呂紅娟,張璇,李立恒,孟媛媛,趙亭亭 （河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，河北 張家口 075000）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是來源于上皮組織的惡性腫瘤，其生長速度緩慢，可發(fā)生于口腔不同部位，部分患者會出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的潰瘍和腫塊，伴有感染及疼痛等并發(fā)癥[1-2]。由于部分患者身體狀況差不能耐受手術(shù)，或經(jīng)濟條件不允許使用比較先進的治療手段，因此，建立相應(yīng)的體外模型，篩選有效的治療藥物具有重要臨床意義[3-5]。大豆苷元來源于豆科植物的種子，其主要成分為大豆異黃酮類，是一種已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床各類疾病治療的藥物成分[6-7]。有研究顯示，大豆苷元具有良好的心血管保護作用和抗腫瘤活性，已在前列腺癌、乳腺癌治療等方面取得了較好療效，其抗腫瘤作用已得到臨床認可，為臨床腫瘤治療提供了新的研究方向[8-10]。因此，大豆苷元作為治療口腔鱗狀細胞癌的潛在藥物，有望為無法進行手術(shù)的患者帶來新的希望，但目前有關(guān)大豆苷元抗口腔鱗狀細胞癌的研究報道較少，其發(fā)揮抗口腔鱗狀細胞癌的作用機制也尚未闡明。因此，本研究分析了大豆苷元抗口腔鱗狀細胞癌的作用機制，旨在為臨床綜合治療提供新的方向，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與實驗動物

CO2培養(yǎng)箱、全自動酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；人口腔鱗狀細胞癌CAL-27和Tca8113細胞均購自上海谷研實業(yè)有限公司；大豆苷元購自上海韻泰信息科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS購自武漢益普生物科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購自上海撫生實業(yè)有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體、MMP12單克隆抗體均購自英國Abcam公司。SPF級BALC/c裸鼠18只，雌雄各半，5~7周齡，體質(zhì)量約20 g，由河北省實驗動物中心提供，許可證號：生產(chǎn)許可SCXK（冀）2018-004。

1.2 大豆苷元靶向MMP12分析

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析大豆苷元靶點及其與口腔鱗狀細胞癌臨床表型的相關(guān)性。利用SwissTarget（取Top18）和TargetNet(取pro>0)預(yù)測大豆苷元的靶點，二者取并集，得到115個大豆苷元靶點。利用GEO2R分析口腔鱗狀細胞癌相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE138206和GSE74530中具有表達差異的基因（logFC≥1，P<0.05），三者取交集，選擇表達水平最高的基因進一步研究。

下載TCGA_HNSC數(shù)據(jù)，對口腔鱗狀細胞癌的數(shù)據(jù)進行分析。以MMP12表達水平中位數(shù)進行分組，將口腔鱗狀細胞癌患者分為MMP12高表達組和MMP12低表達組，進行GSEA分析，以探討MMP12表達與細胞增殖、遷移和侵襲的關(guān)系。

1.3 細胞培養(yǎng)、處理與分組

采用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CAL-27和Tca8113細胞，培養(yǎng)條件：37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2，隔天換液。取一部分培養(yǎng)的CAL-27和Tca8113細胞，分別加入不同濃度的大豆苷元（CAL-27細胞中大豆苷元濃度為0~200 μmol/L，濃度梯度為50 μmol/L；Tca8113細胞中大豆苷元濃度為0~240 μmol/L，濃度梯度為60 μmol/L），置于37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察不同濃度大豆苷元對CAL-27和Tca8113細胞生長的影響。隨后，將CAL-27和Tca8113細胞分為對照組（CAL-27和Tca8113細胞均予以等量生理鹽水）、大豆苷元組（CAL-27細胞中添加大豆苷元150 μmol/L，Tca8113細胞中添加大豆苷元180 μmol/L）以及大豆苷元+MMP12組（MMP12過表達CAL-27細胞中添加大豆苷元150 μmol/L，MMP12過表達Tca8113細胞中添加大豆苷元180 μmol/L）進行后續(xù)實驗。將攜帶MMP12編碼序列的CAL-27質(zhì)粒、Tca8113質(zhì)粒和空白質(zhì)粒通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染24 h，向細胞中加入10 μg/mL G418進行篩選，以沒有轉(zhuǎn)染的MMP12細胞為參照，維持篩選2周，通過Western blot檢測驗證過表達是否成功。取過表達成功的CAL-27和Tca8113細胞置于37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4 MTT實驗檢測細胞存活率

取各組對數(shù)生長期的CAL-27和Tca8113細胞制備成細胞懸液（2×104/mL），接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL，與相應(yīng)濃度的大豆苷元進行孵育，置于37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測450 nm波長處各孔的吸光度值。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖情況

取各組對數(shù)生長期的CAL-27和Tca8113細胞（2×103/mL）接種于96孔培養(yǎng)板中，與相應(yīng)濃度的大豆苷元進行孵育，于37 ℃、pH 7.0~7.2、5%CO2培養(yǎng)箱中進行預(yù)培養(yǎng)，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測450 nm波長處各孔的吸光度值。連續(xù)培養(yǎng)5 d后，繪制細胞增殖曲線。

