穆妮熱·賈帕爾,阿依恒·曲庫爾汗，雍 軍，皮力東·庫亞西，穆扎排爾·米爾扎克木 （新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，新疆 烏魯木齊 830000）

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，飲酒和吸煙是喉癌的主要誘因，研究發(fā)現(xiàn)在過去30年里，早期喉癌患者主要通過手術及放化療手段進行治療，但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時為中晚期，治療效果不佳，導致患者的生存率有所下降[1-2]。因此，找到喉癌靶向治療的有效標志物至關重要。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤樣本被大量的炎癥細胞浸潤，如I型輔助性T淋巴細胞、調節(jié)性T細胞和腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)[3]。TAMs是腫瘤微環(huán)境中至關重要的免疫細胞，與腫瘤不良預后相關，根據(jù)巨噬細胞的激活狀態(tài)可分為M1表型和M2表型。一般情況下，M1極化的巨噬細胞能夠分泌促炎細胞因子來消滅腫瘤細胞，以白細胞介素10（interleukin 10，IL-10）和精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）為主要標記物，參與血管生成和腫瘤進展[4]。TAMs主要屬于M2極化的巨噬細胞，可促進腫瘤生長、侵襲和轉移[5-6]，在腫瘤進展中起重要作用，但其在喉癌發(fā)展中的分子機制尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)與多種病理過程密切相關，特別是腫瘤發(fā)生[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DLX6-AS1作為一種新型的lncRNA參與了肺癌、胃癌、膀胱癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展[8-10]，然而lncRNA DLX6-AS1對喉癌發(fā)展的影響及其作用機制尚不明確，因此本研究深入探討了lncRNA DLX6-AS1在喉癌細胞發(fā)展中的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

人喉表皮樣癌細胞Hep-2購自中國科學院上海細胞庫。qRT-PCR儀器購自西安天隆生物科技有限公司，酶標儀購自美國賽默飛世爾科技有限公司，細胞培養(yǎng)箱購自上海航佩儀器有限公司。Transwell Insert小室(膜孔徑為0.4 μm）購自美國Corning公司，lncRNA DLX6-AS1干擾質粒（si-lncRNA DLX6-AS1）及其陰性對照(si-NC)、lncRNA DLX6-AS1過表達質粒(pcDNA-lncRNA DLX6-AS1)及其過表達對照[pcDNA-3.1(+)]、miR-144抑制劑（miR-144 inhibitor）和miR-144模擬物（miR-144 mimics）購自上海吉瑪基因有限公司，CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和Taq-Man microRNA購自杭州沃森生物技術有限公司，CD163、E-cadherin和N-cadherin抗體購自英國Abcam公司，LipofectamineTM2000購自美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 人外周血單核細胞(peripheral blood mono?nuclear cells,PBMCs)和TAMs的分離

本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準（K202104-05）。采集健康志愿者新鮮外周血，使用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)密度梯度離心法分離PBMCs，將稀釋的全血加入分離層的上層，離心后吸出囊泡細胞，PBS沖洗，沉淀重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1.5 h，收集貼壁細胞。將新鮮的腫瘤組織用膠原酶消化得到單細胞懸液，抗CD11b磁珠孵育。使用MACS-LS色譜柱分離CD11b陽性細胞。細胞培養(yǎng)1 h，采用流式細胞術檢測CD11b陽性的TAMs。

