9］（四部）“通則0832水分測(cè)定法”項(xiàng)下 “烘干法”進(jìn)行測(cè)定，每批平行3次，取平均值。結(jié)果，10批五轉(zhuǎn)七藥材的水分含量為6.71%～9.36%，初步擬定限度不得過(guò)10.0%。五轉(zhuǎn)七藥材中水分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.2總灰分和酸不溶性灰分 取10批五轉(zhuǎn)七藥材粉末適量，精密稱定，按2020年版《中國(guó)藥典》［9］（四部）“通則2302灰分測(cè)定法”項(xiàng)下總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，每批平行3次，取平均值。結(jié)果，10批五轉(zhuǎn)七藥材的總灰分含量為2.59%～6.56%，規(guī)定限度不得過(guò)7.0%；酸不溶性灰分含量為0.64%～2.59%，初步擬定限度不得過(guò)3.0%。五轉(zhuǎn)七藥材中總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.3醇溶性浸出物測(cè)定 取10批五轉(zhuǎn)七藥材粉末各約2 g，按2020年版《中國(guó)藥典》［9］（四部）“通則2201浸出物測(cè)定法”項(xiàng)下醇溶性浸出物測(cè)定法（熱浸法）進(jìn)行測(cè)定，溶劑為50%乙醇，每批平行3次，取平均值。結(jié)果，10批五轉(zhuǎn)七藥材醇溶性浸出物的含量為8.37%～13.55%，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，初步擬定限度不得少于8.0%。五轉(zhuǎn)七藥材中醇溶性浸出物測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5馬錢(qián)苷酸、綠原酸和獐牙菜苷含量測(cè)定

2.5.1混合對(duì)照品溶液的制備 取馬錢(qián)苷酸、綠原酸、獐牙菜苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加甲醇定容，制成上述3個(gè)成分質(zhì)量濃度分別為0.678 mg·mL-1、0.630 mg·mL-1、1.176 mg·mL-1的混合對(duì)照品貯備液。置4 ℃冰箱中保存，備用。

2.5.2供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3色譜條件 色譜柱：賽默飛Hypersilgold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）—0.4%磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～22 min，8%A→8%A；22～23 min，8%A→10%A； 23～35 min，10%A→10%A）。檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm；流速：1.0 mL.min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按獐牙菜苷計(jì)應(yīng)大于3000，HPLC圖如圖5所示。A.對(duì)照品;B.樣品;C.空白溶劑;1.馬錢(qián)苷酸;2.綠原酸;3.獐牙菜苷

2.5.4線性關(guān)系及定量限、檢測(cè)線考察 將“2.5.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液按不同的倍數(shù)稀釋。稀釋液分別按色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定并計(jì)算平均峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性關(guān)系考察。結(jié)果，各待測(cè)成分線性關(guān)系均良好（r>0.9995）。配制一個(gè)較低濃度的對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，分別以信噪比3∶1、10∶1測(cè)定檢測(cè)限、定量限。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.5精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，馬錢(qián)苷酸，綠原酸，獐牙菜苷峰面積的RSD分別為0.95%、0.86%、0.72%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次五轉(zhuǎn)七藥材粉末共6份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各成分含量。結(jié)果顯示，馬錢(qián)苷酸，綠原酸，獐牙菜苷含量的RSD分別為0.74%、0.49%、0.83%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取五轉(zhuǎn)七藥材粉末（過(guò)四號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0 h、6 h、12 h、18 h、20 h、24 h時(shí)，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，馬錢(qián)苷酸、綠原酸、獐牙菜苷峰面積的RSD分別為0.74%、0.87%、0.68%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批五轉(zhuǎn)七樣品6份，每份0.25 g，精密稱定，分別加入藥材中獐牙菜苷含量的約50%的對(duì)照品溶液，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，馬錢(qián)苷酸、綠原酸、獐牙菜苷的平均加樣回收率分別為106.32%、96.70%、98.54%，RSD分別為1.21%、0.58%、1.62%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5.9樣品含量測(cè)定 分別取10批五轉(zhuǎn)七藥材粉末適量，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各成分的含量。結(jié)果10批五轉(zhuǎn)七樣品中，馬錢(qián)苷酸、綠原酸、獐牙菜苷的含量分別為0.0172%～0.0611%、0.0043%～0.0405%、0.0956%～0.2234%。結(jié)果見(jiàn)表5。