1.6 克隆形成實驗檢測細胞生長情況

將各組對數(shù)生長期CAL-27和Tca8113細胞（2×103/mL）接種于96孔培養(yǎng)板中，與相應(yīng)濃度的大豆苷元進行孵育，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待約90%單個克隆細胞數(shù)達50個后，采用多聚甲醛（質(zhì)量分數(shù)4%）室溫固定10 min，1%結(jié)晶紫染色5 min，顯微鏡下觀察每孔內(nèi)細胞克隆數(shù)目，計算克隆細胞數(shù)。

1.7 Transwell檢測細胞侵襲和遷移

收集各組CAL-27和Tca8113細胞，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至5×105/mL，于上室（無Matrigel基質(zhì)膠）中添加100 μL，下室加入500 μL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，24 h后以無菌棉簽去除多余細胞，質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡觀察并記錄遷移的細胞數(shù)。檢測細胞侵襲能力時，采用100 μL Matrigel基質(zhì)膠與500 μL無血清培養(yǎng)基充分混合，吸取50 μL于上室恒溫37 ℃靜置4 h，其余步驟同上。

1.8 裸鼠移植瘤實驗

SPF條件下，裸鼠皮下注射人口腔鱗狀細胞癌CAL-27細胞株（8×106/mL）0.2 mL構(gòu)建人口腔鱗狀細胞癌裸鼠皮下移植瘤模型，移植瘤在接種60 d內(nèi)體積達800 mm3并進行傳代視為建模成功。根據(jù)是否注射大豆苷元進行分組，daidzein組（n=9）每隔1 d注射大豆苷元1次，每次100 mg/kg，control組（n=9）注射等量生理鹽水，接種后每隔2 d觀察移植瘤體積，共觀察14 d。然后處死全部裸鼠，小心剝離腫瘤并稱重。用卡尺測量瘤體長短徑，計算瘤體體積，瘤體體積=長×寬2/2。

1.9 免疫組化法檢測移植瘤組織中Ki67蛋白表達

取daidzein組和control組裸鼠移植瘤組織，常規(guī)固定，制作切片，采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物試劑盒檢測移植瘤組織中Ki67蛋白表達。對移植瘤組織進行免疫組化染色，然后將載玻片沖洗、脫水，顯微鏡下觀察并計數(shù)由黃色變?yōu)樽厣拿庖叻磻?yīng)細胞，每張切片觀察10個視野，統(tǒng)計Ki67染色呈陽性的細胞數(shù)量，計算陽性細胞率。陽性細胞率(%)=陽性細胞數(shù)目/總細胞計數(shù)×100%。

1.10 Western blot檢測MMP12蛋白表達

收集各組細胞，棄培養(yǎng)液，采用細胞裂解液裂解，提取總蛋白，嚴格按照操作說明進行。采用BCA法進行蛋白定量，取50 ng蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，采用洗膜緩沖液洗膜并加MMP12一抗(1:1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜加二抗(1:10 000)，室溫孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光顯影，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析對比條帶強弱，選用β-actin作為內(nèi)參。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以均數(shù)±標準差()表示，重復(fù)測量方差分析不同時間對照組、大豆苷元組和大豆苷元組+MMP12組細胞活性和MMP12表達間的差異；Mann-Whitney檢驗比較daidzein組和control組克隆細胞數(shù)、Ki67蛋白表達的差異；采用單因素方差分析比較對照組、大豆苷元組和大豆苷元+MMP12組的MMP12表達水平、細胞活性、克隆細胞數(shù)、遷移和侵襲間的差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP12與口腔鱗狀細胞癌臨床病理特征的關(guān)系

GEO2R分析顯示，MMP12在口腔鱗狀細胞癌中表達（P<0.05），且MMP12表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。GSEA分析表明，與細胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的基因集均富集在MMP12高表達組，即MMP12可能促進口腔鱗狀細胞癌的增殖、遷移和侵襲，見圖1。

圖1 MMP12與口腔鱗狀細胞癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2 大豆苷元體外抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲和遷移

MTT實驗顯示，大豆苷元濃度越高，CAL-27和Tca8113細胞存活率越低（P<0.05），當(dāng)CAL-27和Tca8113細胞中大豆苷元濃度分別為150 μmol/L和180 μmol/L時，細胞存活率降低至約50%。CCK-8實驗結(jié)果顯示，隨著大豆苷元作用時間的延長，CAL-27和Tca8113的細胞活性較對照組明顯下降（P<0.05）?？寺⌒纬蓪嶒烇@示，大豆苷元作用后，CAL-27和Tca8113克隆細胞數(shù)較對照組明顯減少（P<0.05）。Transwell實驗顯示，大豆苷元組發(fā)生侵襲和遷移的CAL-27和Tca8113細胞數(shù)較對照組明顯減少（P<0.05），見圖2。