1.3 細胞培養(yǎng)和細胞轉染

人喉表皮樣癌細胞Hep-2在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的濕室中。將人單核細胞白血病細胞THP-1置于含10%胎牛血清、10 000 U/mL青霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 000 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將THP-1細胞與100 ng/mL佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）孵育48 h，誘導THP-1向巨噬細胞分化后，用白細胞介素4（interleu?kin 4，IL-4）20 ng/mL繼續(xù)誘導THP-1細胞，使其分化為M2型巨噬細胞。共培養(yǎng)實驗中，THP-1細胞(M2型巨噬細胞)接種于Transwell Insert小室中，Hep-2細胞在底孔中培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞分為Control組（THP-1與Hep-2細胞共培養(yǎng)，Hep-2細胞不作任何處理）和IL-4組（20 ng/mL IL-4作用于THP-1細胞，THP-1與Hep-2細胞共培養(yǎng)）。為了檢測下調lncRNA DLX6-AS1對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響，將IL-4組細胞分為IL-4+si-NC組（Hep-2細胞轉染4 μg si-NC質粒）與IL-4+si-DLX6-AS1組（Hep-2細胞轉染4 μg si-DLX6-AS1質粒）。為了檢測lncRNA DLX6-AS1與miR-144的關系，將Control組細胞分為DLX6-AS1 WT+mimics NC組（Hep-2細胞轉染4 μg lncRNA DLX6-AS1 WT+mimics NC質粒）、DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics組（Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics質粒）、DLX6-AS1 MUT+mimics NC組（Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 MUT+mimics NC質粒）、DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics組（Hep-2細胞轉染4 μg DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics質粒）。為了檢測上調lncRNA DLX6-AS1通過miR-144對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響，將IL-4組細胞分為pcDNA-3.1(+)+mimics NC組[Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-3.1(+)+mimics NC質粒]、pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組（Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC質粒）、pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組（Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics質粒）、pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組（Hep-2細胞轉染4 μg pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics質粒）。為了檢測上調miR-144對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響，將IL-4組細胞分為IL-4+mimics NC組（Hep-2細胞轉染4 μg mim?ics NC質粒）、IL-4+miR-144 mimics組（Hep-2細胞轉染4 μg miR-144 mimics質粒）。用LipofectamineTM2000將質粒共轉染到細胞中。

1.4 qRT-PCR檢測lncRNA DLX6-AS1、miR-144、IL-10和Arg-1的表達

分離總RNA，逆轉錄酶反應合成cDNA。采用TaqMan Universal Master Mix Ⅱ和Taq-Man microRNA進行qRT-PCR。以U6或GAPDH分別作為內源對照，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測CD163、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達

提取的40 μg蛋白經SDS-PAGE轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂乳阻斷，與抗CD163（1∶1 000）、E-cadherin（1∶5 000）、N-cadherin（1∶6 000）和GAPDH（1∶4 000）的一抗于4 ℃孵育12 h，用二抗室溫孵育2 h，對免疫復合物進行可視化檢測。

1.6 CCK-8實驗檢測Hep-2細胞增殖活力

與THP-1細胞(M2型巨噬細胞)共培養(yǎng)48 h后，收集Hep-2細胞，接種于96孔板。在每孔中加入100 μL CCK-8，置于細胞培養(yǎng)箱孵育4 h，按說明書測定細胞增殖活力。

1.7 Transwell實驗檢測Hep-2細胞侵襲數(shù)目

在Transwell上腔室中添加200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)Hep-2細胞(4×104細胞)。將含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下腔，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，對侵襲的細胞進行固定和結晶紫染色，隨機選取6個區(qū)域計數(shù)侵襲的細胞。

1.8 雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定熒光素酶活性

使用在線軟件miRcode進行生物信息學分析，預測lncRNA DLX6-AS1與靶基因miR-144的結合位點。Hep-2細胞置于24孔板過夜。用LipofectamineTM2000分別將DLX6-AS1 WT+mimics NC、DLX6-AS1 WT+miR-144 mimics、DLX6-AS1 MUT+mimics NC和DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics質粒共轉染至Hep-2細胞，48 h后檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行分析，結果以3次重復獨立實驗的均數(shù)±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA DLX6-AS1與miR-144在PBMCs與TAMs中的表達

與PBMCs相比，TAMs中IL-10和Arg-1的mRNA表達明顯升高（P<0.01），見圖1a。與PBMCs相比，TAMs中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1表達顯著升高（P<0.01），miR-144表達顯著降低（P<0.01），見圖1b。