3討論

3.1TLC鑒別與含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇 文獻(xiàn)［11］報(bào)道，穿心莛子藨主要化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜類、黃酮類等，熊果酸具有清熱、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗?jié)?、降低血糖、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)［11］，獐牙菜苷為環(huán)烯醚萜類成分，其具有保護(hù)骨關(guān)節(jié)、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝等藥理活性作用［12］；馬錢(qián)苷酸具有抗炎等藥理作用［13］；綠原酸具有抗菌、抗炎、抗誘變等藥理作用［14］，與五轉(zhuǎn)七“利尿消腫，理氣活血”的主要功效相關(guān)。研究前也嘗試過(guò)鑒別及測(cè)定其他成分，但結(jié)果不理想，最終確定選用熊果酸作為五轉(zhuǎn)七藥材TLC鑒別的指標(biāo)成分，選擇獐牙菜苷作為該藥材含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.2TLC條件篩 選本研究前期對(duì)不同的濕度（32 ％RH和88 ％RH）以及溫度（4 ℃和35 ℃）的耐用性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，不同溫度下Rf值會(huì)隨溫度的升高而有所增大，濕度對(duì)薄層色譜斑點(diǎn)無(wú)明顯影響。此外還對(duì)不同展開(kāi)系統(tǒng)［二氯甲烷—甲醇—冰醋酸（10∶1.6∶0.1）、環(huán)己烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶6∶1）、環(huán)己烷—二氯甲烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）］、不同顯色條件和觀察方法［5%香草醛硫酸、10%硫酸乙醇（日光、紫外光燈（365 nm）、3%三氯化鋁（日光、紫外光燈（365 nm）］進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，以環(huán)己烷—二氯甲烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）為展開(kāi)劑，以10%硫酸乙醇為顯色劑，在紫外光燈（365 nm）條件下，供試品與對(duì)照品色譜在相應(yīng)位置上顯示相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，Rf值適中，無(wú)拖尾，故以此為展開(kāi)條件。

3.3HPLC供試品溶液制備方法考察 本研究前期對(duì)不同的提取溶媒（95%、70%、50%、30%乙醇，70%、50%、30%甲醇）、不同提取方式（超聲、回流）、不同溶媒用量（25 mL、50 mL、100 mL）、不同提取時(shí)間（15 min、30 min、60 min）等因素進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，以甲醇為提取溶媒時(shí)，獐牙菜苷、馬錢(qián)苷酸、綠原酸干擾峰少且峰形較好，故選擇甲醇作為提取溶媒；兩種提取方法均能較好地提取出有效成分，考慮到操作簡(jiǎn)便易行，選擇超聲作為提取方法；溶媒用量為25 mL，提取30 min時(shí)，獐牙菜苷、馬錢(qián)苷酸、綠原酸提取效率較高。

3.4HPLC色譜條件的選擇 本研究通過(guò)對(duì)馬錢(qián)苷酸、綠原酸、獐牙菜苷3種成分在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到3種成分的最大吸收波長(zhǎng)依次為236 nm、327 nm、246 nm，經(jīng)過(guò)各波長(zhǎng)色譜峰比較，在240 nm波長(zhǎng)時(shí)色譜圖峰形最好，分離度均大于1.5且基線平穩(wěn)，由此選擇240 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。此外，本研究也對(duì)不同流動(dòng)相（甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液）、不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）、不同流速（0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.2 mL·min-1、不同色譜柱（Chromsil C18、 HypersilgoldC18、 Zorbax Eclipse XDB-C18）等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，以甲醇-0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)獐牙菜苷、馬錢(qián)苷酸、綠原酸有較好的分離度，該方法系統(tǒng)耐用性良好。

3.5含量測(cè)定結(jié)果分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，五轉(zhuǎn)七藥材中獐牙菜苷含量最高（獐牙菜苷、馬錢(qián)苷酸、綠原酸的平均含量分別為13.51 mg·g-1、4.00 mg·g-1、1.87 mg·g-1），占測(cè)定的3種成分總含量的64.60%。綜合考慮獐牙菜苷成分的藥理活性作用及五轉(zhuǎn)七藥材的功效，選擇獐牙菜苷作為該藥材的含量限定指標(biāo)成分。

4結(jié)論

根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》［9］（四部）通則中關(guān)于中藥材質(zhì)量控制的要求，本研究對(duì)五轉(zhuǎn)七藥材的性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、水分、酸不溶性灰分和浸出物、含量測(cè)定進(jìn)行系統(tǒng)研究，為羌藥五轉(zhuǎn)七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，根據(jù)研究結(jié)果，初步擬定了羌藥五轉(zhuǎn)七中水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過(guò)10.0%、7.0%、3.0%，醇溶性浸出物不得低于8.0%，獐牙菜苷的含量不得低于0.10%。所建方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，為五轉(zhuǎn)七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。本研究不足之處在于樣品批次較少，后續(xù)將繼續(xù)采集其他不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行研究，以建立更加完善的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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（收稿日期：2022-09-02編輯：陶希睿）