王曉婭,施春英,宋思奇,李玲

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系,山東 青島 266071)

先天畸形、嚴重創(chuàng)傷或腫瘤等往往會導(dǎo)致膀胱結(jié)構(gòu)缺失及功能障礙,需要行膀胱重建手術(shù)才能恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和功能。目前,自體胃腸道是膀胱重建術(shù)最常用的重建材料,但該手術(shù)術(shù)后伴隨多種并發(fā)癥,如酸堿代謝紊亂、黏液分泌、結(jié)石等[1-2]。因此,探索新的膀胱重建材料具有重要的臨床意義。膀胱脫細胞基質(zhì)(BAM)是良好的膀胱再生修復(fù)材料,可為組織再生提供一定的力學(xué)支持,還可為細胞的生長、黏附、遷移提供支架[3]。前期研究證實,靶向堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)可特異性與膠原材料結(jié)合,促進大鼠、狗等臨床前動物膀胱的再生修復(fù)[4-5],但其重建膀胱中心區(qū)的平滑肌再生及膀胱功能仍不足。研究表明,尿源干細胞(USCs)更易于向膀胱上皮及膀胱平滑肌組織分化,是組織工程膀胱良好的理想種子細胞[6-9]。本文對靶向bFGF、USCs復(fù)合BAM支架對損傷膀胱的再生能力的影響進行了研究?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD雄性大鼠(體質(zhì)量為200～260 g,8～10周齡),購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。REGM添加劑以及RE細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液均購自Lonza公司;高糖DMEM培養(yǎng)液購自HyClone公司;胎牛血清以及GlutaMAX均購自Gibco公司;非必需氨基酸購自Procell公司;青霉素、鏈霉素、bFGF、EGF以及PDGF-AB購自Peprotech公司;抗α-SMA兔單克隆抗體、抗-vWF兔單克隆抗體以及山羊抗兔多克隆二抗購自Abcam公司;抗-Desmin兔單克隆抗體購自Proteintech公司;抗-CD31兔單克隆抗體購自Abclone公司;抗熒光衰減封片劑(含有DAPI)購自中杉金橋;40 g/L多聚甲醛固定液和磷酸鹽緩沖液(PBS)粉末購自Solarbio公司。

1.2 實驗方法

1.2.1BAM的制備 無菌條件下取豬的膀胱,PBS清洗,分別經(jīng)5 g/L的SDS、體積分數(shù)0.01的TritonX-100及DNA酶/RNA酶處理24 h,無菌純凈水清洗72 h,凍干制備BAM支架材料,鈷60輻照滅菌。應(yīng)用掃描電鏡觀察其脫細胞效果及相應(yīng)組織的結(jié)構(gòu)。

1.2.2靶向bFGF蛋白制備 根據(jù)相關(guān)文獻報道的方法[10],將構(gòu)建的原核表達載體pET28a-bFGF以及pET28a-CBD-bFGF分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,誘導(dǎo)培養(yǎng),超聲破碎菌體,離心收集上清。以鎳柱在AKTA purifier上純化分離bFGF和膠原靶向bFGF。測定其濃度與純度后,用0.2 μm針頭過濾器過濾,凍干后-80 ℃保存。

1.2.3人USCs的分離培養(yǎng) 無菌條件下收集成人中段尿,裝入50 mL離心管中,以1 500 r/min離心10 min,吸掉上清保留1 mL尿液,加PBS洗滌后800 r/min離心10 min,加USCs原代培養(yǎng)液重懸,加入明膠包被好的12孔板中培養(yǎng),第3天時換成USCs完全培養(yǎng)液培養(yǎng)(由RE擴增培養(yǎng)液和MC擴增培養(yǎng)液按照1∶1混合而成。RE擴增培養(yǎng)液:將REGM添加劑加入RE細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中;MC擴增培養(yǎng)液:高糖DMEM添加體積分數(shù)0.10的胎牛血清、體積分數(shù)0.01的GlutaMAX、體積分數(shù)0.01的非必需氨基酸、1×105U/L青霉素、1×105μg/L鏈霉素、5 μg/L bFGF、5 μg/L PDGF-AB和5 μg/L EGF)。細胞在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng),48～72 h后換液,以后每2 d換液1次,觀察培養(yǎng)板細胞的生長情況,達80%融合時進行傳代培養(yǎng),細胞傳至第3代時顯微鏡下拍照觀察USCs的形態(tài)。