圖2 大豆苷元體外抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲和遷移

2.3 大豆苷元體內(nèi)抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖

裸鼠移植瘤實驗顯示，隨著時間延長，daidzein組和control組腫瘤體積均明顯增加（P<0.05），但daidzein組的腫瘤體積和質(zhì)量均明顯小于control組（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，daidzein組的移植瘤組織中Ki67蛋白表達水平明顯低于control組（P<0.05），見圖3。

圖3 大豆苷元體內(nèi)抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖

2.4 大豆苷元抑制MMP12表達的濃度依賴和時間依賴

Western blot顯示，大豆苷元能夠抑制CAL-27和Tca8113細胞中MMP12的表達，且隨著作用時間延長和濃度升高，該抑制作用會更明顯（P<0.05），見圖4。

圖4 大豆苷元抑制MMP12表達的濃度依賴和時間依賴

2.5 大豆苷元通過MMP12抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲

與對照組相比，大豆苷元組CAL-27和Tca8113細胞中MMP12蛋白表達水平、細胞活性、克隆細胞數(shù)、細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均明顯降低/減少（P<0.05）；與大豆苷元組比較，大豆苷元+MMP12組中MMP12表達水平、細胞活性、克隆細胞數(shù)、細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)明顯升高/增加（P<0.05），見圖5。

圖5 大豆苷元通過MMP12抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是頭頸部惡性程度極高、危害性極大的腫瘤?？谇击[狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展與患者生活方式密切相關(guān)，并容易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，對患者生活質(zhì)量甚至生命安全有巨大影響[11-13]。CAL-27和Tca8113細胞株傳代數(shù)較多且容易培養(yǎng)，是基礎(chǔ)研究常用的細胞株，本研究以CAL-27和Tca8113細胞株為研究對象，分析大豆苷元抗口腔鱗狀細胞癌的作用機制。

大豆苷元具有良好的抗腫瘤活性，可以抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡，提高機體免疫力[14]。為了闡明大豆苷元的可能作用機制，本研究通過數(shù)據(jù)庫對大豆苷元的可能作用靶點進行初步分析，結(jié)果顯示MMP12為大豆苷元靶點之一，并且其表達水平與口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)，提示大豆苷元可能通過靶向MMP12抑制腫瘤的生長、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，隨著大豆苷元濃度升高，作用時間延長，口腔鱗狀細胞癌細胞存活率明顯降低，細胞克隆數(shù)、侵襲和遷移數(shù)也明顯減少，說明大豆苷元可以有效抑制口腔鱗狀細胞癌增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為，并且該抑制效果與大豆苷元的作用時間和濃度有關(guān)。研究表明，大豆苷元的抗腫瘤作用機制主要體現(xiàn)在抑制腫瘤增殖，其通過抑制血管增生并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤生長；同時，大豆苷元可以激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ，從而抑制腫瘤細胞遷移[15-16]。本研究結(jié)果與上述研究基本一致，說明大豆苷元在抑制口腔鱗狀細胞癌惡性增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲方面具有良好作用。

Ki67是一種與細胞增殖有關(guān)的蛋白，可反映腫瘤生長情況，其陽性表達率還可以用來判斷腫瘤的侵襲情況，陽性表達率越高說明腫瘤的惡性程度越強[17-18]。本研究中裸鼠移植瘤實驗結(jié)果顯示，daidzein組的移植瘤體積、質(zhì)量以及移植瘤組織中Ki67蛋白表達水平均明顯小/低于control組，說明大豆苷元干預(yù)后Ki67蛋白表達水平明顯下降，提示大豆苷元在抑制口腔鱗狀細胞癌惡性增殖方面具有一定作用，且這種作用并不僅局限于體外培養(yǎng)細胞，在動物實驗中也初見成效，進一步推動了大豆苷元的臨床應(yīng)用進程。

MMP12主要由炎癥細胞主動分泌，具有分解細胞外基質(zhì)和血管壁的作用，因而利于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移與侵襲，其在正常細胞中少量表達甚至不表達，而在多種腫瘤細胞中高表達[19]。本研究初步明確了大豆苷元對口腔鱗狀細胞癌惡性增殖、遷移和侵襲等行為具有抑制作用后，進一步探討了其對作用靶點MMP12的影響，結(jié)果顯示，隨著大豆苷元作用時間延長或濃度升高，口腔鱗狀細胞癌中MMP12的表達水平明顯下降，說明大豆苷元對MMP12的抑制作用具有時間依賴性和濃度依賴性；當(dāng)MMP12過表達時，大豆苷元的抗腫瘤活性被逆轉(zhuǎn)，說明大豆苷元是通過作用于MMP12靶點，下調(diào)MMP12表達水平，從而發(fā)揮對口腔鱗狀細胞癌惡性增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的抑制作用，提示臨床可以通過抑制MMP12表達發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。

綜上所述，大豆苷元可能通過靶向MMP12，下調(diào)口腔鱗狀細胞癌細胞中MMP12的表達水平，從而抑制腫瘤細胞的增殖，阻止其轉(zhuǎn)移與侵襲，進而發(fā)揮抗口腔鱗狀細胞癌的作用。