圖1 qRT-PCR檢測PBMCs和TAMs中IL-10、Arg-1、lncRNA DLX6-AS1和miR-144的表達

2.2 下調lncRNA DLX6-AS1抑制IL-4誘導的巨噬細胞M2極化

qRT-PCR結果顯示，與Control組相比，IL-4組THP-1巨噬細胞的lncRNA DLX6-AS1 mRNA表達顯著上調（P<0.01）；與IL-4+si-NC組相比，IL-4+si-DLX6-AS1組THP-1巨噬細胞的lncRNA DLX6-AS1 mRNA表達顯著下調（P<0.01），見圖2a。與Control組相比，IL-4組THP-1巨噬細胞IL-10和Arg-1的mRNA表達顯著上調（P<0.01）；與IL-4+si-NC組相比，IL-4+si-DLX6-AS1組THP-1巨噬細胞IL-10和Arg-1的mRNA表達則顯著下調（P<0.01），見圖2b、c。在THP-1巨噬細胞中，與Control組相比，IL-4組M2巨噬細胞標志物CD163蛋白的表達顯著增加（P<0.01）；與IL-4+si-NC組相比，IL-4+si-DLX6-AS1組CD163蛋白的表達顯著降低（P<0.01），見圖2d、e。

圖2 下調lncRNA DLX6-AS1抑制IL-4誘導的巨噬細胞M2極化

2.3 下調lncRNA DLX6-AS1抑制巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

CCK-8實驗結果顯示，與Control組相比，IL-4組Hep-2細胞活力顯著增加（P<0.05）；與IL-4+si-NC組相比，IL-4+si-DLX6-AS1組Hep-2細胞活力顯著下降（P<0.05），說明巨噬細胞M2極化促進了Hep-2細胞增殖，見圖3a。與Control組相比，IL-4組Hep-2細胞侵襲數(shù)目明顯增加（P<0.01），N-cadherin表達顯著上調（P<0.01），E-cadherin表達顯著下調（P<0.01）；與IL-4+si-NC組相比，IL-4+si-DLX6-AS1組Hep-2細胞侵襲數(shù)目明顯減少（P<0.01），N-cadherin表達顯著下調（P<0.01），E-cadherin表達顯著上調（P<0.01），見圖3b~e。

圖3 下調lncRNA DLX6-AS1抑制巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

2.4 lncRNA DLX6-AS1可與miR-144相互作用

使用在線軟件miRcode進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA DLX6-AS1與miR-144之間存在潛在的結合位點（圖4a）。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測顯示，lncRNA DLX6-AS1與miR-144之間存在直接相互作用，與DLX6-AS1 WT+mimics NC組相比，DLX6-AS1-WT+miR-144 mimics組熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），與 DLX6-AS1 MUT+mimics NC組相比，DLX6-AS1 MUT+miR-144 mimics組熒光素酶活性無顯著變化（P>0.05）,圖4b。

圖4 lncRNA DLX6-AS1與miR-144的靶點預測和相互關系分析

2.5 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進巨噬細胞M2極化

qRT-PCR結果顯示，與Control組相比，IL-4組THP-1巨噬細胞中的miR-144表達水平降低（P<0.01），與IL-4+mimics NC組相比，IL-4+miR-144 mimics組THP-1巨噬細胞中的miR-144 mRNA表達水平顯著上調（P<0.01），見圖5a。IL-4處理THP-1巨噬細胞后，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組細胞內IL-10和Arg-1的mRNA表達以及CD163蛋白表達顯著上調（P<0.01）；與pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組相比，pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組細胞內L-10和Arg-1的mRNA表達以及CD163蛋白表達顯著上調（P<0.01），見圖5b~e。

圖5 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進巨噬細胞M2極化

2.6 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

IL-4處理THP-1巨噬細胞后，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-DLX6-AS1+mimics NC組Hep-2細胞活力及細胞侵襲數(shù)目顯著增加（P<0.01），N-cadherin表達顯著上調（P<0.01），E-cadherin表達顯著下調（P<0.01）；與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組Hep-2細胞活力顯著下降（P<0.01），細胞侵襲數(shù)目顯著減少（P<0.01），N-cadherin表達顯著下調（P<0.01），E-cadherin表達顯著上調（P<0.01）；與pcDNA-3.1(+)+miR-144 mimics組相比，pcDNA-DLX6-AS1+miR-144 mimics組Hep-2細胞活力及細胞侵襲數(shù)目顯著增加（P<0.01），N-cadherin表達顯著上調（P<0.01），E-cadherin表達顯著下調（P<0.01），見圖6。

圖6 過表達lncRNA DLX6-AS1通過miR-144促進Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化