1.2.4實驗分組及處理 24只雄性SD大鼠隨機分為BAM組(B組)、BAM/USCs組(C組)、BAM/USCs/靶向bFGF組(D組)和假手術(shù)組(A組),每組6只。各組支架處理方法如下:BAM組加少量PBS;BAM/USCs組將1×106密度的USCs負載至BAM材料上;BAM/USCs/靶向bFGF組將1×106密度的USCs和10 μmol/L的靶向bFGF共同負載至BAM材料上。除假手術(shù)組外,其他3組進行膀胱半切術(shù)。戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉后,大鼠腹部正中切口,暴露膀胱,切除大鼠上半部分膀胱,將各組支架材料用5-0可吸收縫合線縫合于切除膀胱的位置,并用3-0不可吸收縫合線在吻合口的前、后、左、右(漿膜面)各縫1針作為標記。經(jīng)尿道插管向膀胱內(nèi)注入生理鹽水沖洗膀胱,并檢查是否有吻合口漏。

1.2.5尿動力學(xué)檢測 術(shù)后90 d對4組大鼠行尿動力學(xué)檢測。大鼠腹腔注射烏拉坦(1 g/kg)麻醉,仰臥位暴露膀胱,在膀胱頂剪一小口,將PE-50聚乙烯導(dǎo)管一端插入,荷包縫合法固定;將導(dǎo)管的另一端通過三通接頭連接到壓力傳感器和輸液泵。生理鹽水以15 mL/h的恒定流量注射。使用多通道信號處理系統(tǒng)對連續(xù)尿動力學(xué)曲線進行數(shù)字化和記錄,評估膀胱最大容量和順應(yīng)性。膀胱順應(yīng)性=膀胱容量變化/逼尿肌壓力變化。

1.2.6組織學(xué)觀察 尿動力學(xué)檢測后對膀胱的大體形態(tài)進行拍照,之后處死大鼠,取下膀胱,置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,制備5 μm石蠟切片。取部分切片進行HE染色,鏡下觀察膀胱修復(fù)再生情況。取剩下的切片進行免疫熒光染色,使用抗-α-SMA(1∶400稀釋)和抗-Desmin(1∶100稀釋)抗體檢測膀胱平滑肌再生情況,抗-CD31和抗-vWF(均1∶100稀釋)檢測血管再生情況。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件計算α-SMA、CD31、Desmin和vWF的陽性面積比。200倍顯微鏡下,每張切片隨機取6個視野,觀察染色陽性面積。陽性面積比=(染色陽性面積/視野總面積)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 BAM形態(tài)與電鏡掃描圖像及USCs的形態(tài)學(xué)觀察

BAM為白色外觀、厚 1 mm、直徑1 cm的圓形貼片,電鏡掃描顯示其為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1A～C)。倒置顯微鏡下觀察,3代USCs形態(tài)呈米粒狀或短梭形。見圖1D。

A:厚度測量;B:BAM直徑測量圖;C:BAM電鏡掃描圖,400倍;D:3代人USCs形態(tài),40倍。

2.2 各組膀胱尿動力學(xué)比較

各組最大膀胱容量比較差異有顯著意義(F=395.000,P<0.01),BAM組與BAM/USCs組最大膀胱容量差異無顯著性(P>0.05),BAM/USCs/靶向bFGF組最大膀胱容量較BAM/USCs組顯著增加(t=12.790,P<0.01)。各組膀胱順應(yīng)性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=345.800,P<0.01),BAM組與BAM/USCs組相比較、BAM/USCs組與BAM/USCs/靶向bFGF組相比膀胱順應(yīng)性差異均有顯著性(t=4.661、10.940,P<0.01)。見表1。

表1 各組尿動力學(xué)指標結(jié)果比較

2.3 組織學(xué)形態(tài)

2.3.1大體形態(tài) 大體觀察,各組均未發(fā)現(xiàn)殘留的支架材料。BAM組和BAM/USCs組大鼠膀胱與周圍組織黏附較多,其與周圍膀胱組織的整合能力較BAM/USCs/靶向bFGF組差,BAM/USCs/靶向bFGF組的再生部位與本地膀胱融合得更好。此外,在BAM組內(nèi)的1只大鼠膀胱內(nèi)發(fā)現(xiàn)結(jié)石。見圖2A～D。

A、E:BAM組;B、F:BAM/USCs組;C、G:BAM/USCs/靶向bFGF組;D、H:假手術(shù)組。HE染色,200倍。

2.3.2HE染色表現(xiàn) HE染色結(jié)果表明,各實驗組再生區(qū)域移行上皮細胞層連續(xù)性好,BAM組膀胱平滑肌再生明顯較差,無完整正常形態(tài)肌層組織再生;BAM/USCs組可見平滑肌及新生血管形成,未發(fā)現(xiàn)腫瘤異變等細胞;BAM/USCs/靶向bFGF組膀胱平滑肌再生優(yōu)于BAM/USCs組,有較為完整的各層平滑肌結(jié)構(gòu),但肌纖維排列與假手術(shù)組相比較紊亂。見圖2E～H。