3 討論

有研究表明，在前列腺癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥中，巨噬細胞極化均與預后不良具有很強的相關性[11-13]。TAMs參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和腫瘤血管生成。李旭等[12]報道TAMs可通過促進MCF-7細胞發(fā)生上皮間質轉化進而促進乳腺癌的浸潤轉移。由于TAMs主要為M2表型，有研究表明，來自單核細胞的M2型巨噬細胞比M1型巨噬細胞更能促進腫瘤的生長和侵襲[13]。M2型巨噬細胞可明顯減少依托泊苷誘導的癌細胞凋亡，而與M1型巨噬細胞共培養(yǎng)的THP-1細胞凋亡顯著增加[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞依賴于M2型巨噬細胞來源的外泌體調節(jié)結直腸癌細胞遷移和侵襲；同時，M2型巨噬細胞來源的外泌體還可促進結腸癌細胞的遷移和侵襲[15]。因此，本研究深入探討了M2型巨噬細胞在喉癌細胞發(fā)展過程中的生物學功能，結果發(fā)現(xiàn)，THP-1巨噬細胞衍生的M2型巨噬細胞進一步促進了Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化。

lncRNA通過調節(jié)人單核細胞/巨噬細胞的分化和極化，在多種病理過程中發(fā)揮調節(jié)作用。Zeng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，M2型腫瘤相關巨噬細胞分泌的表皮生長因子通過激活EGFR-ERK信號通路和抑制lncRNA LIMT表達促進上皮性卵巢癌轉移。M2型巨噬細胞來源的外泌體lncRNA AFAP1-AS1和microRNA-26a會影響食管癌細胞的遷移和轉移[17]。此外，lncRNA可能通過調節(jié)單核細胞/巨噬細胞極化而發(fā)揮致癌或抑癌的作用。lncRNA COX-2可通過改變M1/M2巨噬細胞極化來阻止肝癌的免疫逃逸和轉移[18]。lncRNA LINC00662可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進M2型巨噬細胞極化和肝癌進展[19]。然而，目前關于lncRNA對喉癌進展中巨噬細胞極化的作用和機制的研究還很有限。本研究首先用qRT-PCR實驗檢測了lncRNA DLX6-AS1在PBMCs與TAMs中的差異表達，結果發(fā)現(xiàn)與PBMCs相比，TAMs中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1表達顯著升高。隨后我們使用干擾技術下調了lncRNA DLX6-AS1的表達，進一步分析了lncRNA DLX6-AS1的作用機制，結果表明下調lncRNA DLX6-AS1表達可抑制IL-4誘導的THP-1巨噬細胞M2極化。本研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞進一步促進了Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化，而下調lncRNA DLX6-AS1表達對巨噬細胞M2極化誘導的Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化的影響尚不明了，因此我們繼續(xù)探討了下調lncRNA DLX6-AS1表達后的影響，結果提示lncRNA DLX6-AS1表達降低可通過抑制巨噬細胞M2極化抑制Hep-2細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化。本研究結果初步揭示了lncRNA DLX6-AS1對喉癌Hep-2細胞惡性發(fā)展的影響及其作用機制，提示lncRNA DLX6-AS1在喉癌發(fā)展過程中發(fā)揮了明顯的促癌作用。

在后續(xù)的研究中我們發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-AS1可以與miR-144相互作用。miR-144已在多項研究中被證實參與了調控巨噬細胞極化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如miR-144可通過減輕M1型巨噬細胞相關炎癥來阻止實驗性腹主動脈瘤的形成[20]；miR-144可通過調控PBX3抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲[21]；此外，miR-144可通過下調激活增強因子結合蛋白4抑制胃癌細胞增殖和侵襲[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-144在喉癌患者分離出的TAMs中表達上調，且過表達lncRNA DLX6-AS1可通過miR-144促進IL-4誘導的THP-1巨噬細胞M2極化，并增強Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化能力，這表明miR-144在lncRNA DLX6-AS1調節(jié)M2極化和Hep-2細胞增殖、侵襲及上皮間質轉化過程中扮演了非常重要的角色。

綜上所述，lncRNA DLX6-AS1可通過調控miR-144表達來促進M2型巨噬細胞的激活，而M2型巨噬細胞激活后可促進Hep-2細胞的增殖、侵襲和上皮間質轉化。這些結果表明，lncRNA DLX6-AS1通過誘導喉癌巨噬細胞M2極化，在喉癌細胞發(fā)展進程中發(fā)揮了重要作用。