2.3.3免疫熒光染色 各組平滑肌和血管再生的免疫熒光觀察見圖3。單因素方差分析顯示,各組α-SMA陽性面積比、Desmin陽性面積比、CD31陽性面積比、vWF陽性面積比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=65.870～619.100,P<0.01),其中的BAM組與BAM/USCs組相比較、BAM/USCs組與BAM/USCs/靶向bFGF組相比較,各指標差異均有顯著性(t=4.381～21.810,P<0.05)。見表2。

A、E、I和M:BAM組;B、F、J和N:BAM/USCs組;C、G、K和O:BAM/USCs/靶向bFGF組;D、H、L和P:假手術(shù)組。免疫熒光染色,200倍。

表2 各組α-SMA、Desmin、CD31和vWF陽性面積比比較

3 討 論

目前,組織工程支架構(gòu)建時考慮的因素一般有支架材料、種子細胞和細胞生長調(diào)節(jié)因子[11]。不同的可降解材料已被研究用于膀胱再生,但修復(fù)效果有限。BAM由于其天然來源,具有良好的形態(tài)學(xué)特征,富含膠原蛋白,很好地保存了生物活性因子,因此,應(yīng)用BAM制備的支架材料具有優(yōu)越的生物相容性、良好的生物降解性和低抗原性。相關(guān)研究顯示,USCs具有更易向膀胱平滑肌及上皮分化的特點[11-12]。最初,評估非種子細胞BAM作為膀胱植入物的大多數(shù)研究均觀察到尿路上皮形成,但伴隨著弱的肌肉層以及移植物收縮和瘢痕形成[12]。應(yīng)用干細胞移植增強膀胱細胞再生是一種全新的方法,干細胞可以直接通過膀胱分化轉(zhuǎn)為膀胱細胞,或間接通過分泌生長因子來促進細胞再生[13]。USCs是一種容易獲得的自體干細胞,與其他可用于組織再生的干細胞類型相比,具有更易向膀胱平滑肌及上皮分化的特點[14]。外源性生長因子通過增強細胞再生和新生血管來促進膀胱再生,但是由于它們的半衰期短,擴散迅速,不易控制[13]。由膠原結(jié)合肽與bFGF融合產(chǎn)生的靶向bFGF不僅能有效阻止bFGF向周圍組織的無效擴散,而且能與BAM的主要成分Ⅰ型膠原結(jié)合,在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出良好的bFGF生物活性[15]。

本實驗對靶向bFGF、USCs復(fù)合BAM材料在大鼠膀胱重建中的作用進行了研究,術(shù)后90 d,尿動力學(xué)檢測結(jié)果表明,BAM/USCs/靶向bFGF組膀胱最大容量與膀胱順應(yīng)性均明顯高于BAM/USCs組和BAM組;HE染色結(jié)果表明,BAM/USCs/靶向bFGF組顯示出更好的材料降解,并更好地融入鄰近組織,再生部位與周圍組織黏連較少。

平滑肌在膀胱儲尿排尿過程中具有重要作用,在膀胱再生時膀胱平滑肌的再生程度是評估重建膀胱的重要指標之一[16]。本文研究結(jié)果顯示,BAM/USCs/靶向bFGF組再生雙層縱向圓形肌束平滑肌與正常組織相似;BAM/USCs組可見再生縱向排列的平滑肌束,但在BAM組僅可見少量紊亂的平滑肌樣組織和纖維化形成。表明種植USCs的BAM支架可促進膀胱平滑肌再生,靶向bFGF與BAM/USCs支架的特異性結(jié)合可以更好地促進膀胱平滑肌再生。

血管化是組織工程和再生的關(guān)鍵過程。新血管的快速形成能為移植物提供氧氣和營養(yǎng),為其存活提供條件[17]。本文研究結(jié)果顯示,BAM/USCs/靶向bFGF組的血管密度明顯高于其他兩組,其原因可能是靶向bFGF的持續(xù)釋放能刺激內(nèi)皮細胞浸潤形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。

綜上所述,將USCs種植到結(jié)合靶向bFGF的BAM支架材料上行鼠模型膀胱重建,與未結(jié)合靶向bFGF的BAM支架相比較,BAM/USCs/靶向bFGF支架能有效地促進膀胱再生。提示BAM/USCs/靶向bFGF支架可用于膀胱重建,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。